一種動脈粥樣硬化抑制劑篩選方法的建立的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,具體設(shè)及一種動脈粥樣硬化抑制劑的篩選方法。一種 血清淀粉樣P蛋白(serum amyloid P component, SAP)及高密度脂蛋白(皿L),建立SAP 與皿L結(jié)合的Elisa方法,并用此方法在FDA化合物庫中篩選出了能夠抑制SAP與皿L結(jié) 合的小分子化合物化t-3(Benserazide hy化ochloride-3)。
【背景技術(shù)】
[0002] 屯、血管疾病目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大殺手,而動脈粥樣硬化 (atherosclerosis, A巧是眾多屯、血管疾病中的一種,同時也是很多其他屯、腦血管疾病的病 理基礎(chǔ),它能引發(fā)血栓,屯、肌梗死,冠屯、病等,因此防治動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展已成為當(dāng) 前研究的熱點。迄今為止,尚沒有有效的抗動脈粥樣硬化藥物。因此對動脈粥樣硬化機制 的深入研究及基于機制的抗動脈粥樣硬化藥物的開發(fā)對人類屯、血管健康具有重大意義。
[0003] 動脈粥樣硬化的發(fā)生是基于多種因素的共同作用,而在眾多因素中,血漿高密度 脂蛋白膽固醇(皿kC)是其中非常重要的一種。如何提高皿kC水平,直接影響到動脈粥 樣硬化的防治效果。但皿L是一個大分子量的蛋白質(zhì),直接作為藥物干預(yù)治療,其靜脈注射 量很大,長期大量注射很難實現(xiàn),所W還沒有被廣泛應(yīng)用,因此提高內(nèi)源性皿L是防治As方 法中更有前途的方法。
[0004] 血清淀粉樣P蛋白(serum amyloid P component, SAP),主要由肝細胞合成。在 炎癥刺激物的誘導(dǎo)下,比如脂多糖LPS、白介素IL-1、IL-6等,SAP的濃度會顯著性升高,從 幾倍到幾百倍不等,提示SAP與屯、血管事件的潛在聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)臨床動脈粥樣硬化患者 的粥樣斑塊中有SAP,而且與AS的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),證明了 SAP與AS之間可能存在的聯(lián) 系。
[000引 SAP被報道與皿L結(jié)合,SAP缺失后的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化癥狀減輕,而且 血清皿L濃度有顯著提高。W上研究提示SAP促進動脈粥樣硬化的形成。為此我們設(shè)計并 建立SAP與皿L結(jié)合的Elisa方法,并用此方法在FDA化合物庫中篩選能夠抑制SAP與皿L 結(jié)合的小分子化合物。此研究符合我國藥物現(xiàn)代化的發(fā)展方向,在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研 究領(lǐng)域內(nèi)具有重要的社會意義和潛在的經(jīng)濟效益。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 采用實驗室制備的SAP,進行生物素標(biāo)記,獲得SAP-Biotin。設(shè)計并建立SAP 與皿L結(jié)合的Elisa方法,并用此方法在抑A化合物庫中篩選,Hit-3炬enserazide hy化ochloride-3)能夠顯著抑制SAP與皿L結(jié)合,且半數(shù)抑制濃度(IC5。)為4. 8 y M。
[0007] 下面是部分試驗及結(jié)果:
[000引一、建立下列Elisa方法
[0009] W皿L包被ELISA板,4°C過夜,用封閉液封閉,37°C解育2h,加上述方法制備的 SAP-Biotin,37°C解育化后,加AB試劑,37°C解育比,加入TMB顯色液,顯色5?lOmin后 加終止液(2mol H2SO4),酶標(biāo)儀450nm測吸光度。根據(jù)有無皿L包被吸收值的差異,確定方 法的可行性。有無皿L包被吸收值有極顯著性差異,說明Elisa方法建立成功。所有數(shù)據(jù) 統(tǒng)計學(xué)差異采用Student's t-test進行分析。P< 0.01為有極顯著性差異。結(jié)果見表1。
[0010] 表1有無皿L包被吸收值(;± ??)
[0011]
【主權(quán)項】
1. 一種動脈粥樣硬化抑制劑的篩選方法,主要包括以下步驟: 1. SAP制備及生物素連接 2. SAP與HDL結(jié)合Elisa方法的建立 3. FDA化合物庫進行初步篩選 4) 小分子抑制劑的劑量依賴性測定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SAP及生物素連接,其特點在于:實驗室制備SAP Iml (mg/ ml),加 IOmM Sulfo-NHS-Biotin 66 μ 1,室溫反應(yīng)1小時,透析去掉未結(jié)合的生物素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Elisa方法,其特點在于:以100 μ 1/孔HDL(K) μ g/ml)包 被 ELISA 板,4°C 過夜;TBS/Ca/Triton 洗滌 3 次,用封閉液(1.5%BSA in TBS)封閉,37°C 孵育 2h ;TBS/Ca/Triton 洗滌 3 次,加 100 μ I SAP-Biotin,37°C孵育 2h ;TBS/Ca/Triton 洗 滌3次,加100 μ I AB試劑,37°C孵育Ih ;TBS/Ca/Triton洗滌3次,TBS/Ca洗滌3次,加入 100 μ I TMB顯色液,顯色5?IOmin后加50 μ 1終止液(2mol H2S04),酶標(biāo)儀450nm測吸 光度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的初步篩選,其特點在于:篩選出候選化合物 Hit-3 (Benserazide hydrochloride)〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的劑量依賴性測定,其特點在于:加入Hit-3的濃度分別為 0· 1 μ M,1 μ M,3 μ M,10 μ M 及 30 μ M0
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動脈粥樣硬化抑制劑的篩選方法。實驗室通過前期研究得到一種SAP,建立SAP-Biotin與HDL結(jié)合的Elisa方法,發(fā)明通過此方法在FDA化合物庫中篩選出了能夠抑制SAP與HDL結(jié)合的小分子化合物Hit-3(Benserazide hydrochloride-3)。此研究符合我國藥物現(xiàn)代化的發(fā)展方向,在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和應(yīng)用研究領(lǐng)域內(nèi)具有重要的社會意義和潛在的經(jīng)濟效益。
【IPC分類】G01N21-31
【公開號】CN104568798
【申請?zhí)枴緾N201510043758
【發(fā)明人】何書英, 吳杰, 余新超, 耿建國
【申請人】中國藥科大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月26日