專利名稱：用于同時診斷乙型和丙型肝炎的診斷試劑盒和診斷方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒以及采用所述的診斷試劑盒的診斷方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原的用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒，以及采用所述試劑盒的診斷方法。
背景技術：
一般說來，已知病毒誘發(fā)的肝炎是由各種肝炎病毒引起的，這些病毒包括甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨細胞病毒和Epstein-Barr病毒。
在這些病毒中，乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝DNA病毒并已知可引起包括肝癌在內的各種肝病。HBV具有3.2kb雙鏈DNA，其包括編碼包膜蛋白的S基因、編碼核心蛋白的C基因、編碼DNA聚合酶的P基因和編碼未鑒別的X蛋白的X基因組成的4個開放讀框(Garnem，D.等人，Ann.Rev.Biochem.，50,651-693(1987))。
包括HBV表面抗原、核心抗原和e抗原的HBV抗原已被用于診斷乙型肝炎，其是通過在HBV感染后檢測血清中形成的抗體而進行。特別是核心抗原對于在初始階段檢測乙型肝炎很有用，因為抗核心抗原抗體在感染HBV后很快就會形成并且在幾乎每一個被HBV感染的病人的血清中都可檢測到；而且，表面抗原在確定乙型肝炎是否痊愈方面很有用，因為在乙型肝炎的恢復階段發(fā)現(xiàn)有抗表面抗原抗體。
另外，已知在輸血引起的肝炎中的70-80％是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的(Alter，H.J.等人，Lancet 2，838-841(1975)；Dienstag，J.L.等人，Seminar Liver Dis.，6，67-81(1986))；而且這種輸血后肝炎通常會發(fā)展成肝硬化或肝細胞癌。所述的病毒是一種由一條RNA正鏈組成的RNA病毒并且由所述鏈的開放讀框(ORF)產生一多蛋白前體(Choo，Q.L.等人，Science，244,359-362(1989)；Choo，Q.L，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88,2451-2455(1991))。
丙型肝炎病毒的基因結構與黃病毒或瘟病毒的基團結構相似(Miller，R.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，87,2057-2061(1990)；Muraiso，K.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,172,511-516(1991))，并且以所述的關系為基礎，推測丙型肝炎病毒的多蛋白從N末端到C末端依次由核心-包膜1(E1)-包膜2/非結構1蛋白(E2/NS1)-非結構2蛋白(NS2)-非結構3蛋白(NS3)-非結構4蛋白(NS4)-非結構5蛋白(NS5)(Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88,2451-2455(1991)；Takamizawa.A.等，J.Virol.65,1105-1113(1991)；Kato，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,6524-6528(1990))。
丙型肝炎病毒的感染可以通過用聚合酶鏈反應(PCR)直接從血樣中檢測丙型肝炎病毒RNA而進行診斷(Hosoda，K.等，Hepatology，15,777-781(1992)；Abe，K.，等，Hepatology，15，690-695(1992)；Alter，H.J.，Annals ofInternal Medicine 115，644-649(1991))，通過這種方法可以很容易地檢測病毒RNA，即在感染后1到2星期內即可檢測；然而由于需分析大量的樣品，因此這種方法費用高，時間長。另一種診斷方法是例如通過使用C100-3蛋白的酶聯(lián)免疫測定檢測存在于血清樣品中的抗丙型肝炎病毒抗體(Choo，Q.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，2451-2455(1991)；Kuo，G.等，Science，244，362-384(1989))。
然而，Contreras等人指出所述的使用ELISA的診斷方法對于患有除丙型肝炎以外的肝病，例如膽汁型肝硬化、自身免疫病、原因不明的肝硬化等的病人的血清經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性結果(Contreras，M.等，Lancet，2，505(1989)；Cash J.D.等，Lancet，2，505(1989))。Theilmann等人報道當用Ortho Diagnostic SystemsInc.的第一代診斷試劑和診斷方法診斷時，超過60％的患有類風濕關節(jié)炎的病人顯示出HCV陽性信號(Lancet，335，1346(1990))。上述結果意味著使用ELISA的診斷方法可能會顯示假陽性結果，因此也需要進行確證試驗。
