專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)量人體生長(zhǎng)激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定外部施用的人體生長(zhǎng)激素在受檢驗(yàn)者的血液或尿中的濃度的方法；以及確認(rèn)人體生長(zhǎng)激素的外部施用的方法。
更具體地說(shuō)，上述方法包含的步驟有(a)對(duì)在外部施用至少一種人體生長(zhǎng)激素的受檢驗(yàn)者的血液或尿中的2種人體生長(zhǎng)激素的各自濃度進(jìn)行測(cè)量，(b)計(jì)算它們的比率，以及(c)測(cè)定外部施用的人體生長(zhǎng)激素的濃度或者確認(rèn)外部施用。這些方法還可以包含的步驟有(ⅰ)對(duì)在沒(méi)有施用人體生長(zhǎng)激素的正常狀態(tài)受檢驗(yàn)者的血液或尿中兩種類(lèi)型的人體生長(zhǎng)激素的各自濃度進(jìn)行測(cè)量。
(ⅱ)計(jì)算在步驟(ⅰ)中所測(cè)量的它們的濃度之和以及人體生長(zhǎng)激素中的某一種或每一種的濃度對(duì)于經(jīng)此得到的總濃度的比率，(ⅲ)在至少施用一種人體生長(zhǎng)激素之后或者在懷疑施用了人體生長(zhǎng)激素時(shí)，對(duì)受檢驗(yàn)者的血液或尿中的兩種類(lèi)型人體生長(zhǎng)激素的每種濃度進(jìn)行測(cè)量，(ⅳ)計(jì)算在步驟(ⅲ)中所測(cè)量的它們的濃度之和以及人體生長(zhǎng)激素中的某一種或每一種的濃度對(duì)經(jīng)此得到的總濃度的比率，(ⅴ)通過(guò)比較在步驟(ⅱ)中得到的比率和在步驟(ⅳ)中得到的比率，測(cè)定外部施用的人體生長(zhǎng)激素的濃度或者確認(rèn)外部施用。
據(jù)知有兩種人體生長(zhǎng)激素(縮寫(xiě)hGH)，它們是通過(guò)根據(jù)相同基因可變剪接生成的，其中一種具有的分子量約22000(縮寫(xiě)為22K hGH)，另一種具有的分子量約20000(縮寫(xiě)為20KhGH)。22KhGH是一種包含191個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。還已知這種22KhGH占血液中hGH總量的約90％。另一方面，20KhGH是包含176個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。在血液中出現(xiàn)的20KhGH與22KhGH相比數(shù)量較少，據(jù)推算約占血液中hGH總量的10％。20KhGH和22KhGH都是由原本相同的基因編碼的蛋白質(zhì)。因此，兩種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)即它們的氨基酸序列是十分相似的。它們之間的差別僅在于，20K hGH的結(jié)構(gòu)中缺失了15個(gè)氨基酸殘基，它們對(duì)應(yīng)于距離22KhGH中的N末端的第32到第46位氨基酸殘基。
通過(guò)利用重組DNA技術(shù)，已大量地制取22K hGH十年以上，并已得到其特異性抗體。這就導(dǎo)致特異性針對(duì)22K hGH的免疫化學(xué)測(cè)定方法的發(fā)展。另一方面，難于利用重組DNA技術(shù)來(lái)表達(dá)20K hGH，因此不可能得到具有與天然類(lèi)型的20K hGH相同結(jié)構(gòu)的高純度的大量的重組20K hGH。因此，沒(méi)有提供特異性測(cè)量20KhGH的方法。
然而，通過(guò)利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化體，最近已研究出一種能夠高純度和大量地得到天然類(lèi)型的20 K hGH的方法(Uchida等人.，J.Biotechnology:55:101-112(1997))。此外，已經(jīng)制取單克隆抗體，其特異性地與天然類(lèi)型的20K hGH反應(yīng)而基本上不與22K hGH發(fā)生交叉反應(yīng)，還研究出一種通過(guò)利用這樣的特異性針對(duì)20K hGH的抗體來(lái)測(cè)量20K hGH在血液中的濃度的方法(EPPublication No.0814091)。
最近，由于已相對(duì)大量地提供22K hGH,22K hGH的各種生理活性已被進(jìn)一步揭示出來(lái)。首先，hGH被用于治療生長(zhǎng)激素不足的兒童疾病，然而，hGH治療已表明對(duì)于這種疾病正像成年人生長(zhǎng)激素不足一樣是費(fèi)用很高的。目前，hGH治療已進(jìn)一步針對(duì)不是由于hGH分泌缺乏引起的侏儒癥，以及針對(duì)燒傷和/或受傷、手術(shù)后狀態(tài)不良、骨質(zhì)疏松等。如果在這些疾病治療的臨床研究中采用hGH，就必須掌握外部施用的hGH的狀態(tài)。然而，倘若病人并不完全缺乏hGH，由于病人產(chǎn)生的hGH保留在血液中，僅通過(guò)測(cè)量血液中的hGH濃度來(lái)確定血液中hGH濃度值與在病人內(nèi)源性生成的hGH(稱(chēng)之為生理性hGH)有關(guān)還是與外部施用的hGH有關(guān)是困難的。迄今不知道在這種情況下的測(cè)量方法。
另一方面，hGH已被用作藥物。作為近些年來(lái)運(yùn)動(dòng)禁服藥物之一，人們還公知hGH是藥物測(cè)試的對(duì)象。
