專利名稱：中密度dna(基因)芯片制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及中密度DNA(基因)芯片的制作方法。
現(xiàn)有基因芯片制作技術(shù)都處在研究之中，至今尚無成熟的技術(shù)或產(chǎn)品問世。目前正在研究的芯片制作技術(shù)主要分兩大類，即激光光刻/光學(xué)導(dǎo)向合成技術(shù)和三維機(jī)器人DNA點(diǎn)樣系統(tǒng)。
激光光刻/光學(xué)導(dǎo)向合成技術(shù)以美國Affymatrix公司為唯一代表。Affymatrix公司是光刻導(dǎo)向合成芯片制作技術(shù)的始創(chuàng)者。該技術(shù)通過激光制作細(xì)微光孔的光學(xué)屏蔽板，然后在利用光孔的導(dǎo)向作用直接指導(dǎo)在芯片上的DNA寡核苷酸探針合成，(http//www.affymatrix.com)。該技術(shù)可以獲得密度很高的DNA寡核苷酸探針點(diǎn)陣芯片，但該技術(shù)需要昂貴的專用激光設(shè)備，制作過程復(fù)雜、時(shí)間長、質(zhì)量不易控制，特別是在光導(dǎo)合成過程中對特定堿基的選擇還沒有達(dá)到足夠的特導(dǎo)性。另外由該技術(shù)制作的芯片，也必須由專用配套的激光掃描檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。
三維機(jī)器人DNA點(diǎn)樣系統(tǒng)由美國斯坦福大學(xué)首創(chuàng)并在1998年3月在網(wǎng)絡(luò)上公布(http//cmgm stanford.edu/pbrown/)，其后世界上其它少數(shù)實(shí)驗(yàn)室也開始跟進(jìn)，然而至今也未見成熟推向市場的產(chǎn)品和系統(tǒng)的制作技術(shù)。該技術(shù)操作的一般規(guī)律是先合成5’氨基標(biāo)記的DNA寡核苷酸探針，然后通過泉水筆尖蓄水的原理將DNA探針傳遞到有醛基修飾的玻片上。此DNA傳遞過程由X、Y、Z軸線性運(yùn)動平臺組成的三維機(jī)器人完成。在軟件的控制下，可以將DNA探針傳遞到指定的位置。目前由斯坦福大學(xué)制作的DNA點(diǎn)樣系統(tǒng)，雖然可以在一張玻片上排列上萬個(gè)基因探針，但是該儀器是由市場購進(jìn)的運(yùn)動組件模塊組裝而成。機(jī)器大而笨重，組裝價(jià)格昂貴，一般均需3萬美元以上。更主要的是該機(jī)器打印針清洗、干燥系統(tǒng)設(shè)計(jì)不合理，需要大量的清洗液。由于機(jī)器笨重，操作煩瑣，不易控制，極易造成損壞。
本發(fā)明的目的是提供一種中密度DNA(基因)芯片的制作方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取下列措施中密度DNA(基因)芯片制作方法它包括先將各種待檢測的DNA序列找出，并進(jìn)行探針的合成，合成后在5’末端進(jìn)行活性基團(tuán)的修飾，采用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣，其特征在于所說點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣是在一塊平板上，頂部安置X軸的直線驅(qū)動裝置，在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下驅(qū)動固定在X軸上的Y軸作左右來回移動，而在Y軸也在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下以相同的分辨率步距驅(qū)動連接在Y軸上的DNA樣本打印裝置和打印針作前后來回移動，這樣，兩個(gè)微型步進(jìn)電機(jī)和DNA打印頭分別在驅(qū)動程序的控制下，精確地作三維空間的定位和打印，將DNA送至指定的位置，并使點(diǎn)樣針與玻片接觸，在每一片玻片上相應(yīng)位置點(diǎn)樣，每次循環(huán)點(diǎn)樣后點(diǎn)樣針經(jīng)清洗、干燥裝置作清洗、干燥處理。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.儀器設(shè)置簡單，體積小。