另外，美國的Chiron Co.和OrthoDiagnostic Inc.開發(fā)出一種采用重組免疫印跡測定法。(RIBA)確證用ELISA獲得的診斷結果的改進的診斷方法，其中所述的改進的診斷方法包括將兩個HCV特異性抗原SOD-5-1-1和SOD-C100-3印到硝酸纖維素膜上，使所述的抗原與取自丙型肝炎患者的血清反應，使抗原-抗體復合物與用過氧化物酶標記的抗人類IgG抗體反應，然后以每一抗原帶的顏色強度為基礎確定在血清中抗HCV抗體的存在與否。Baudart等人報道在取自副蛋白血癥(paraproteinemia)病人的184個血清試樣中用ELISA方法診斷出有28個試樣呈HCV陽性，然而當用上述RIBA方法確證陽性血清試樣時，只有1個試樣診斷為陽性，3個試樣留待確定(Lancet，336，63(1990))。
美國的Ortho Diagnostic Systems Inc.也報道了對抗HCV抗體具有改善的靈敏性的第二代RI BA診斷試劑(RI BA II)，其是通過向預先存在的第一代診斷試劑中加入核心抗原C22-3和非結構3抗原C33C而制備的。Vallari等人報道使用包括所述的C22-3、C33C和C100-3蛋白的診斷試劑的斑點免疫印跡測定法比僅使用C100-3蛋白的方法檢測抗HCV抗體更早并且靈敏性更高(J.Clin.Microbiol.30(3)，552(1992))。
在大多數(shù)情況下，乙型肝炎和丙型肝炎是通過不同的診斷試劑盒和試樣分別診斷的，其費用高并需大量試樣，但現(xiàn)有方法的特異性和精確性卻不令人滿意。
本發(fā)明人致力于開發(fā)一種比現(xiàn)有的ELISA方法或RI BA方法具有更高的靈敏度和特異性的用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒和/或診斷方法。
本發(fā)明概述因此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用所述的診斷試劑盒同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種診斷試劑盒，.其包括包含丙型肝炎病毒的核心蛋白、非結構3蛋白、非結構4蛋白、非結構5蛋白和包膜蛋白一或多種抗原表位的一或多種HCV抗原蛋白，以及包含乙型肝炎病毒的核心蛋白和表面抗原蛋白的一或多種抗原表位的一或多種HBV抗原蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種使用本發(fā)明的診斷試劑盒的用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷方法。
附圖的簡要說明本發(fā)明的上述和其它目的和特點將通過下述結合附圖的優(yōu)選實施方案的描述而更加清楚，其中

圖1顯示了編碼KHCV CORE14蛋白的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽氨基酸序列；圖2描述了編碼KHCV897蛋白的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖3描述了編碼KHCV NS4蛋白的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖4分別表示了編碼KHCV EIG、KHCVE2A和KHCV E2E的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖5顯示了編碼KHCV NS5-1.2蛋白的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖6描述了HBV核心基因的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖7代表編碼一種HBV表面抗原的核苷酸序列，以及由其編碼的多肽的氨基酸序列；圖8示出了一種表達載體，用于表達與遍在蛋白基因融合的編碼KHCV CORE14蛋白和KHCV897蛋白的核苷酸序列；圖9A示出了在大腸桿菌細胞中分別表達編碼KHCN UBCORE14蛋白和KHCV UB897蛋白的核苷酸序列后的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)的結果；圖9B為使用丙型肝炎患者的血清對圖9A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖10示出了制備一種用于表達與遍在蛋白基因融合的編碼KHCV NS4E蛋白的核苷酸序列的表達載體的制備策略；圖11A示出了在大腸肝菌細胞中表達編碼KHCN UBNS4E蛋白的核苷酸序列后SDS-PAGE結果；圖11B為使用丙型肝炎患者的血清對圖11A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖12示出了用于連接編碼KHCV E1G、KHCV E2A和KHCV E2E的DNA片段和遍在蛋白基因，以及制備用于表達連接的DNA(UBE1E2 