然而，簡(jiǎn)單地根據(jù)通過(guò)測(cè)量得到的血液中hGH濃度的高低，仍難以確定受檢驗(yàn)者是否已經(jīng)施用hGH，原因如下(1)對(duì)hGH檢測(cè)是困難的，這是因?yàn)樗谘褐械臐舛确浅５?，即使?duì)于與20K hGH相比，在血液中的量比較高的22K hGH，也只有幾納克/毫升到幾十納克/毫升。
(2)即使能夠檢測(cè)hGH，它在血液中的濃度隨個(gè)體、性別和年紀(jì)也是明顯不同的。
(3)由于hGH是由垂體間歇性地分泌的，即使對(duì)同一受檢驗(yàn)者，在不同時(shí)間抽出的血液中的hGH濃度也是不同的。
此外，由于hGH誘發(fā)的次級(jí)生理反應(yīng)對(duì)不同個(gè)體、性別和年紀(jì)是極為不同的，還由于次級(jí)生理反應(yīng)和外部施用的hGH之間的相互關(guān)系被認(rèn)為是復(fù)雜的，血液中的hGH濃度自身并不能作為藥物測(cè)試的適當(dāng)指標(biāo)。
目前，22K hGH已是藥物測(cè)試的測(cè)試目標(biāo)。然而，據(jù)信22K hGH占有人體總hGH中的最大部分，因此，僅針對(duì)22K hGH的特異性測(cè)量不能提供藥物測(cè)試的正確結(jié)果。
根據(jù)對(duì)總hGH和22K hGH的血液濃度的分別測(cè)量，推算20K hGH約占血液中的總hGH中的約10％。然而，如上所述，由于最近才研究出特異性測(cè)量20K hGH的方法，因此還沒(méi)有測(cè)量出22K hGH和20K hGH之間的嚴(yán)格的存在比率。因此，當(dāng)然沒(méi)有它們之間存在比率的日常變化或者由于如下因素引起的變化的資料(a)個(gè)體、性別和年紀(jì)的差別，以及(b)在耐量測(cè)試中由于hGH加速分泌所引起的血液中hGH濃度的升高。
本發(fā)明的主題是提供一種測(cè)定或者判斷是否外部施用了hGH的方法，以及一種測(cè)量血液或尿中的不包括生理性hGH的外部施用的hGH的濃度的方法，所述方法以血液或尿中的22K hGH和20K hGH濃度之比作為指數(shù)；或者利用了分別在正常狀態(tài)(即沒(méi)有施用任何hGH時(shí))以及在已經(jīng)施用激素之后所測(cè)量的22KhGH和20KhGH中的某一種或每一種的濃度與總的hGH濃度的比值。
本發(fā)明人利用不同種類(lèi)的人血漿和血清，分別用特異性針對(duì)22K hGH和20K hGH的測(cè)量方法，對(duì)22K hGH和20K hGH的血液濃度進(jìn)行了測(cè)量，然后計(jì)算了它們的比率。此外，對(duì)于22K hGH和20K hGH的血液濃度之間的比率怎樣隨著各種因素變化進(jìn)行了調(diào)查研究。結(jié)果表明，22K hGH和20K hGH各自的濃度隨個(gè)體、性別和年紀(jì)有極大變化，它的日常變化也是很大的。還已發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，按耐量測(cè)試得到的濃度明顯地高。然而，還已首次發(fā)現(xiàn)，20KhGH(或22KhGH)的濃度對(duì)于總的hGH的濃度(22KhGH和20KhGH的濃度和)的比率對(duì)不同的個(gè)體、性別和年紀(jì)都幾乎相同。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)，雖然總的hGH濃度全天之中有很大變化，但上述比率幾乎恒定，即使血液中的總的hGH濃度通過(guò)耐量測(cè)試而變化，所述比率并不因此受到很大影響。
這些新的發(fā)現(xiàn)和結(jié)果還揭示，當(dāng)對(duì)被檢驗(yàn)者單獨(dú)外部施用22K hGH或者20KhGH時(shí)，22K hGH和20 KhGH的血液濃度之間的比率在施用前后發(fā)生變化。這就使人相信，通過(guò)測(cè)量22K hGH和20K hGH的血液濃度和監(jiān)測(cè)它們的比率，就能夠測(cè)定或者判斷是否已外部施用了hGH，并計(jì)算已經(jīng)施用的hGH在血液中的濃度。此外，即使不用血液中hGH濃度而使用尿中hGH濃度作為測(cè)量的對(duì)象，預(yù)計(jì)也能得出相同的結(jié)論。
因此，在本發(fā)明人的上述新認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上完成本發(fā)明。即，本發(fā)明提供一種根據(jù)22K hGH和20K hGH在血液或尿中的濃度的比率測(cè)定hGH濃度的方法。本發(fā)明還提供一種根據(jù)22KhGH和20KhGH在血液或尿中的濃度的比率測(cè)定或者確認(rèn)受檢驗(yàn)者是否已經(jīng)外部施用了hGH的方法。
根據(jù)本發(fā)明，測(cè)定外部施用hGH的濃度或確認(rèn)外部施用hGH還可以通過(guò)將在正常狀態(tài)下在血液或者尿中的22K hGH濃度和20K hGH濃度中的某一種或每一種對(duì)總hGH濃度的比率，與在施用它們之中某一種之后或者在懷疑施用它們之中某一種之時(shí)的對(duì)應(yīng)比率相比較來(lái)實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，可以測(cè)定外部施用hGH所形成的血液或尿中hGH濃度。即，本發(fā)明能夠簡(jiǎn)易和嚴(yán)格地測(cè)量由于外部施用所形成的血液或尿中的hGH濃度。本發(fā)明的測(cè)量方法對(duì)于在20KhGH或22KhGH的臨床應(yīng)用中監(jiān)測(cè)外部施用的hGH的體內(nèi)狀態(tài)是十分有用的。此外，本發(fā)明能夠確認(rèn)或判斷是否已外部施用了hGH。因此，本發(fā)明的方法對(duì)于運(yùn)動(dòng)類(lèi)藥物測(cè)試是有用的。


