用于改善細(xì)胞鑒定的方法
【專利說明】用于改善細(xì)胞鑒定的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請?jiān)O(shè)及免疫組織化學(xué)W及基于計(jì)算機(jī)的圖像分析領(lǐng)域。具體地，本申請?zhí)峁?一種從組織學(xué)組織樣品中提取信息并且利用該信息進(jìn)行基于計(jì)算機(jī)的圖像分析的方法。更 具體地，本申請?zhí)峁┮环N顯現(xiàn)微觀多細(xì)胞組織樣品中的多種細(xì)胞類型的方法。本申請還提 供一種用于實(shí)施所述方法的部件的試劑盒。
[0002] 發(fā)巧背景
[0003] 組織性組織樣品的分析通常用于診斷目的，例如，分析乳腺組織樣品來診斷乳腺 癌，或用于研究目的，例如，研究炎性病癥（如哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化或炎性腸?。┲械难仔约?xì) 胞類型。
[0004] 免疫組織化學(xué)（1肥)，其中通過抗原特異性抗體檢測標(biāo)記分子（即，抗原，典型地 為蛋白），其常用于鑒定組織學(xué)切片中的細(xì)胞。對于一些細(xì)胞類型，可W通過檢測單個(gè)細(xì)胞 特異性抗原獲得鑒定。然而，組織細(xì)胞的免疫組織化學(xué)鑒定領(lǐng)域的顯著問題是許多細(xì)胞不 能僅通過一種標(biāo)記分子鑒定的事實(shí)。用于一種細(xì)胞類型的候選鑒定標(biāo)記也可W存在于一些 其他細(xì)胞類型上，并且妨礙了正確的鑒定。因此，找到鑒定并且排除混雜細(xì)胞類型的方法對 于沒有細(xì)胞特異性標(biāo)記可用的細(xì)胞類型的可靠的鑒定是至關(guān)重要的。理想地，正確鑒定后， 可能需要用顯現(xiàn)活化標(biāo)記的另外的IHC染色來研究所鑒定的細(xì)胞的激活狀態(tài)或通過原位 雜交技術(shù)來顯現(xiàn)基因表達(dá)。
[0005] 任何患病的組織都典型地與改變的細(xì)胞群體的組成相關(guān)。例如，在哮喘的發(fā)炎的 呼吸道中，存在構(gòu)成呼吸道的結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如上皮細(xì)胞、腺細(xì)胞、血管細(xì)胞、神經(jīng)等）的改變的 組成。另外，一些類型的免疫細(xì)胞（即，白細(xì)胞）浸潤發(fā)炎的呼吸道。事實(shí)上，在多種疾病 中，組織的病理學(xué)（即，破壞性）改變不是僅被一種細(xì)胞類型引起的，而是幾種細(xì)胞類型之 間的復(fù)雜的相互作用。因此，當(dāng)研究患病組織樣品時(shí)，通常需要同時(shí)顯現(xiàn)幾種細(xì)胞群體和組 織結(jié)構(gòu)，或顯現(xiàn)細(xì)胞群體與非細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如侵入的病毒或細(xì)胞外基質(zhì)成分。
[0006] 關(guān)于組織中細(xì)胞內(nèi)容物的信息可W通過當(dāng)時(shí)染色連續(xù)切割的切片中的一種細(xì)胞 類型而獲得。盡管該種方法提供組織樣品中的幾種細(xì)胞類型的內(nèi)容物的良好的估測，但是 其沒能提供關(guān)于所分析的細(xì)胞類型之間的空間關(guān)系（目P，物理關(guān)系）的詳細(xì)信息。由于細(xì) 胞之間的大部分交叉感知需要緊密的物理接觸，有時(shí)是直接的物理接觸，所W該是主要的 缺點(diǎn)。因此，可能需要顯現(xiàn)同一張切片內(nèi)的幾種細(xì)胞群體。
[0007] 利用目前可用的IHC技術(shù)，使用復(fù)合色素原或復(fù)合免疫巧光技術(shù)可W染色一張切 片中的至多3種細(xì)胞類型。然而，在常規(guī)的實(shí)踐中，由于缺少一級檢測抗體的適當(dāng)?shù)慕M合， 通常僅可W同時(shí)檢測2種細(xì)胞類型。