DNA)的表達載體的策略；圖13A為UB E1E2 DNA在大腸桿菌細胞中表達后的SDS-PAGE的結果；圖13B為使用丙型肝炎患者的血清對圖13A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖14示意性的示出了用于表達一種編碼包含遍在蛋白、KHCV NS4E蛋白和KHCV E1E2蛋白的UBNS4E1E2蛋白的重組DNA的表達載體的制備；圖15A為編碼UBNS4E1E2蛋白的重組DNA在大腸桿菌細胞中表達后的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結果；圖15B為使用丙型肝炎患者的血清對圖15A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖16示意性的示出了用于表達與遍在蛋白基因融合的編碼KHCV NS5-1.2蛋白的核苷酸序列的表達載體的制備；圖17A為編碼KHCV UBNS5-1.2蛋白的重組DNA在大腸桿菌細胞中表達后的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結果；圖17B為使用丙型肝炎患者的血清對圖17A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖18示意性示出了用于表達HBV CORE基因和一種遍在蛋白基因的融合基因(UB HBV CORE DNA)的表達載體的制備；圖19A為UB HBV CORE DNA在大腸桿菌細胞表達后的SDS-PAGE結果；圖19B為使用乙型肝炎患者的血清對圖19A的凝膠進行蛋白質印跡分析的結果；圖20示意性示出了用于在酵母細胞中表達編碼HBV表面抗原的DNA片段的表達載體的制備；圖21示出了編碼HBV表面抗原的DNA片段在酵母細胞中表達后的SDS-PAGE結果；以及圖22示出了使用本發(fā)明的診斷試劑盒、采用免疫印跡測定法對血清樣品的診斷結果。
本發(fā)明的詳細描述本文中所引述的所有文獻的全文均作為參考文獻。
本文中所用的下述術語應具有下述含意；術語“丙型肝炎病毒”是指引起非甲非乙型肝炎或丙型肝炎的病毒。術語HCV和丙型肝炎病毒在本文中可交替使用。
術語“Korean -1ype丙型肝炎病毒”或“KHCV”是指從韓國丙型肝炎患者中分離出來的一種新型HCV，其cDNA具有一個編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列的開放讀框，其中第842、849和853個氨基酸分別為苯丙氨酸、亮氨酸和蘇氨酸；或者為亮氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸。
術語“抗原表位”是指一種多肽的抗原決定簇，其能夠在免疫活性宿主體內引起免疫反應和/或能夠自身特異性的與一種互補抗體結構。本發(fā)明的抗原表位通常至少由6個氨基酸組成，優(yōu)選由7或8個氨基酸組成。
本文中所用的其它術語具有與現(xiàn)有技術所用的相同的和傳統(tǒng)的含義。
下文中HCV cDNA的核苷酸序號或HCV蛋白的氨基酸序號是基于韓國專利公開出版物93-683號公開的全KHCV核苷酸序列或氨基酸序列。
以下將更詳細地描述本發(fā)明。1.HCV抗原蛋白的抗原表位的確定HCV，例如KHCV(KHCV-LBC1，于1991年5月14日保藏在ATCC，保藏號為ATCC 75008，根據(jù)關于用于專利程序的微生物的保藏的國際承認的布達佩斯條約，見韓國專利公開出版物93-683號)的cDNA的核苷酸序列的信息被用于合成聚合酶鏈反應的引物，其相應于編碼KHCV897蛋白、包膜1和包膜2蛋白或非結構5蛋白的cDNA片段的5’和3’末端。
用所述的引物以KHCV897基因(根據(jù)布達佩斯條約其在1991年6月27日被保藏于ATCC，保藏號為ATCC68640)、KHCV包膜基因(其在1991年12月11日被保藏于ATCC，保藏號為ATCC 68878、69866和74117)以及KHCV NS5基因(見韓國專利公開出版物93-683)為模板進行聚合酶鏈反應，以獲得KHCV897基因、KHCV包膜1和包膜2基因以及KHCV NS5基因的cDNA片段。將每一cDNA片段插入一個載體，用所述的表達載體轉化合適的宿主如大腸桿菌。將由轉化的宿主細胞生產的多肽進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后使用丙型肝炎患者的血清進行蛋白質印跡分析，以確定那些特異性地與KHCV抗體反應的多肽為KHCV抗原的表位。也檢測了被確定的抗原表位在KHCV cDNA全序列中的位置。
其結果是，發(fā)現(xiàn)KHCV897蛋白的抗原表位存在于KHCV897蛋白的羧基末端，其是從對應于KHCV cDNA的第4348到4713核苷酸的366個堿基對表達的(見圖2所示的KHCV897蛋白的抗原表位的氨基酸和核苷酸的序列)。