圖1是表示在20KhGH的免疫測(cè)量中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線圖。
圖2是表示在22KhGH的免疫測(cè)量中的標(biāo)準(zhǔn)曲線的曲線圖。
圖3是表示20KhGH分泌和年齡之間關(guān)系的曲線圖。
圖4是表示22KhGH分泌和年齡之間關(guān)系的曲線圖。
圖5是表示20KhGH的生理比率和年齡之間關(guān)系的曲線圖。
圖6是表示在通常受檢驗(yàn)者的血清中的22KhGH和20KhGH數(shù)值之間相互關(guān)系的曲線圖。
圖7是表示在20KhGH的生理比率和身高之間關(guān)系的曲線圖。
圖8是表示在20KhGH的生理比率和體重之間的關(guān)系的曲線圖。
圖9是表示20KhGH的生理比率和人體脂肪之間的關(guān)系的曲線圖。
圖10是表示當(dāng)兒童睡眠時(shí)觀測(cè)的血液中的hGH狀態(tài)的曲線圖。
圖11是表示對(duì)成年人持續(xù)約一個(gè)月觀測(cè)的血液中的hGH的狀態(tài)的曲線圖。
圖12是表示通常胰島素耐量測(cè)試已增加的血液中的hGH狀態(tài)的曲線圖。
圖13是表示通過(guò)可樂(lè)定(clonidine)耐量測(cè)試增加的血液中的hGH狀態(tài)的曲線圖。
下文將詳細(xì)介紹本發(fā)明。
本發(fā)明所測(cè)量的人體生長(zhǎng)激素一般是指包含22KhGH和20KhGH的激素。20KhGH是存在于人體血液或尿中的一種包含176個(gè)氨基酸的hGH。已知兩種20KhGH，一種在N-末端第14位具有蛋氨酸，另一種在相應(yīng)位置具有絲氨酸，它們中的任一種都可在本發(fā)明中使用。在本發(fā)明中使用的20KhGH可以根據(jù)例如在EP Publication No.0587427中所公開(kāi)的一般重組方法得到。所使用的22KhGH是一種出現(xiàn)在人體血液或尿中的由191個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。22KhGH是例如按商品名“Genetropin”(Pharmacia Upjohn)市售的。為了測(cè)量在人體血液或尿中的22KhGH和20KhGH的濃度，可以采用使用抗體的免疫測(cè)定法?？梢赃M(jìn)行高靈敏度測(cè)量，特別是如果使單克隆抗體作為用于檢測(cè)的抗體時(shí)。倘若免疫測(cè)定使用抗體，測(cè)量靈敏度最好為10pg/ml(微微克/毫升)或者小于10pg/ml。
此外，除了上述免疫測(cè)定之外，可以將電泳例如SDS電泳、各種類(lèi)型的柱層析法、高效液相層析法(HPLC)等用于測(cè)量在血液或尿中的22KhGH和20KhGH的濃度，也可以用將層析法和免疫測(cè)定法相結(jié)合的方法。為了測(cè)量22KhGH在人體血液中的濃度，可以采用如在日本專(zhuān)利公告(公開(kāi))號(hào)273496/’88中所公開(kāi)的使用特異性與22KhGH反應(yīng)的單克隆抗體的免疫化學(xué)測(cè)量法。這里使用的單克隆抗體可以由產(chǎn)生抗22KhGH抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合產(chǎn)生的雜交瘤得到。A36020047P(BiosPacific)就是這種類(lèi)型的單克隆抗體的一個(gè)實(shí)例。
另一方面，為了測(cè)量20KhGH在人體血液中的濃度，可以采用該利用特異性與20KhGH反應(yīng)和基本上不與22KhGH反應(yīng)的單克隆抗體的免疫化學(xué)測(cè)量法，如在EP Publication No.0814091中所公開(kāi)的。這里使用的單克隆抗體可以由產(chǎn)生抗20KhGH抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞株融合產(chǎn)生的雜交瘤得到。MTC6A細(xì)胞株(FERM BP-5913)就是這種雜交瘤的一個(gè)實(shí)例。這種MTC6A雜交瘤已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約保藏在National Institute of Bioscience and Human-technology,Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry ofInternational Trade and Industry(Higashi 1-1-3 Tsukuba-City Ibaragi Prefecture，Japan)，保藏號(hào)為FERM BP-5913。
為了利用該產(chǎn)生抗單克隆抗體的雜交瘤生成所需的特異性與20KhGH反應(yīng)的單克隆抗體，可以根據(jù)包括細(xì)胞培養(yǎng)法或腹水形成法的常規(guī)方法來(lái)培養(yǎng)雜交瘤。然后將生成的單克隆抗體由所形成的培養(yǎng)液的上清液或者腹水提純。利用常規(guī)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)該培養(yǎng)物的上清液或者腹水的單克隆抗體的提純。一種適當(dāng)綜合例如硫酸銨分級(jí)、凝膠過(guò)濾、離子交換層析法、親合層析法等的方法也是可采用的。