無論是激光刻蝕、屏蔽技術(shù)還是三維機(jī)器人技術(shù)，均需要復(fù)雜的專用設(shè)備，裝置成本在30000美元以上。三維機(jī)器人技術(shù)，機(jī)器重量超過500Kg，對于搬運(yùn)、維修都不方便。本發(fā)明中密度DNA芯片制作方法，利用現(xiàn)成設(shè)備加以改造，成本不足1000美元，而且雖然體積小巧，DNA點(diǎn)樣密度仍達(dá)到100～1000/cm2，仍然可以一次制作50張芯片。
2.獨(dú)特的DNA點(diǎn)樣針清洗、干燥裝置。
本發(fā)明的DNA點(diǎn)樣針的清洗和干燥裝置，采用負(fù)壓抽吸噴淋的原理和風(fēng)干的原理，將清洗、干燥裝置整合在不足1X1X2cm的裝置中，大大減輕了儀器的重量、減少清洗液的用量。同時(shí)采用針控負(fù)壓啟動噴淋裝置。只有在打印針接近淋洗裝置時(shí)，噴淋系統(tǒng)才開始工作，與恒流系統(tǒng)相比，可節(jié)省90％以上的淋洗液。該裝置制作簡單，成本低廉，因此便于隨時(shí)更換。
3.DNA點(diǎn)樣針的設(shè)計(jì)本發(fā)明點(diǎn)樣針選用親水性陶瓷材料制作，具有成本低，易于清洗和易于維護(hù)。而現(xiàn)有技術(shù)采用泉水筆刻槽吸納原理制作點(diǎn)樣針，制作工藝要求高，成本高，一根針需300美元，而且有容易堵塞，針尖易損等缺點(diǎn)。
4.操作簡便本發(fā)明設(shè)計(jì)的打印驅(qū)動軟件，具有隨機(jī)選擇打印位置、調(diào)節(jié)DNA斑點(diǎn)的間距、調(diào)節(jié)打印針的清洗、干燥和點(diǎn)樣時(shí)間、位置校正、標(biāo)簽打印、打印預(yù)覽等多種功能，不需特別的學(xué)習(xí)即可進(jìn)行操作。
5.中密度芯片適用于非激光檢測裝置，降低了對激光掃描裝置的依賴性。這是該發(fā)明為普及推廣DNA芯片應(yīng)用的主要目的。DNA芯片的發(fā)明最終是為了更廣泛的應(yīng)用，激光掃描裝置的高成本是阻礙DNA芯片應(yīng)用的最大的障礙。本發(fā)明的中密度DNA芯片制作技術(shù)，具有直徑200μm的DNA斑點(diǎn)，可以直接被諸如CCD檢測裝置所檢測。
下面結(jié)合附圖、實(shí)施例作詳細(xì)說明

圖1是DNA芯片制作和檢測流程圖；圖2是DNA點(diǎn)樣裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是DNA點(diǎn)樣針清洗、干燥裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是陶瓷材料DNA點(diǎn)樣針結(jié)構(gòu)示意圖。
為了便于理解，先介紹DNA芯片制作和檢測的流程(圖1)。在進(jìn)行DNA探針點(diǎn)樣之前，必須先作DNA寡核苷酸探針合成和末端活性基團(tuán)標(biāo)記，這樣可以制成DNA探針1、DNA探針2、DNA探針3……DNA探針N。DNA探針的數(shù)目依具體的檢測項(xiàng)目和應(yīng)用而定。完成DNA探針的合成之后，啟動中密度DNA點(diǎn)樣裝置，在芯片制作控制程序的控制下進(jìn)行DNA探針的打印。通過DNA打印針每次取一個(gè)DNA探針如DNA探針1，通過三維定點(diǎn)傳遞裝置將DNA探針傳遞到指定的點(diǎn)樣位置。完成一次打印后，荷樣打印針至清洗裝置清洗、干燥，進(jìn)行下一輪DNA探針的點(diǎn)樣，依次類推，直至所有DNA探針傳遞點(diǎn)樣完畢。作為DNA探針的支持系統(tǒng)，可選擇氨基或醛基反應(yīng)性基團(tuán)修飾的玻片，選擇何種玻片主要依據(jù)標(biāo)記DNA探針的活性基團(tuán)而定。在檢測時(shí)，首先進(jìn)行被檢測DNA樣本的抽提、純化，然后作逆轉(zhuǎn)錄，DNA熒光素標(biāo)記，再進(jìn)行目標(biāo)DNA與芯片探針雜交，然后進(jìn)行共聚焦激光掃描顯微鏡或芯片專用掃描儀掃描，最后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的采集和圖像計(jì)算機(jī)分析。