對于包膜蛋白，發(fā)現(xiàn)表位存在于KHCV包膜1蛋白(E1G蛋白)的羧基末端，其是從對應于KHCVcDNA的第1201到1509核苷酸的309個堿基對表達的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2A蛋白)的氨基末端，其是從對應于KHCV cDNA的第1510到1749核苷酸的240個堿基對表達的；以及存在于KHCV包膜2蛋白(E2E蛋白)的羧基末端，其是從對應于KHCV cDNA的第2281到2529核苷酸的249個堿基對表達的(見圖4示出的KHCV E1G、KHCV E2A和KHCV E2E蛋白的氨基酸序列和編碼這些蛋白的核苷酸序列)。
另外，NS5蛋白的抗原表位存在于NS5蛋白的氨基末端，其是由對應于包括KHCV403 cDNA片段的第6649到7284核苷酸的1200個堿基對編碼的，并以比KHCV403更高的靈敏度特異性地與KHCV患者的血清反應。
2、包括一或多個HCV抗原表位的重組蛋白HCV或HBV抗原的表位對于開發(fā)有效和經(jīng)濟的診斷試劑是非常重要的。具體說來，考慮到經(jīng)濟、效果及精確度更優(yōu)選的是包含一或多個抗原表位的融合蛋白；包含多于一個抗原表位的融合蛋白是最優(yōu)選的。
作為包含多于一個HCV表位的HCV重組蛋白，優(yōu)選的是可以包括含有KHCV核心蛋白和NS3蛋白的表位的重組KHCV CORE518融合蛋白，以及含有KHCV E1、E2和NS4蛋白的表位的重組KHCV NS4E1E2融合蛋白。
這些重組蛋白可以通過含有編碼所述的融合蛋白的核苷酸序列的各種表達載體系統(tǒng)進行制備；并且該載體可調控包含所述的融合蛋白和其它可增加蛋白表達率的特異性蛋白，優(yōu)選為遍在蛋白的重組融合蛋白的生產。包含遍在蛋白和KHCV融合蛋白的重組融合蛋白可以用于本發(fā)明的用途，只要其含有KHCV蛋白的必要特征例如HCV抗原性即可。
上述的表達體系可以有效地用于所需的蛋白不穩(wěn)定以及可被宿主細胞的蛋白酶很容易地消化的場合，因為遍在蛋白可保護所需的蛋白不被蛋白酶攻擊或穩(wěn)定所需的蛋白。另外，與遍在蛋白融合的所需重組蛋白的表達可以用抗遍在蛋白抗體確定，并利用遍在蛋白的特性而很容易地被純化。3、HBV抗原蛋白采用例如在韓國專利文獻90-5959中公開的乙型肝炎病毒cDNA的核苷酸序列信息制備乙型肝炎病毒核心抗原和表面抗原，這兩種抗原分別包含一或多種抗原表位。HBV核心抗原和表面抗原(Pre S2 S Ag)的氨基酸序列分別示于圖6和圖7。由于現(xiàn)在已知有許多類型的HBV，因此在每種類型的HBV中HBV核心抗原和表面抗原的氨基酸序列可能會有輕微差別，其也可以被本發(fā)明采用。
可以通過采用各種表達載體系統(tǒng)表達編碼一種HBV抗原蛋白的DNA片段來制備HBV抗原蛋白。編碼HBV抗原蛋白的DNA片段可以例如通過采用合成引物利用PCR來制備，該合成引物分別與編碼HBV核心抗原和表面抗原的cDNA片段的5’端和3’端對應。
HBV抗原蛋白可以以重組蛋白形式制備，該重組蛋白包含HBV抗原蛋白和其它可以增加蛋白穩(wěn)定性或促進純化步驟的特異性蛋白，優(yōu)選為上述第2項所述的遍在蛋白。4、抗原蛋白質在微生物宿主中的表達為了獲得所希望的包含HCV或HBV表位的HCV或HBV蛋白，用含有編碼HCV或HBV表位的HCV或HBV cDNA片段的表達載體轉化一相容宿主細胞；在允許表達的條件下培養(yǎng)轉化后的細胞。
合適宿主的選擇受一系列公知因素的影響，這些因素包括，例如與所選擇載體的相容性、由重組質粒編碼的蛋白的毒性，回收所希望蛋白的容易程度、蛋白質特性、生物安全性及費用。必須均衡考慮這些因素，應該理解的是不是所有的宿主都同等有效地表達特定的重組DNA分子。
本發(fā)明中可使用的合適的宿主包括，但不限于，細菌如大腸桿菌和酵母如釀酒酵母。
在宿主細胞中生產的多肽可以通過結合使用傳統(tǒng)方法，例如，細胞破碎，離心、透析、鹽析、層析、凝膠過濾、電泳和電洗脫來分離和純化。
本發(fā)明的多肽也可以通過合適的方法化學合成，如純粹固相合成，部分固相方法，片段縮合或經(jīng)典溶液合成。優(yōu)選的是由Merrifield(J.Am.Chem.Soc.，85，2149(1963))公開的固相合成。
另一方面，已知會發(fā)生基本上不會改變生物學和免疫學活性的在蛋白質中的氨基酸取代并由Neurath等人描述于The Proteins，Academic Press，New York(1979)。只要由其產生的蛋白質保持相同的抗原特性，則這種功能上等價的氨基酸取代也包括在本發(fā)明范圍內。
在本說明書中采用標準的單字母或三字母縮寫表示核苷酸和氨基酸。這些縮寫的含義可在標準的生物化學教科書如Lehninger，Principlesof Biochemistry，Worth Publishers Inc.New York，pp.96，798(1984)中找到。
5、用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒和方法根據(jù)本發(fā)明的診斷試劑盒包含至少一種含有一或多個HCV抗原表位的HCV抗原蛋白，優(yōu)選包括KHCV NS4E蛋白、KHCV E1G蛋白、KHCVE2A蛋白、KHCV E2E蛋白、KHCV COREEPI蛋白、KHCV518蛋白和KHCVNS5-1，2蛋白；以及至少一種包含HBV核心蛋白或表面抗原蛋白的一或多個抗原表位的HBV抗原蛋白。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試盒包括以重組蛋白形式存在的HCV或HBV抗原蛋白，其中抗原表位與另一種蛋白，優(yōu)選為遍在蛋白融合。