[000引為了增加可W在一張組織切片中顯現(xiàn)的標(biāo)記的數(shù)目，已經(jīng)開發(fā)了新的方法學(xué) 方法，如WO 2010/115089中公開的SIMPLE技術(shù)，和MELC技術(shù)（Schubert等，化Uire Biotechnology (自然生物技術(shù)）V. 24, PP. 1270-1278)。盡管有效力，但是該些新型技術(shù)主 要開發(fā)用來共定位研究，并目每種都包括組織破壞性步驟、設(shè)及破壞檢測基團(tuán)的步驟或依 賴于檢測分子標(biāo)記的一級抗體。后一種限制排除了通過使用二級抗體對染色靈敏性的常規(guī) 放大，使得該些方法對于檢測常規(guī)組織學(xué)切片中的多種常規(guī)的細(xì)胞標(biāo)記過于不靈敏。此外， 由于上文提及的技術(shù)主要開發(fā)用于共定位研究，它們與其他常規(guī)免疫組織化學(xué)流程相似沒 能解決非目標(biāo)細(xì)胞類型上偶然也可能存在多種鑒定標(biāo)記的問題。
[0009] 正確檢測沒有針對其的單一特異性標(biāo)記的細(xì)胞類型的一種方法是通過現(xiàn)有的IHC 檢測和檢測色素原的包封來排除混雜細(xì)胞類型。在Andersson等，化orax 2009;vol.64， pp. 297-305中，在線補(bǔ)充數(shù)據(jù)公開了一種方法，其中通過兩步法分離了黏膜肥大細(xì)胞（MCi， 對類膜蛋白酶是陽性的）和結(jié)締組織肥大細(xì)胞（MCtc，對糜蛋白酶和類膜蛋白酶是陽性的）， 其中第一 1肥步驟通過棟色色素原DAB檢測糜蛋白酶，而第二步驟通過紅色色素原新品紅 檢測余下的糜蛋白酶-陰性MCt細(xì)胞。盡管可用于檢測組織切片中的MCt和MCTc群體，主 要的缺點(diǎn)是由于其不透明的染色和由檢測色素原引起的空間位阻，色素原包封的細(xì)胞都不 能被進(jìn)一步研究。因此，需要一種改善的且靈活的允許顯現(xiàn)樣品中的多種細(xì)胞標(biāo)記的顯現(xiàn) 方法。具體地，需要非組織破壞性顯現(xiàn)方法，所述方法使得其能夠在最初的顯現(xiàn)之后的后續(xù) 步驟中進(jìn)一步檢測特定樣品的感興趣的細(xì)胞類型的細(xì)胞標(biāo)記。
[0010] 發(fā)巧概巧
[0011] 依據(jù)本發(fā)明，通過提供顯現(xiàn)包含至少一種特定細(xì)胞類型的細(xì)胞W及至少一種混雜 細(xì)胞類型的細(xì)胞的微觀多細(xì)胞組織樣品中的多種細(xì)胞類型的方法，上述問題得W解決，在 所述方法中，所述至少一種特定細(xì)胞類型的細(xì)胞和所述至少一種混雜細(xì)胞類型的細(xì)胞二者 都包含第二細(xì)胞標(biāo)記，并且所述至少一種混雜細(xì)胞類型的細(xì)胞還包含所述至少一種特定細(xì) 胞類型的細(xì)胞中不存在的第一細(xì)胞標(biāo)記，所述方法包括下述步驟：
[0012] 將所述樣品的細(xì)胞暴露于第一分子檢測工具，所述第一分子檢測工具特異性結(jié)合 所述第一細(xì)胞標(biāo)記并且具有檢測酶；
[0013] 通過由所述第一分子檢測工具上的所述檢測酶催化的反應(yīng)在具有所述第一細(xì)胞 標(biāo)記的混雜細(xì)胞內(nèi)或周圍產(chǎn)生封閉聚合物化locking polymer);
[0014] 將所述樣品的細(xì)胞暴露于包含巧光染料的第二分子檢測工具，所述第二分子檢測 工具特異性結(jié)合所述第二細(xì)胞標(biāo)記；
[0015] 去除未與所述樣品的細(xì)胞結(jié)合的第二分子檢測工具；并且
[0016] 在所述方法的過程中，通過檢測由所述第二分子檢測工具的巧光染料得到的巧光 信號并且通過檢測在所述至少一種混雜細(xì)胞類型周圍形成的封閉聚合物來顯現(xiàn)所述至少 一種特定細(xì)胞類型和所述至少一種混雜細(xì)胞類型。
[0017] 發(fā)巧詳巧
[0018] 本發(fā)明提供一種顯現(xiàn)方法，鑒于目前的需要和技術(shù)限制，所述方法提供可能患病 的組織中的細(xì)胞群體的顯著改善的信息。因此，本發(fā)明提供一種新型方法學(xué)方法，其中感興 趣的細(xì)胞群體；1)得到正確的鑒定；2)隨后被染色，例如，針對活化標(biāo)記被染色；和3)在同 一張組織切片中與其他細(xì)胞群體和非細(xì)胞結(jié)構(gòu)一起顯現(xiàn)。理想地，除了該些標(biāo)準(zhǔn)，任意此類 技術(shù)應(yīng)該能夠分析完整的樣品大切片并且提供關(guān)于所有標(biāo)記的個(gè)體細(xì)胞的信息，如其在組 織中的空間坐標(biāo)、其尺寸和形狀參數(shù)等。
