專利名稱：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑及其應(yīng)用和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生化技術(shù)及生物化學檢驗技術(shù)。
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶是一種膜結(jié)合糖蛋白，分子量為150000，含鋅，屬二肽羧基酶，能使血管緊張素I(十肽，由腎素轉(zhuǎn)化而成)肽鏈C端的組氨酸和亮氨酸殘基水解，形成具有增壓作用的血管緊張素Ⅱ(八肽)，后者進一步使血管收縮、血壓升高。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶也能使具有降壓作用的舒緩激肽(九肽)脫去肽鏈C末端的苯丙氨酸和精氨酸殘基而滅活。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶還能直接作用于腎上腺皮質(zhì)，促進醛固酮分泌。因此，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)以及緩激肽系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因素，影響人體多種生理機能。
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性最早于1968年被測及，它廣泛分布于全身各組織。心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶升高，尤其是高血壓病在亞臨床階段就已有ACE升高。體外定量測定血清中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的活性，可作為心血管疾病的早期診斷、藥物選擇、療效觀察以及呼吸系統(tǒng)疾病如結(jié)節(jié)病、肺癌和肝膽疾病等的特異診斷指標。迄今，體外測定血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的方法有生物法、比色法、分光光度法、動力學法、放射性同位素法、熒光測定法及高壓液相色譜法等。但其共同的不足是靈敏度低、檢測時間長、所需檢測樣品量較大、不易在醫(yī)療機構(gòu)普及等。
本發(fā)明的目的是提供一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑和使用該檢測試劑檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的方法，使其具有簡便、快速、靈敏、重復性好、所需血樣量和檢測試劑量少、適合于在全自動生化分析儀上應(yīng)用、易于在醫(yī)院推廣等優(yōu)點。
本發(fā)明提供的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑是由呋喃?；?L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG)、堅固黃(Fast Y)、弱酸和除垢劑組成的組合物。其中弱酸可使用硼酸；除垢劑可使用膽酸。
本發(fā)明檢測試劑及檢測方法的原理是反應(yīng)底物呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(2-furanacyloy1-L-phenylalanylglycylglycine，F(xiàn)APGG)在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶作用下水解為呋喃?；勘彼?FAP)和甘氨酰甘氨酸，呋喃?；奖彼?FAP)進一步與顯色物質(zhì)合成染料堅固黃(Fast Y)反應(yīng)生成黃色化合物，該黃色化合物在405nm處吸光度增加率與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性成正比，檢測波長405nm處吸光度的變化，即可得出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性。
在使用硼酸產(chǎn)生弱酸性反應(yīng)環(huán)境，使用膽酸作本發(fā)明檢測試劑之染料顯色反應(yīng)的除垢劑時，本發(fā)明檢測試劑用于檢測時的水溶液濃度(每升檢測試劑溶液中各組分的含量)為呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L堅固黃0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L膽酸 5-2．0mmol／L本發(fā)明提供的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性檢測方法，即將本發(fā)明檢測試劑用于檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性的方法，包括
①將反應(yīng)底物呋喃?；?L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃條件下與待測血清(含血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)反應(yīng)；②在除垢劑存在條件下使呋喃?；?L-苓丙氨酰甘氨酰甘氨酸與特測血清(含血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)的反應(yīng)產(chǎn)物進一步與合成染料堅固黃反應(yīng)，生成黃色化合物；③在波長405nm處檢測該黃色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的變化(△A／分)；④再根據(jù)公式 得出血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性。
其中弱酸性條件可由硼酸生成，除垢劑可使用膽酸。