最優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑盒可以包含KHCVCORE14蛋白、KHCV UB897蛋白、KHCV UBNS4E蛋白、KHCV UBNS4E1E2蛋白、KHCV UBNS5-1，2蛋白、HBV CORE蛋白和HBVS2 S Ag蛋白。因此，本試劑盒由于其能夠檢測用其它已知診斷試劑盒不能檢測的HCV包膜蛋白的特異性抗體，所以其在檢測HCV時可以給出更精確的診斷結果。另外，在本發(fā)明試劑盒中也包含HBV CORE蛋白和HBVS2表面抗原這一點使得可以在診斷丙型肝炎的同時診斷乙型肝炎。
在本發(fā)明的診斷試劑盒中所包含的每種抗原蛋白的量可以任意地調整，優(yōu)選的是使用等摩爾量的每種蛋白。
在使用融合遍在蛋白抗原蛋白的情況下，遍在蛋白也包括在試劑盒中作為一對照蛋白。
另外，本發(fā)明的診斷試劑盒可以包含緩沖液、作為陽性對照的人免疫球蛋白、支持材料或其它可能需要的試劑，這取決于采用試劑盒的診斷方法。
對乙型肝炎和丙型肝炎的診斷可以通過用任何現(xiàn)有技術中公知的方法使用本發(fā)明的診斷試劑盒來進行，優(yōu)選的是用免疫印跡測定。
本發(fā)明還涉及一種通過用免疫印跡測定法利用本發(fā)明的診斷試劑盒的診斷方法。本發(fā)明的診斷方法在用于檢測肝炎患者的血清中的HBV和HCV抗體時比任何現(xiàn)存方法都更具有特異性和精確性，因此，其可以用作一種診斷丙型肝炎的診斷方法和確定丙型肝炎的試驗以及用作同時診斷HBV和HCV的診斷方法。
采用抗原蛋白的診斷方法可以包含下述步驟第一、將一或多種HBV抗原蛋白和一或多種HCV抗原蛋白加到一固體支持物上，例如硝酸纖維素濾膜或微升加樣孔，以使所述抗原蛋白吸附在所述材料的表面；第二、將用稀釋劑稀釋的一種待測樣品加到抗原復蓋的固體支持物上，若血清中存在HBV抗體或HCV抗體，則會形成抗原-抗體復合體；第三，向支持材料上加入一種酶，例如HRP(辣根過氧化物酶)，或堿性磷酸酶綴合的抗人IgG，以使該酶與在第二步形成的復合體中的抗體結合；以及最后，向所述材料上加入酶的底物，例如過氧化物酶的底物鄰苯二胺二鹽酸(OPD)和過氧化氫以出現(xiàn)顏色反應。當被測血清中含有HCV抗體或HBV抗體時，由于酶與底物的反應而會出現(xiàn)特定的顏色。
顏色深度可用光密度計或微孔閱讀器測量，以測定結果為基礎可確定HCV抗體或HBV抗體的存在。
第一步所用的固相支持體可包括硝酸纖維素濾膜、乙烯膜和immobilon PR，優(yōu)選為硝酸纖維素濾膜。HBV抗原蛋白可以混合或單獨地吸附到固體支持物上，HCV抗原蛋白也是如此。
優(yōu)選地，采用本發(fā)明的診斷試劑盒的診斷方法包含下述步驟(A)用一封閉溶液處理吸附有純化的人免疫球蛋白、KHCV UB CORE14蛋白、KHCVUB NS5-1，2、HBV CORE、HBVPre S2 S Ag和遍在蛋白的硝酸纖維素濾膜；(B)將封閉后的濾膜與一支持膜平行相貼，切割膜以制備濾膜條，該濾膜條包括可形成8條蛋白帶的等面積的每一個濾膜；(C)將所述的濾膜條與一待測血清樣品反應；(D)將(C)中所得的濾膜條與用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體反應；(E)加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物；以及(F)在(E)中獲得的濾膜條上呈現(xiàn)顏色反應后測定每一蛋白帶的顏色深度。
在使用包含多于一種抗原表位的本發(fā)明的重組蛋白來制備診斷試劑的情況下，其可以獲得比使用僅有一種抗原表位的現(xiàn)有抗原的情況更靈敏和更精確的診斷。另外，本發(fā)明的包含多于一種的包括多于一種HBV或HCV抗原表位的重組蛋白的診斷試劑盒顯示了優(yōu)異的診斷結果。
下述實施例是用于具體描述本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，除非另有說明，實施例中的實驗方法均根據(jù)下述的參考例而進行。
除非另有說明，下述的固固混合物的百分比、液液百分比和固液百分比分別以重量/重量、體積/體積和重量/體積為基礎。參考例1用限制性內切酶酶切DNA在一滅菌的1.5ml eppendorf管中加入限制性內切酶和反應緩沖液，使反應體積在50-100μl之間，反應在37℃進行1-2小時。反應完成后，將反應混合物在65℃熱處理15分鐘(或在耐熱內切酶情況下用苯酚抽提并用乙醇沉淀)以失活限制性內切酶。
本參考例中所用的限制性酶和反應緩沖液購自NEB(New Engand Biolabs，Jolla，MA，U.S.A.)。