利用單克隆抗體的免疫測(cè)量22KhGH和20KhGH的方法是指利用由上述方法得到的單克隆抗體的方法。根據(jù)本發(fā)明，這里所采用的免疫測(cè)量法例如包括酶免疫測(cè)定法，放射免疫測(cè)定法、熒光免疫測(cè)定法、發(fā)光免疫測(cè)定法等，在這些方法之中優(yōu)先使用酶免疫測(cè)定法。更為優(yōu)選采用利用了與單克隆抗體結(jié)合的不溶性載體的夾心式酶免疫測(cè)定法。
下面介紹用于根據(jù)夾心式酶免疫測(cè)定法測(cè)量20KhGH的方法。除了用22KhGH替換20KhGH之外，測(cè)量22KhGH的方法與測(cè)量20KhGH的方法相同。
作為第一步，使單克隆抗體固著在不溶性載體上，使固著的單克隆抗體與包含人體生長(zhǎng)激素的測(cè)試溶液反應(yīng)，由此形成一種具有20KhGH的結(jié)合產(chǎn)物，其中20KhGH與不溶性載體上的固著的單克隆抗體特異性結(jié)合。
不溶性的載體包含微板、塑料珠、玻璃珠、細(xì)微磁性顆粒等。為了使單克隆抗體結(jié)合到這些不溶性載體上，可使用已知的化學(xué)結(jié)合法，以及物理吸附方法。即，將本發(fā)明中使用的單克隆抗體溶解在碳酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液等中，以及將不溶性載體添加到溶液中。在將所形成的混合物放在0℃到室溫的環(huán)境持續(xù)不小于1小時(shí)后，利用Tween20(聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯)、包含疊氮化鈉等的Tris鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液等，以便除去非結(jié)合的抗體。然后，可以將所得到的固著抗體的不溶性載體在上述第一步驟中使用。
作為第二步，使在第一步驟中得到的在不溶性載體上的結(jié)合產(chǎn)物與以酶標(biāo)記的抗hGH的抗體(下文稱(chēng)為之抗hGH的酶標(biāo)記的抗體)反應(yīng)，由此，在不溶性載體上形成夾心式復(fù)合物，其具有下列結(jié)構(gòu)抗20KhGH單克隆抗體-20KhGH-抗hGH的酶標(biāo)記的抗體。
由于該抗hGH的抗體被用作為抗hGH的酶標(biāo)記的抗體的材料，因此或者可以使用僅與20KhGH反應(yīng)且識(shí)別與抗20KhGH單克隆抗體所識(shí)別的不相同的抗原決定部位的抗體；或者可以使用與20KhGH和22KhGH兩者反應(yīng)的抗體。這些抗體可以是單克隆或者是多克隆的抗體。利用已知的方法可以得到這些抗體。單克隆抗體D14是利用已知方法可以得到的一個(gè)實(shí)例。
用于標(biāo)記抗-hGH抗體的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶、B-半乳糖苷酶等。
利用已知的方法可以用酶對(duì)抗hGH的抗體或者抗體中的F(ab’)2和Fab’片段進(jìn)行標(biāo)記，其中酶中的糖鏈用高碘酸氧化，并使所形成的醛基與抗-hGH的抗體中的氨基酸反應(yīng)；或者其中將馬來(lái)酰亞氨基或者吡啶硫基引入到酶中，且使該基團(tuán)與抗hGH抗體的Fab’片段中的巰基反應(yīng)。
作為第三步，測(cè)量用于標(biāo)記在第二步驟中得到的夾心復(fù)合物的酶的活性。即，由于酶的活性取決于20KhGH的數(shù)量，所測(cè)量的活性只對(duì)應(yīng)于在測(cè)試溶液中包含的20KhGH的數(shù)量或濃度。通過(guò)添加用于測(cè)量酶活性的底物可以測(cè)量酶的活性。
另外，通過(guò)利用抗hGH的生物素標(biāo)記的抗體即利用生物素標(biāo)記的抗hGH的抗體，取代抗hGH的酶標(biāo)記的抗體也可以改進(jìn)該方法。在這種情況下，在不溶性載體上形成一種具有“抗20KhGH單克隆抗體-20KhGH-抗hGH的生物素標(biāo)記的抗體”結(jié)構(gòu)的夾心復(fù)合物，使該復(fù)合物與酶標(biāo)記的抗生物素蛋白或者酶標(biāo)記的鏈酶抗生物素蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致形成一種具有抗20KhGH單克隆抗體-20KhGH-抗hGH的生物素標(biāo)記的抗體-酶標(biāo)記的抗生物素蛋白或者酶標(biāo)記的鏈酶抗生物蛋白結(jié)構(gòu)的夾心復(fù)合物。在此之后，測(cè)量結(jié)合到夾心復(fù)合物上的酶的活性。
此外，在上述夾心式酶免疫測(cè)量法中，可以另外采用抗-20KhGH的單克隆抗體(或者抗22KhGH的單克隆抗體)取代抗hGH的酶標(biāo)記的抗體。
利用免疫測(cè)量法測(cè)量的試樣包括人體血液、尿、其它人體體液以及它們的稀釋溶液，它們的經(jīng)提純的溶液或者經(jīng)pH調(diào)節(jié)處理的溶液等。
利用一般的重組方法制取的20KhGH和22KhGH可以用作標(biāo)準(zhǔn)20KhGH和22KhGH，用于形成在免疫測(cè)量中使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