[0019] 因此，在第一方面，并且在其最廣泛意義上，本發(fā)明提供一種顯現(xiàn)包含至少一種特 定細(xì)胞類型的細(xì)胞W及至少一種混雜細(xì)胞類型的細(xì)胞的微觀多細(xì)胞組織樣品中的多種細(xì) 胞類型的方法，其中所述至少一種特定細(xì)胞類型的細(xì)胞和所述至少一種混雜細(xì)胞類型的細(xì) 胞二者都包含第二細(xì)胞標(biāo)記，并且所述混雜細(xì)胞類型的細(xì)胞還包含所述至少一種特定細(xì)胞 類型的細(xì)胞中不存在的第一細(xì)胞標(biāo)記，所述方法包括下述步驟：
[0020] 將所述樣品的細(xì)胞暴露于第一分子檢測工具，其特異性結(jié)合所述第一細(xì)胞標(biāo)記并 且具有檢測酶；
[0021] 通過由所述第一分子檢測工具上的檢測酶催化的反應(yīng)在具有所述第一細(xì)胞標(biāo)記 的混雜細(xì)胞內(nèi)或周圍產(chǎn)生封閉聚合物；
[0022] 將所述樣品的細(xì)胞暴露于包含巧光染料的第二分子檢測工具，所述第二分子檢測 工具特異性結(jié)合所述第二細(xì)胞標(biāo)記；
[0023] 去除未與所述樣品的細(xì)胞結(jié)合的第二分子檢測工具；并且
[0024] 在所述方法的過程中，通過檢測由所述第二分子檢測工具的巧光染料得到的巧光 信號并且通過檢測在所述至少一種混雜細(xì)胞類型周圍形成的封閉聚合物來顯現(xiàn)所述至少 一種特定細(xì)胞類型和所述至少一種混雜細(xì)胞類型。
[0025] 如本文公開的，術(shù)語"分子檢測工具（means)"設(shè)及雙功能聚集物或綴合物，其包含 能夠特異性結(jié)合特定細(xì)胞標(biāo)記的第一部分和能夠產(chǎn)生可檢測的響應(yīng)的第二部分。多種不同 類型的分子檢測工具可W用于本發(fā)明，例如，適用于免疫組織化學(xué)、原位雜交和酶組織化學(xué) 方法中的此類分子檢測工具。
[0026] 典型地，所述能夠特異性結(jié)合特定細(xì)胞標(biāo)記的第一部分可W是抗體或其片段，或 核酸分子，如DNA分子或RNA分子，或核酸衍生物，如PNA。典型地，所述能夠產(chǎn)生可檢測的 響應(yīng)的第二部分可W是能夠催化封閉聚合物形成的酶，或當(dāng)由適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光誘導(dǎo)時(shí)能夠產(chǎn) 生某種可檢測的巧光信號的化學(xué)化合物，典型地是巧光染料。
[0027] 分子檢測工具在其最簡單的實(shí)施方案中可W包括已經(jīng)與第二部分結(jié)合的第一部 分，所述第一部分如抗體或核酸分子，所述第二部分如酶或巧光染料。備選地，適當(dāng)?shù)姆肿?檢測工具可W是包含第一實(shí)體、與第一實(shí)體特異性結(jié)合的第二實(shí)體和與第二實(shí)體結(jié)合的第 =實(shí)體的復(fù)合物，所述第一實(shí)體典型地是特異性結(jié)合特定細(xì)胞標(biāo)記的單克隆或多克隆抗 體，所述第二實(shí)體典型地是特異性結(jié)合第一實(shí)體的單克隆或多克隆抗體，其中所述第=實(shí) 體是能夠催化封閉聚合物形成的酶，或是在由適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光誘導(dǎo)時(shí)能夠產(chǎn)生某種可檢測的 巧光信號的化學(xué)化合物，典型地是巧光染料。
[002引如本文公開的，"化學(xué)固定"設(shè)及用于使分子檢測工具與樣品共價(jià)結(jié)合的方式，所 述分子檢測工具與所述樣品特異性結(jié)合，W防止所述分子檢測工具被沖洗掉。典型地，交聯(lián) 分子與樣品和分子檢測工具相互作用。技術(shù)人員熟知適當(dāng)?shù)慕宦?lián)分子和方法。
[0029] 如本文公開的，術(shù)語"顯現(xiàn)"設(shè)及產(chǎn)生至少一幅樣品圖像的方法，在所述圖像中，清 楚可見封閉聚合物和其他色素原聚合物W及巧光信號。典型地，顯現(xiàn)W兩步進(jìn)行；首先產(chǎn)生 染色的色素原的明亮視野顯微鏡圖像。優(yōu)選地，所述圖像是數(shù)字照片。其次，通過免疫巧光 顯微鏡顯現(xiàn)每種檢測巧光染料，其中圖像是使用波長特異性濾波器捕獲的。此外，此處所獲 得的圖像優(yōu)選是數(shù)字圖像，但不限于此。對于每種標(biāo)記，分析的區(qū)域可W通過經(jīng)由圖像的數(shù) 字壓合（digital stitching)組合來自相鄰的或重疊的組織的圖像而增強(qiáng)。技術(shù)人員知曉 此類技術(shù)。在一