本發(fā)明采用酶動力學方法測定樣本中酶活性，具有簡便、快速、靈敏、重復性好的優(yōu)點?？朔爽F(xiàn)有技術(shù)靈敏度較差的缺點，其靈敏度高于現(xiàn)有技術(shù)一個數(shù)量級；現(xiàn)有紫外分析方法靈敏度ε為0.5434，而本發(fā)明檢測技術(shù)靈敏度ε為7000；與現(xiàn)有的紫外分析方法比較，其檢測所需時間夫為減少，由原來的30至60分鐘，減為5至10分鐘，可以滿足臨床上簡便快速的需要，且所需血樣量大為減少，紫外分析方法需血樣為0．1ml，而本發(fā)明方法僅需300μl；本發(fā)明技術(shù)適合于在Falcor全自動生化分析儀上應(yīng)用，該儀器在醫(yī)院裝備較廣，故本發(fā)明技術(shù)易于推廣，對高血壓病的旱期診斷、鑒別診斷、藥物選擇、療效觀察具有十分重要的實用價值。同現(xiàn)有同類技術(shù)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶試劑及檢測方法相比，本發(fā)明也是使用PAPGG為底物，然而本發(fā)明血管緊張素轉(zhuǎn)換酶試劑使用了顯色物質(zhì)堅固黃，使監(jiān)測波長由345nm移到405nm，因而可以用普及較廣的生化分析儀(如法國產(chǎn)Falcor全自動生化分析儀)替代傳統(tǒng)方法使用的紫外分析儀進行監(jiān)測，并使血管緊張素轉(zhuǎn)換酶試劑的測定底物減少，避免了儀器本身對底物濃度的限制，使FAPGG濃度能滿足使V接近Vmax；能有效避免FAP在345nm處光密度抵消作用。
實施例1．制備檢測試劑本發(fā)明檢測試劑由反應(yīng)底物--呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸顯色物質(zhì)--堅固黃產(chǎn)生弱酸性反應(yīng)環(huán)境的物質(zhì)--硼酸除垢劑--膽酸組成。
用蒸餾水或去離子水按以下濃度(以每升檢測試劑溶液中各組分的含量表示)配制用于檢測的本發(fā)明試劑溶液呋喃酰基-L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol／L堅固黃1mmol／L硼酸 80mmol／L膽酸 8mmol／L本發(fā)明檢測試劑復溶后2-8℃可穩(wěn)定-周，室溫下穩(wěn)定24小時。
2．檢測操作取待測血清30μl，加入上述檢測試劑溶液300μl，在37℃條件下作用1分鐘，在法國產(chǎn)Falcor全自動生化分析儀上405nm處連續(xù)記錄吸光度的變化(ΔA／分)，(反應(yīng)時間3分鐘)。
3．計算及正常值根據(jù)公式即可得出所測結(jié)采[ACE(U/L)] 式中TV=反應(yīng)總體積SV=樣本體積
ε=FAPGG微摩爾吸光系數(shù)d=光徑(cm)線性范圍0-300U/L正常值8-52U／L；超出上限為異常。
精密度批內(nèi)CV＜1．2％；批間CV＜3．4％根據(jù)本實驗室條件，可選用手工測定或全自動生化分析儀，修改實驗參數(shù)使試劑∶樣本=9∶1；溶血、黃疸對實驗結(jié)果有影響。
權(quán)利要求
1．一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，是由呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、堅固黃、弱酸和除垢劑組成的組合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，其特征在于所說的弱酸為硼酸。
3．根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，其特征在于所說的除垢劑為膽酸。
4．一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，它是含有權(quán)利要求1至3中任一項所述物質(zhì)的溶液。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，在權(quán)利要求2和3限定下該檢測試劑溶液中各組分的濃度(每升檢測試劑溶液中各組分含量)為呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．0-5．0mmol／L堅固黃0．5-2．0mmol／L硼酸 50-200mmol／L膽酸 5-20mmol／L
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑，其特征在于各組分的濃度(每升檢測試劑溶液中各組分含量)為呋喃?；?L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸1．5mmol堅固黃 1mmol硼酸80mmol膽酸8mmol
7．權(quán)利要求1至6中任一項所限定的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑用于檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性。
8．一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性檢測方法，包括將反應(yīng)底物呋喃?；?L-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸在弱酸性和37℃條件下與待測血清(含血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)反應(yīng)，其特征在于在除垢劑存在條件下使呋喃?；?L-笨丙氨酰甘氨酰甘氨酸與待測血清(含血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)的反應(yīng)產(chǎn)物進一步與合成染料堅固黃反應(yīng)，生成黃色化合物，在波長405nm處檢測該黃色反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的變化(ΔA／分)；再根據(jù)公式ACE 計算血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性。
9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性檢測方法，其特征在于所說的除垢劑為膽酸。
10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性檢測方法，其特征在于所說的弱酸性條件由硼酸生成。
全文摘要
本發(fā)明提供的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶檢測試劑,是由堅固黃、呋喃?；璍－苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸、弱酸和除垢劑組成的組合物,弱酸和除垢劑可分別由硼酸、膽酸構(gòu)成;本發(fā)明采用酶動力學方法測定樣本中酶活性,具有簡便、快速、靈敏、重復性好、所需血樣量少等優(yōu)點,其靈敏度高于現(xiàn)有技術(shù)一個數(shù)量級,檢測時間5至10分鐘,可以滿足臨床上簡便快速的需要,且適合于在Falcor全自動生化分析儀上應(yīng)用。
文檔編號G01N33/50GK1282793SQ99116569
公開日2001年2月7日 申請日期1999年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月28日
發(fā)明者艾學蛟, 鄒光楣 申請人:武漢?？爽斏锛夹g(shù)有限公司