通過(guò)利用上述方法測(cè)量血液或者尿中hGH濃度來(lái)測(cè)定外部施用的hGH在血液或尿中的濃度的方法可以包括的步驟有根據(jù)20KhGH和22KhGH在血液或尿中的濃度與總hGH濃度(22KhGH和20KhGH在血液中的濃度的和；或者22KhGH和20KhGH在尿中的濃度的和)的比率，計(jì)算外部施用的hGH濃度。
根據(jù)20KhGH和22KhGH在血液或尿中濃度之間的比率所進(jìn)行的計(jì)算可以按如下步驟實(shí)施首先，測(cè)量在明顯還未施用人體生長(zhǎng)激素時(shí)由病人取得的血液或尿中的22KhGH和20KhGH的濃度。測(cè)定所得到的22KhGH(或20KhGH)在血液或尿中的濃度和總的hGH濃度的比率，并將其定義為生理比率(例如，[20KhGH/(20KhGH+22KhGH)]×100；或者[22KhGH/(20KhGH+22KhGH)]×100。
這一生理比率對(duì)所有人都是幾乎穩(wěn)定的，并且呈現(xiàn)恒定的數(shù)值，不受時(shí)間和/或總的hGH濃度值的影響。最好通過(guò)改變測(cè)量時(shí)間和日期幾次進(jìn)行測(cè)量，并將得到的數(shù)值平均，以便更精確地測(cè)定生理比率。
其次，利用與上述相同的方式，在由已經(jīng)測(cè)量生理比率的同一病人的血液或尿中所取的(在已明顯施用人體生長(zhǎng)激素之后的一個(gè)時(shí)間或者當(dāng)懷疑施用時(shí))的比較試樣中測(cè)量20KhGH(或22KhGH)的實(shí)際濃度。
根據(jù)測(cè)量的數(shù)值，計(jì)算22KhGH(或20KhGH)的濃度對(duì)總的hGH濃度的比率。這一用于進(jìn)行比較的根據(jù)實(shí)際測(cè)量值得到比率被稱(chēng)為測(cè)量比率。
最后根據(jù)生理比率和由上述步驟得到的測(cè)量比率之間差值，計(jì)算外部施用的hGH的量。
如果顯然已施用22KhGH或20KhGH，將不同于所施用的hGH的hGH(例如，如施用22KhGH則為20KhGH)選擇作為標(biāo)準(zhǔn)hGH。根據(jù)在比較試樣中的在血液或尿中的標(biāo)準(zhǔn)hGH濃度，可以測(cè)定在該比較試樣中的生理hGH的濃度。根據(jù)在比較試樣中的生理hGH濃度和在該比較試樣中實(shí)際測(cè)量的hGH濃度之間的差值測(cè)定由施用增加的hGH在血液或尿中的濃度。例如，如果顯然施用的是22KhGH，與20KhGH相關(guān)的生理比率則被用作標(biāo)準(zhǔn)比率。當(dāng)利用比較試樣計(jì)算測(cè)量比率時(shí)，生理性22KhGH的濃度對(duì)生理性20KhGH的濃度的比率或者對(duì)它們的總濃度的比率也維持恒定。這意味著，利用在比較試樣中的實(shí)際測(cè)量的20KhGH濃度和20KhGH和22KhGH之間的生理比率，可以測(cè)定在該比較試樣中的生理性22KhGH的濃度。
在比較試樣中的生理性22KhGH的濃度和在比較試樣中的實(shí)際測(cè)量的濃度之間的差值對(duì)應(yīng)于通過(guò)施用引起的22 KhGH的濃度增量。
不是總得必須在測(cè)定測(cè)量比率之前進(jìn)行生理比率的測(cè)量，即對(duì)生理比率的測(cè)量可以在完成對(duì)測(cè)量比率的測(cè)定之后進(jìn)行，如果受檢驗(yàn)者的血液或尿中的hGH值返回到正常值的話。
本發(fā)明的方法可優(yōu)選用于單純施用20KhGH或者22KhGH的情況。本發(fā)明的方法也可以應(yīng)用于它們的混合施用，不過(guò)當(dāng)它們的混合比率對(duì)應(yīng)或接近于生理比率時(shí)，可以采用其它測(cè)定方法。
利用尿中的20KhGH和22KhGH的濃度來(lái)測(cè)量所施用的hGH在尿中的濃度的方法包括這樣一種方法，其中根據(jù)20KhGH或22KhGH的濃度對(duì)于所得到的總的hGH的濃度(22KhGH和20KhGH在尿中的濃度之和)的比率計(jì)算所施用的hGH。
下面介紹用于判斷是否已經(jīng)施用了hGH的確認(rèn)方法。
根據(jù)本發(fā)明，為了確認(rèn)或判斷是否已經(jīng)施用了hGH，如同在利用生理比率和測(cè)量比率測(cè)量所施用的hGH的情況一樣，在已測(cè)量20KhGH和22KhGH各自在血液(或尿中)的濃度之后，分別測(cè)定生理比率和測(cè)量比率。
在確認(rèn)或者判斷是否已經(jīng)施用了hGH的方法中，與在測(cè)量施用的hGH濃度的情況不同之處，是只需確認(rèn)生理比率不同于測(cè)量比率。例如，如果與22KhGH相關(guān)的測(cè)量比率已變得大于其生理比率，就可判斷已施用了22KhGH，而如果已變得小于22KhGH，就可判斷已施用了20KhGH。
本發(fā)明的一個(gè)方面，包括一種用于測(cè)量所施用的hGH在血液或尿中的濃度的測(cè)量?jī)x器或者用于判斷是否已經(jīng)外部施用了hGH的判別儀器。這些儀器包括試劑、抗體、溶劑、清洗劑、醫(yī)療器械等，是為對(duì)22KhGH和20KhGH在血液或尿中的濃度進(jìn)行免疫測(cè)量所需要的，意在適于較方便地實(shí)施本發(fā)明的測(cè)量和判斷方法。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，包括一種機(jī)器或者設(shè)備，其自動(dòng)實(shí)施用于測(cè)量已施用的hGH在血液或尿中濃度的方法或者判斷是否已外部施用hGH的方法。在該機(jī)器或設(shè)備中，自動(dòng)實(shí)施操作程序，以便易于實(shí)施本發(fā)明的測(cè)量方法和判斷方法。置有這種自動(dòng)操作程序的設(shè)備也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1測(cè)量22KhGH和20KhGH在人體血液中的濃度