用于限制性內切酶反應的10倍反應緩沖液的組成如下10×NEB反應緩沖液1100mMbisTris丙烷-HCl，100mMMgCl2，10mM二硫蘇糖醇(DTT)，pH7.010×NEB反應緩沖液2100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，500mMNaCl，10mM DTT，pH7.010×NEB反應緩沖液3100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1000mM NaCl，10mM DTT，pH7.010×NEB反應緩沖液4200mM Tris-乙酸，100mM乙酸鎂，500mM乙酸鉀，10mM DTT，pH7.0參考例2苯酚抽提和乙醇沉淀酶與DNA反應完成后，反應混合物用苯酚抽提以失活酶或回收反應混合物中的DNA，其中所用的苯酚預先用含10mM Tris-HCl(pH8.0)和1mM EDTA的緩沖液平衡。
苯酚抽提是如下進行的通過劇烈振蕩混合等體積的樣品和苯酚；在15000rpm離心混合物5分鐘；將水相轉移至一新管中。重復上述步驟三次。
然后用等體積的氯仿(氯仿∶異丁醇＝24∶1)抽提上述水相并再分離出水相；向水相中加入0.1體積的3M乙酸鈉和2.5體積的無水乙醇；在-70℃存放30分鐘或-20℃存放12小時以上后在15000rpm、4℃下離心混合物20分鐘以回收核酸。參考例3連接反應用購自NEB的T4DNA連接酶和10×連接反應緩沖液(0.5M Tris-HCl，pH7.0，0.1M MgCl2，0.2M DTT，10mMATP，0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA))進行DNA的連接反應。反應體積通常為20μl，DNA粘性末端連接用10單位T4連接酶，DNA平末端連接用100單位T4 DNA連接酶。
反應在16℃進行5小時或在4℃進行14小時以上，反應完成后，將反應混合物在65℃加熱15分鐘以失活T4DNA連接酶。參考例4轉化E.coli
E.coli菌株(例如E.coli HB101(ATCC33694)，E.coli W3110(ATCC27325)成E.coli JM105(ATCC47016))的轉化是采用現(xiàn)有技術中公知的方法，例如，Maniatis等人在Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，N.Y.(1982)中所述，或Cohen在Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A69,2110(1972)中所述。參考例5寡核苷酸的合成使用自動固相亞磷酰胺化學法利用一DNA合成儀(Applied Biosystems Inc.，型號380B，U.S.A.)合成寡核苷酸。
用變性聚丙烯酰胺凝膠(2M尿素，12％丙烯酰胺和bis(29∶1)，50mM Tris，，50mM硼酸，1mM EDTA-Na2)電泳和采用乙腈∶水(50∶50)作洗脫劑的C18SEP-PAK(Waters Inc.U.S.A)柱色譜純化合成的寡核苷酸；通過在260nm測量O.D.確定核苷酸的量。參考例6聚合酶鏈反應(PCR)在10-100ng模板DNA、10μl 10×Taq聚合酶反應緩沖液(10mm Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mMMgCl2，0.1％(w/v)明膠)、10μldNTP的混合物(dGTP、dATP、TTP和dCTP各為10mM)、2μg每個引物(通常反應中使用2個引物，當使用3個引物時位于中間的引物的用量為0.02μg)和0.5μl Ampli Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus，U.S.A.)組成的混合物中加入適量的蒸餾水以使總體積為100μl，向其中加入50μl礦物油以保護反應混合物不被蒸發(fā)。
采用一種熱循環(huán)儀(Perkin ElmerCetus，U.S.A.)進行PCR，熱循環(huán)被設成重復25次或更多；所述的循環(huán)為95℃1分鐘→55℃1分鐘→72℃2分鐘，最后在72℃反應10分鐘。
反應完成后用酚抽提混合物，用乙醇沉淀回收PCR產物，并將沉淀物溶于20μl TE緩沖溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5)。參考例7HRP綴合的抗人IgG抗體的制備用人IgG吸附的sepharose CL-4B親和柱和蛋白G柱(Pharmacia LKB，Sweden)色譜純化抗人IgG Fc區(qū)(Immunovision Inc.，Arizona，U.S.A.，Cat.No.GHF-1001)的抗體以使所述抗體的純度超過90％。根據(jù)Nakane等在J.Histochemcytochem.22，1084(1974)中所述的高碘酸鈉方法用辣根過氧化物酶標記所獲得的抗體，方法如下在溶于1.2ml蒸餾水(DW)的5mg辣根過氧化物酶(Boehringer Mannheim，Germany，Cat.No.814,393)的溶液中加入0.3ml溶于100mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)的0.1M高碘酸鈉溶液，混合物在室溫下反應20分鐘。得到的溶液對1mM乙酸鈉緩沖液透析16小時。