本發(fā)明中的DNA點(diǎn)樣設(shè)備包括由微型步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的X、Y和Z軸組成的三維空間運(yùn)動系統(tǒng)作指定的空間定位和DNA的定點(diǎn)傳遞。利用平板式繪圖儀進(jìn)行改裝并增加點(diǎn)樣針的自動清洗、干燥系統(tǒng)以及可變的時(shí)間控制。在一塊約50×40cm的平板上。頂部安置X軸的直線驅(qū)動裝置1，在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下可以以分辨率0.25μM的步距驅(qū)動固定在X軸上的Y軸2作左右來回移動，而在Y軸也在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下以相同的分辨率步距驅(qū)動連接在Y軸上的DNA樣本打印裝置3和打印針7作前后來回移動。這樣，兩個(gè)微型步進(jìn)電機(jī)和DNA打印頭可以分別在自編驅(qū)動程序的控制下，精確地作三維空間的定位和定點(diǎn)打印，將DNA探針打印到玻片4的指定位置。DNA點(diǎn)樣針11是根據(jù)親水陶瓷有親水特性的原理利用陶瓷制作的。DNA點(diǎn)樣針快速的循環(huán)清洗和干燥，并節(jié)省90％以上的清洗緩沖液是該發(fā)明的另一個(gè)重要技術(shù)。本發(fā)明點(diǎn)樣針的清洗、干燥裝置5、6是利用負(fù)壓抽吸的原理完成DNA點(diǎn)樣針的清洗和干燥。當(dāng)接通負(fù)壓裝置如真空泵后，干燥孔形成高速氣流8。當(dāng)點(diǎn)樣針接近時(shí)，由于強(qiáng)烈氣流，殘余在針尖上的水分被快速吸走，達(dá)到干燥的目的。而在清洗時(shí)，由于點(diǎn)樣針的接近，封閉了清洗孔的空氣通路，清洗室9內(nèi)壓力驟降，清洗緩沖液10被高速吸出，噴淋在DNA點(diǎn)樣針上。噴淋的時(shí)間可以由自編電腦程序控制。為了DNA探針能有效地固定在玻片上，通常在DNA探針合成后進(jìn)行DNA探針5’末端活性基團(tuán)的標(biāo)記，這些活性基團(tuán)有氨基、巰基等，固定DNA的玻片也需進(jìn)行活化處理。通常進(jìn)行硅化處理使之表面帶有醛基或氨基，可以與DNA探針形成共價(jià)鍵。在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用無氨基污染的消毒雙蒸水稀釋至10～100μg/μl和等量5XSSC(標(biāo)準(zhǔn)氯化鈉檸檬酸鈉雜交液)混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。在進(jìn)行雜交時(shí)，先將合成的已知序列DNA探針固定在芯片的相應(yīng)位置，然后將待檢測DNA樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記，再與DNA芯片雜交，因此可以同時(shí)檢測成千上萬個(gè)基因。這種方法是一種反向雜交技術(shù)。雜交信號檢測可以通過專用激光芯片掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測。掃描獲得的圖像，用芯片圖像專用分析軟件分析每個(gè)基因的雜交信號的強(qiáng)弱，從而獲得該基因芯片的基因表達(dá)模型。
本發(fā)明的關(guān)鍵是利用低成本材料制作中密度的DNA樣品的定位傳遞和固定。因此此設(shè)備是本發(fā)明的關(guān)鍵，其次是與該設(shè)備相關(guān)的DNA固定和檢測過程。
實(shí)施例1.DNA點(diǎn)樣設(shè)備的制作實(shí)施由于DNA芯片制作技術(shù)涉及到空間定位和DNA的定點(diǎn)傳遞，本發(fā)明中的DNA點(diǎn)樣設(shè)備也至少包括X、Y和Z軸組成的三維空間運(yùn)動。本發(fā)明的DNA點(diǎn)樣設(shè)備的運(yùn)行原理非常接近于早期平板式繪圖儀，然而平板式繪圖僅能進(jìn)行簡單的移動繪圖筆的運(yùn)動。作為自動循環(huán)DNA點(diǎn)樣的設(shè)備，在每次DNA點(diǎn)樣完成后必須徹底清洗點(diǎn)樣的打印針，以便作下一輪的DNA打印操作。