(1)20KhGH的免疫測(cè)量法(1)-1制備單克隆抗體根據(jù)在EP Publication No.0814091中公開(kāi)的方法將特異性針對(duì)20KhGH的單克隆抗體由雜交瘤MTC6A株(FERM BP-5913)中分離。由BiosPacific購(gòu)買(mǎi)特異性針對(duì)22KhGH的單克隆抗體A36020047P。根據(jù)用于制取上述MTC6A的方法制備作為不與MTC6A和A36020047P競(jìng)爭(zhēng)的和與20KhGH和22KhGH兩者反應(yīng)的單克隆抗體D14。
通過(guò)利用BIACore(Pharmacia)得到關(guān)于3種單克隆抗體，MTC6A、A36020047P和D14的22KhGH和20KhGH的離解常數(shù)，其結(jié)果表示在表1中。在表1中的符號(hào)“ND”代表在利用BIACore的反應(yīng)中未發(fā)現(xiàn)結(jié)合特性。
表1抗hGH的單克隆抗體的離解常數(shù)
(1)-2制備酶標(biāo)記的抗體根據(jù)由Ishikawa等人提出的方法(Nonisotopic Immunoassay；NgO,T.T；Plenum Press；P27-55(1988)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體的酶標(biāo)記。
通過(guò)利用S-乙酰羥基琥珀酐將SH基加入到提純的單克隆抗體D14，使得形成的單克隆抗體能與蘋(píng)果酰胺化的辣根過(guò)氧化物酶(下文稱(chēng)POD)能夠反應(yīng)以及得到以POD標(biāo)的D14。
(1)-3測(cè)量20KhGH在血液中的濃度。
20KhGH的血液濃度測(cè)量如下。
利用PBS稀釋特異性與20KhGH結(jié)合的單克隆抗體，以便提供濃度為40μg/ml的溶液，以及將60μl的稀釋溶液散布到96孔的微板(Greiner)中的每個(gè)孔中并且置于4℃下持續(xù)2夜。利用清洗劑(包含0.05％Tween20的10mMTris鹽酸緩沖液，pH8.0)沖洗，然后用Blockace(Dainippon Pharmaceutical)封閉。在將Blockace除去之后，添加100μl的反應(yīng)緩沖液(包含1％BSA的PBS、10μg/ml Heterophilic Blocking Reagent[Scantibodies]和1M NaCl)和25μl的待測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)20KhGH或者試樣溶液并搖動(dòng)2小時(shí)。在使用清洗劑沖洗之后，將100μl經(jīng)稀釋的以POP標(biāo)的抗hGH的單克隆抗體D14(按0.5μg/ml的濃度)和利用包含0.5％BSA、0.15M NaCl、0.05％酪蛋白、1％兔血清以及0.02％8抗體-1萘磺酸鹽(pH6.5)的磷酸鹽緩沖液(下文稱(chēng)為經(jīng)標(biāo)記的抗體稀釋溶液)調(diào)節(jié)的D14添加并搖動(dòng)2小時(shí)。在利用清洗劑沖洗該D14之后，添加通過(guò)利用100mM的檸檬酸鹽緩沖液(pH3.8)稀釋的3,3’,5,5’-四甲聯(lián)苯胺制備的100μl POD底物溶液(65μg/ml)，并放置持續(xù)30分。將100ml的1N硫酸添加到反應(yīng)溶液中，并且按照利用在620nm下的吸收率作為對(duì)照物的Immunoreader(Intermed)測(cè)量在450nm下的溶液的吸收率。根據(jù)形成的數(shù)值，利用在圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算20KhGH濃度。與22KhGH交叉反應(yīng)的比率不大于0.1％。
(2)22KhGH的免疫測(cè)量法在測(cè)量22KhGH在血液中的濃度的方法中，在市售的hGH單克隆抗體中選擇A36020047P(BiosPacific)作為特異性針對(duì)22KhGH的單克隆抗體。利用PBS稀釋22KhGH特異性抗體A36020047P，以便提供濃度為10μg/ml的溶液，將經(jīng)稀釋的60μl的該溶液散布到96孔的微板中的每一孔中并置在4℃下持續(xù)2夜。在這一微板已用清洗劑沖洗后，利用Blockace在該片上實(shí)現(xiàn)封閉。在除去Blockace之后，添加100μl的反應(yīng)緩沖液溶液，以及或者標(biāo)準(zhǔn)22KhGH或者25μl的測(cè)試溶液，并搖動(dòng)2小時(shí)。在利用清洗劑沖洗該片之后，添加利用經(jīng)標(biāo)記的抗體溶液稀釋的100μl以POD標(biāo)記的抗hGH的單克隆抗體D14和利用其調(diào)節(jié)的D14，搖動(dòng)2小時(shí)。在利用清洗劑沖洗之后，添加100μl的POD底物溶液并放置30分。將100ml的1N硫酸添加到反應(yīng)溶液中，按照利用在620nm下測(cè)定的吸收率作為對(duì)照物的Immunoreader測(cè)定在450nm下的溶液的吸收率。根據(jù)形成的數(shù)值，利用在圖2所示的校準(zhǔn)曲線計(jì)算22KhGH濃度。與20KhGH交叉反應(yīng)的比率不大于0.1％。