1.5ml得到的過氧化物酶溶液與以10mg/ml濃度溶有純化抗體的1ml 20mM碳酸鈉溶液(pH9.5)混合，混合物在室溫下反應2小時。隨后加入10μl溶于DW的硼酸氫鈉溶液(4mg/ml)以通過一還原反應除去未反應的席夫斯堿。由此得到的溶液對磷酸鹽緩沖的生理鹽水透析過夜，隨后過sephadex G-200柱以除去自由抗體或過氧化物酶。實施例1 制備KHCV UBCORE14和KHCV UB897蛋白<步驟1>KHCV CORE14和KHCV897 DNA的擴增(1-1)制備引物為了擴增KHCV CORE14和KHCV897 DNA(其分別由KHCV LBC1的第343-726核苷酸區(qū)和第3916-4713核苷酸區(qū)組成)和將它們克隆到在色氨酸啟動子控制下包含遍在蛋白基因的E.coli表達載體上，合成下列引物
PCOREUBI 引物5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTATGAGCACGAATCCTAAACC-3′在5’末端包含與遍在蛋白基因3’末端重疊的25個核苷酸，以及KHCV-LBC1的第343-360核苷酸；PSALCORE14 引物5′-GGGGTCGACTATTAGCATGTGAGGGTGTGGATGAC-3′在KHCV-LBC1的第726核苷酸之后含有一翻譯終止密碼子，以及一個SalI識別位點；PK897SAL 引物5′-GACTGGTCGACTATTAACACGTATTACAGTCGATCAC-3′在KHCV-LBC1第4713核苷酸后包含位于3′末端的兩個翻譯終止密碼子(TAATAC)，以及一SalI識別位點；PK897UBI 引物5′-CTTGGTGTTGAGACTCCGCGGTGGTGCGGTGGAATTCATACCCG-3′含有與遍在蛋白基因3’末端重疊的位于5’末端的25個核苷酸，以及設計用來從KHCV-LBC1第3916核苷酸起始翻譯的其它核苷酸。(1-2)聚合酶鏈反應試管A中加入2μg PCOREUB1引物和2μg PSALCORE14引物，試管B中加入2μg PK897SAL引物和2μg PK897UB1引物，每個試管中各加入50ng KHCV-LBC1 DNA(ATCC 75008)，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 2mM dNTP(12mM dGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mM dCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加入蒸餾水使總體積調至100μl。
向反應混合物中加入礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6中相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物上述(1-2)中獲得的產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實試管A中約384bp DNA被擴增，試管B中約897bp DNA被擴增，用與(1-2)相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化所述的DNA片段并分別命名為K384片段及K897片段。<步驟2>制備遍在蛋白基因(2-1)制備引物根據(jù)Ozkaynak等人在EMBO.J.，6，1429-1439(1987)中報道的遍在蛋白基因的信息設計下述3種不同的寡核苷酸并用一DNA合成儀合成UBIl5′-CCCCATATGCAAATTTTCGTCAAAACTCTAACAGGGAAGACTATAACCCTAGAGGTTGAATCTTCCGACACTATTGACAACGTCAA-3′UBI25′-TAGTTGCTTACCAGCAAAAATCAATCTCTGCTGATCCGGAGGGATACCTTCTTTATCTTTGAATTTTACTTTTGACGTTGTCAATAGTCTC-3′UBI35′-ACCACCGCGGAGTCTCAACACCAAGTGAAGAGTAGATTCCTTTTGGATGTTGTAGTCAGACAAGGTTCTACCATCTTCTAGTTGCTTACCAGCAAAAA-3′
UBI1設計成在5’末端具有NdeI識別位點(5’-CATATG-3’)并約有20個核苷酸與UBI2重疊；UBI2設計成具有SacII識別位點(5’-CCGCGG-3’)并且不會改變其所編碼的氨基酸序列。(2-2)制備遍在蛋白基因向2μg UBI1、0.02μg UBI2和2μg UBI3的混合物中加入1μl 10×PCR緩沖液、10μl 2mM dNTP混合物和2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水使總體積調至100μl，以與參考例6相同的方式進行PCR。將得到的混合物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離約240bp DNA，其被命名為Ub片段，將分離到的片段溶于20μl TE緩沖液。<步驟3>制備表達載體(3-1)聚合酶鏈反應準備2個試管，各含引物如下試管A2μg UBI1引物和2μg PSALCORE14引物；以及試管B2μg UBI1引物和2μg PK897SAL引物。