因此點(diǎn)樣針的自動清洗、干燥系統(tǒng)以及可變的時(shí)間控制，以及DNA打印針的準(zhǔn)確的空間定位是本發(fā)明的核心技術(shù)。如圖2所示，該系統(tǒng)在一塊約為50X40cm的平板上，頂部安置X軸的直線驅(qū)動裝置，在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下以分辨率0.25μM的步距驅(qū)動固定在X軸上的Y軸作左右來回移動，而Y軸也在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下以相同的分辨率步距驅(qū)動連接在Y軸上的DNA樣本打印裝置和打印針作前后來回移動。這樣，兩個(gè)微型步進(jìn)電機(jī)和DNA打印頭可以分別在驅(qū)動程序的控制下，精確地作三維空間的定位和打印。點(diǎn)樣的密度在每平方厘米100至1000個(gè)點(diǎn)。作為芯片的載體是氨基或醛基修飾的25.4mm×76.2mm的玻片上。
2.點(diǎn)樣清洗、干燥裝置的實(shí)施該裝置是DNA樣本點(diǎn)樣的另一項(xiàng)重要技術(shù)，主要用于DNA點(diǎn)樣針的清洗和干燥，DNA的點(diǎn)樣是成百上千的循環(huán)操作，要求清洗徹底、快速。同時(shí)盡可能節(jié)省清洗緩沖液。該裝置利用負(fù)壓抽吸的原理完成DNA點(diǎn)樣針的清洗和干燥。其工作如圖3。當(dāng)接通負(fù)壓裝置如真空泵后，干燥孔形成高速氣流。當(dāng)針接近時(shí)，由于強(qiáng)烈氣流，殘余在針尖上的水分被快速吸走，達(dá)到干燥的目的。而在清洗時(shí)，由于針的接近，封閉了清洗孔的空氣通路，清洗室內(nèi)壓力驟降，清洗緩沖液被高速吸出，噴淋在DNA點(diǎn)樣針上，噴淋的時(shí)間可以由電腦程序控制。這樣設(shè)計(jì)至少有兩個(gè)好處一是大量節(jié)省清洗緩沖液，實(shí)際清洗時(shí)間約占一個(gè)循環(huán)打印時(shí)間的10％左右，與恒速噴淋技術(shù)相比，可以節(jié)省90％的清洗緩沖液。美國斯坦福大學(xué)的設(shè)計(jì)利用噴水池水泵進(jìn)行噴淋，不僅清洗緩沖液消耗大，而且容易溢出或?yàn)R出，為了解決這個(gè)問題，他們增加真空泵以控制清洗液的濺出。二是清洗和干燥過程由同一部份完成。體積小巧，易于安裝和控制。DNA點(diǎn)樣可選用任何適合的陶瓷制作的針，一般針尖直徑宜在0.1mm～0.3mm之間，本發(fā)明選用繪圖用陶瓷針作為DNA的點(diǎn)樣針。
3.DNA探針固定的實(shí)施為了DNA探針能有效地固定在玻片上，通常在DNA探針合成后進(jìn)行5’活性基團(tuán)的標(biāo)記，這些活性基團(tuán)有氨基、巰基等，固定DNA的玻片也需進(jìn)行活化處理，通常進(jìn)行硅化使之表面帶有醛基或氨基，與DNA探針形成共價(jià)鍵。在直接寡核苷酸DNA探針的固定中，先將DNA探針用無氨基污染的消毒雙蒸水稀釋至10～100μg/μl。如果是長探針(＞100堿基)，可以稀釋至0.2～1.0μg/μl。然后將2μl氨基標(biāo)記的DNA探針轉(zhuǎn)移至加樣板，再加2μl點(diǎn)樣緩沖液或5X SSC，仔細(xì)混合，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后，將玻片室溫留置24～72小時(shí)，然后漂洗清除未結(jié)合的DNA探針，先用0.2％SDS洗兩次，共10分鐘，蒸餾水洗兩次共5分鐘，95℃蒸餾水中變性2分鐘，再用硼化鈉溶液處理5分鐘使殘余活性基團(tuán)失活，最后用0.2％SDS洗3次，每次一分鐘和蒸餾水洗兩次，每次1分鐘。