(3)hGH分泌和性別差別之間的關(guān)系對(duì)275個(gè)健康男性和263個(gè)健康女性抽血，根據(jù)上述方法(1)和(2)測(cè)定他們的血液中的22KhGH和20KhGH的濃度。根據(jù)測(cè)量的數(shù)值，計(jì)算生理比率，以便測(cè)定男性和女性之間的數(shù)值的比率。結(jié)果表示在表2中。表中的數(shù)值代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)值。因此，22KhGH和20KhGH(如在表列2中左列和中間列所示)的血液濃度對(duì)于不同的人在十分寬的范圍內(nèi)變化，標(biāo)準(zhǔn)偏差接近2倍的平均值。此外，得出男性和女性之間的數(shù)值差，以及女性的22KhGH和20KhGH的濃度約高于男性50％。另一方面，與hGH濃度的生理比率相比該生理比率的數(shù)值(在表2中的右列)維持恒定，它們的標(biāo)準(zhǔn)偏差為平均值的三分之一，男性和女性之間的比率沒(méi)有差別。表2
>(4)hGH分泌和年齡之間的關(guān)系利用由年齡0到79的健康受檢驗(yàn)者460名抽取的血清制備的試樣，根據(jù)在上述的方法(1)和(2)中所述的方法，測(cè)量20KhGH和22KhGH在血液中的濃度，以便得到20KhGH的生理比率。在圖3到6中表示該結(jié)果。如在這些圖中所示，20KhGH和22KhGH濃度對(duì)于不同的人在很寬的范圍內(nèi)變化(圖3和4)，以及求出在兩種hGH的濃度之間的高度相關(guān)性(r=0.947)(圖6)，不管年齡如何，生理比率維持恒定(約6％)(圖5)。
(5)對(duì)于不同人的濃度變化利用由各受檢驗(yàn)者(A到F)幾次抽取的血液，根據(jù)上述在方法(1)和(2)中所述的方法測(cè)量20KhGH和22KhGH在血液中的濃度，以便將hGH的血液濃度的分布和20KhGH的生理比率比較。如在表3和4中所表示的，hGH在血液中的濃度對(duì)于不同人在很寬范圍內(nèi)變化，然而，20KhGH的生理比率幾乎維持恒定。
表3不同人22KhGH和20KhGH的濃度差別以及20KhGH濃度對(duì)于總hGH(22KhGH+20KbGH)的濃度的比例。
(6)hGH生理比率、身高、體重和人體脂肪之間的關(guān)系利用由70個(gè)健康成年人采集、制備的血清試樣、根據(jù)在上述方法(1)和方法(2)中所述的方法測(cè)量20KhGH和22KhGH在血液中的濃度，以便得到20KhGH濃度的生理比率。得出兩種hGH的生理比率、身高、體重和人體脂肪之間的關(guān)系表示在圖7到9。
(7)血液中的hGH隨時(shí)間(1)的變化特性利用由兒童在開(kāi)始睡著以后的每20分鐘采集制備的血清試樣，根據(jù)上述在方法(1)和(2)中所述的方法測(cè)量20KhGH和22KhGH的濃度，以得到20KhGH的生理比率。如在圖10中所示，當(dāng)在夜間加速分泌兩種hGH時(shí)，發(fā)現(xiàn)在兩種hGH中幾乎同時(shí)出現(xiàn)分泌的峰值，同時(shí)觀察到在兩種hGH的濃度比率方面沒(méi)有明顯的變化。
(8)血液中的hGH隨時(shí)間(2)的變化特性利用由同一健康成年人按照每四天以上采集制備的血清試樣，根據(jù)在上述方法(1)和(2)中所述的方法測(cè)量20KhGH和22KhGH的濃度，以便得到20KhGH的生理比率。如在圖11中所示，應(yīng)注意在大約一個(gè)月的時(shí)期內(nèi)在兩種hGH的濃度比率方面沒(méi)有明顯的變化。
(9)測(cè)量在受到刺激分泌hGH時(shí)的hGH在血液中的濃度利用由同一兒童當(dāng)利用胰島素或可樂(lè)定刺激hGH分泌時(shí)按照上述采集制備的血清試樣，根據(jù)在上述方法(1)和(2)中所述的方法測(cè)量20KhGH和22KhGH的濃度，以便得出20KhGH的測(cè)量比率。如在圖12和13中所示，當(dāng)在兩種耐量測(cè)試期間刺激分泌時(shí)在這兩種異構(gòu)重整產(chǎn)物方面發(fā)現(xiàn)幾乎同時(shí)出現(xiàn)分泌峰值，并應(yīng)注意，在兩種hGH的濃度的比率方面沒(méi)有明顯變化。
實(shí)施例2測(cè)量施用的hGH使兒童通過(guò)皮下施用22KhGH(2.75U)(1mg)并制備血清試樣。根據(jù)在方法(1)和(2)中所述的方法測(cè)量在血清試樣中的20KhGH和22KhGH的濃度，以便計(jì)算生理比率和測(cè)量比率。如在表4中所示，由在施用前的為4.8％的20KhGH的比率大為降低到施用之后4小時(shí)時(shí)的0.4％。
表4在施用22KhGH后的22KhGH的比率變化
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定施用的人體生長(zhǎng)激素(hGH)在血液中的濃度的方法，該方法是基于分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)在血液中的濃度和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20KhGH)在血液中的濃度之間的比率進(jìn)行測(cè)定的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法包括如下步驟(1)測(cè)量在被檢驗(yàn)者未施用人體生長(zhǎng)激素時(shí)，所述分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20KhGH)的濃度，然后確定測(cè)得的20KhGH或22KhGH濃度對(duì)于總的hGH濃度(22KhGH和20KhGH濃度之和)的比率，該比率被定義為生理比率，(2)在已施用人體生長(zhǎng)激素之后或者當(dāng)懷疑施用時(shí)抽取被檢驗(yàn)者的血液，然后，按與步驟(1)中相同的方式確定20KhGH或22KhGH濃度對(duì)于總的hGH濃度的比率，該比率被定義為測(cè)量比率，以及(3)根據(jù)步驟(1)中確定的生理比率和步驟(2)中確定的測(cè)量比率之間的差值，確定施用的人體生長(zhǎng)激素在血液中的濃度。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述對(duì)分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素在血液中的濃度的測(cè)量是利用特異性針對(duì)每種所述生長(zhǎng)激素的抗體進(jìn)行的。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的抗體是單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所施用的生長(zhǎng)激素是分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所施用的生長(zhǎng)激素是分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素。
7.一種確認(rèn)或判斷是否已施用人體生長(zhǎng)激素(hGH)的方法，該方法是基于分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)在血液中的濃度和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20KhGH)在血液中的濃度的比率實(shí)現(xiàn)的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，該方法包括如下步驟(1)測(cè)量在被檢驗(yàn)者未施用人體生長(zhǎng)激素時(shí)的分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20KhGH)各自的濃度，然后確定測(cè)得的20KhGH或者22KhGH濃度對(duì)總的hGH濃度(22KhGH和20KhGH濃度之和)的比率，該比率被定義為生理比率，(2)在已施用人體生長(zhǎng)激素之后或當(dāng)猜測(cè)施用時(shí)抽取被檢驗(yàn)者血液，然后按與步驟(1)中相同的方式確定20KhGH或者22KhGH對(duì)于總的hGH濃度的比率，該比率被定義為測(cè)量比率，以及(3)通過(guò)將步驟(1)中確定的生理比率和步驟(2)中確定的測(cè)量比率相比較，確定已施用的人體生長(zhǎng)激素在血液中的濃度。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中對(duì)分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素在血液中的濃度的測(cè)量是利用特異性針對(duì)所述生長(zhǎng)激素的抗體完成的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的抗體是單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所施用的生長(zhǎng)激素是分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所施用的生長(zhǎng)激素是分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素。
13.一種測(cè)定施用的人體生長(zhǎng)激素在尿中的濃度的方法，該方法是基于分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20KhGH)在尿中的濃度的比率進(jìn)行測(cè)定的。
14.一種確認(rèn)或者判斷是否已經(jīng)施用人體生長(zhǎng)激素(hGH)的方法，該方法是基于分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22KhGH)和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素在尿中的濃度的比率實(shí)現(xiàn)的。
全文摘要
根據(jù)分子量約為22000的人體生長(zhǎng)激素(22K hGH)和分子量約為20000的人體生長(zhǎng)激素(20K hGH)在血液或尿中的濃度的比率,測(cè)量已施用的hGH在血液中的濃度;或者根據(jù)22K hGH和22K hGH在血液或者尿中的濃度之間的比率判斷是否已施用了hGH。
文檔編號(hào)G01N33/74GK1234504SQ99107730
公開(kāi)日1999年11月10日 申請(qǐng)日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月30日
發(fā)明者橋本吉秀, 河野直子, 槙野正, 入江實(shí) 申請(qǐng)人:三井化學(xué)株式會(huì)社