4.反向DNA雜交的實(shí)施DNA芯片的雜交程序與通常所用DNA雜交程序不同。在通常的DNA雜交程序中，首先將未知的DNA固定在一定的支撐物如硝酸纖維薄膜上。然后用被標(biāo)記過的DNA探針進(jìn)行雜交，這種方法一次只能檢測一種靶DNA。在本發(fā)明中，先將已知合成的DNA探針固定在相應(yīng)的位置，然后將待檢測DNA樣本進(jìn)行標(biāo)記，再雜交，因此可以同時(shí)檢測成千上萬個(gè)基因。這是一種反向雜交技術(shù)。雜交過程是這樣的被檢DNA先用商用方法抽提出來，并Cy5或FiorX熒光標(biāo)記核苷酸底物進(jìn)行標(biāo)記，接著取2.5～3μl被檢標(biāo)記DNA加到DNA芯片上，分別蓋上蓋玻片和雜交封閉薄膜，56℃或42℃雜交2～10小時(shí)，然后將玻片在含有0.2％SDS的lXSSC室溫洗5分鐘去除未雜交的DNA，然后再在含有0.2％SDS的0.1XSSC溶液中洗5分鐘，最后用0.1XSSC溶液洗去殘余的SDS。玻片干燥后進(jìn)行激光掃描檢測。
4.雜交后檢測和數(shù)據(jù)分析的實(shí)施雜交信號檢測可以通過專用激光芯片掃描儀或共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行檢測。掃描獲得的圖像，用芯片圖像專用分析軟件分析每個(gè)基因的雜交信號的強(qiáng)弱，從而獲得該基因芯片的基因表達(dá)模型。
權(quán)利要求
1.一種中密度DNA(基因)芯片制作方法它包括先將各種待檢測的DNA序列找出，并進(jìn)行探針的合成，合成后在5’末端進(jìn)行活性基團(tuán)的修飾，采用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣，其特征在于所說點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣是在一塊平板上，頂部安置X軸的直線驅(qū)動裝置[1]，在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下驅(qū)動固定在X軸上的Y軸[2]作左右來回移動，而在Y軸也在微型步進(jìn)電機(jī)的控制下以相同的分辨率步距驅(qū)動連接在Y軸上的DNA樣本打印裝置[3]和打印針[7]作前后來回移動，這樣，兩個(gè)微型步進(jìn)電機(jī)和DNA打印頭分別在驅(qū)動程序的控制下，精確地作三維空間的定位和打印，將DNA送至指定的位置，并使點(diǎn)樣針[11]與玻片[4]接觸，在每一片玻片上相應(yīng)位置點(diǎn)樣，每次循環(huán)點(diǎn)樣后點(diǎn)樣針經(jīng)清洗、干燥裝置[5]、[6]作清洗、干燥處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中密度DNA(基因)芯片的制作方法其特征在于DNA點(diǎn)樣的密度在每平方厘米100至1000個(gè)點(diǎn)，作為芯片的載體是氨基或醛基修飾的玻璃片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種中密度DNA(基因)芯片的制作方法其特征在于所說點(diǎn)樣針采用陶瓷針，針尖直徑在0.1mm～0.3mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種中密度DNA(基因)芯片的制作方法其特征在于所說的點(diǎn)樣針清洗、干燥裝置[5]、[6]是利用負(fù)壓抽吸的原理完成DNA點(diǎn)樣針[11]的清洗和干燥，當(dāng)接通負(fù)壓裝置如真空泵后，干燥孔形成高速氣流[8]，當(dāng)針接近時(shí)，由于強(qiáng)烈氣流，殘余在針尖上的水分被快速吸走，而在清洗時(shí)，由于針的接近，封閉了清洗孔的空氣通路，清洗室[9]內(nèi)壓力驟降，清洗緩沖液[10]被高速吸出，噴淋在DNA點(diǎn)樣針上，噴淋的時(shí)間由電腦程序控制。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中密度DNA(基因)制作方法。它是先將待檢測的DNA序列找出,并進(jìn)行探針的合成,合成后在5’末端進(jìn)行活性基團(tuán)的修飾,然后啟動DNA點(diǎn)樣裝置,將DNA送至指定的位置,并使點(diǎn)樣針與玻片接觸;在一組玻片的相應(yīng)位置循環(huán)點(diǎn)樣,制作100～1000探針/cm
文檔編號G01N33/50GK1273362SQ9910466
公開日2000年11月15日 申請日期1999年5月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月6日
發(fā)明者楊夢甦, 繆金明 申請人:楊夢甦