向試管A中加入50ng K384片段和50ng UB片段作為模板，向試管B中加入50ng K897片段和50ng UB片段作為模板，再各加入10μl 10×聚合酶緩沖液、10μl 2mMdNTP和2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水使總體積調至100μl，向每個反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次參考例6中的熱循環(huán)以進行PCR。(3-2)用限制性內切酶消化區(qū)段和載體DNA在NEB緩沖液3中用NdeI和SalI完全消化上述(3-1)中得到的每種PCR產物。
在試管A和試管B中獲得的片段分別被命名為KHCV UBCORE14和KHCV UB897。
在NEB緩沖液3中用PstI和SalI完全消化2μg ptrp 322H-HGH(見韓國專利公開91-457)，在NEB緩沖液4中用PstI和NdeI完全消化2μg該質粒。在0.7％瓊脂糖凝膠上分離產物，分離到約1.5kb和0.86kb的片段，分別命名為PL和PT片段。(3-3)連接使用上述(3-2)中制備的片段，進行如下連接反應連接試管A中加入100ng KHCV UBCORE14，連接試管B中加入100ng KHCVUB897。向每管中各加入100ng PL、100ng PT、2μl 10×連接緩沖液和10單位T4DNA連接酶，加入蒸餾水使總體積調至20l，反應在16℃進行12小時。分離每種連接后的載體，用其轉化大腸桿菌HB101(ATCC33694)，分離含有UBCORE14片段的載體并命名為ptrpH-UB-CORE14，分離含有KHCV UB897片段的載體并命名為ptrpH-UB-KHCV897。<步驟4>KHCV UB CORE14 DNA和KHCV UB897·DNA的表達用上述<步驟3>制備的每種質粒轉化E.coli W3110(ATCC37339)細胞，其中用ptrpH-UB-KHCV897轉化的E.coli W3110于1991年6月27日在ATCC保藏，保藏號為ATCC69640；用ptrpH-UB-CORE14轉化的E.coli W3110于1991午7月1日在ATCC保藏，保藏號為ATCC68642，以上保藏是根據(jù)關于國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約進行的。
用質粒ptrpH-UB-CORE14和ptrpH-UB-KHCV897轉化的E.coli W3110(ATCC37339)在含有50μg/ml氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基(6％Bacto胰化蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中于37℃振蕩培養(yǎng)12小時。將5ml培養(yǎng)物接種到1l M9培養(yǎng)基(40mM K2HPO4，22mM KH2PO4)，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1％葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4％酪蛋白水解物，10μl/ml維生素B1，40μg/ml氨芐青霉素)中，于37℃振蕩培養(yǎng)3-4小時。當其650nm處OD值到達0.5時，向培養(yǎng)物中加入吲哚丙烯酸(IAA)使終濃度為1.4mM，5小時后以3000rpm離心所得培養(yǎng)物25分鐘以收集E.coli細胞沉淀物。<步驟5>用丙型肝炎患者血清確定表達蛋白及其反應性將上述<步驟4>中得到的每種細胞沉淀物懸浮于緩沖液中然后采用Laemmli方法(Nature，227,680(1970))進行15％SDS-PAGE以確定KHCV UB CORE14和KHCV UB897蛋白的表達。結果示于圖9A中。
圖9A中，泳道M代表標準分子量標記，即從上到下依次為72、43、29和18千道爾頓；泳道1為具有不含KHCV基因的質粒的E.coli的產物；泳道2為用ptrpH-UB-CORE14轉化的Ecoli的產物，其中產有約23kd的蛋白；泳道5為用ptrpH-UB-KHCV897轉化的E.coli的產物，其中產有約40kd的蛋白；泳道3、4和6示出了其它的KHCV蛋白。
根據(jù)Towbin在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，76，4750(1979)中所述的方法將在凝膠上分離的蛋白印到硝酸纖維素濾膜(Bio-Rad Lab.，孔徑0.22μm，CA，U.S.A)上。將濾膜放入含0.2％Tween20的PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，0.15M NaCl)中，并在室溫下振蕩2小時以阻斷IgG與蛋白的非特異性結合。將濾膜放入一IgG溶液中，該溶液是通過用200倍體積的含0.5％明膠和0.05％Tween20的PBS稀釋從韓國HCV患者中純化的IgG(8.2mg/ml)而制備的；在室溫溫和振蕩1小時以使蛋白和IgG反應。隨后用含0.2％Tween20的PBS洗濾膜4次，每次5分鐘。將濾膜放入一抗人IgG抗體溶液中，該溶液是通過用200倍體積的含0.5％明膠和0.05％Tween20的PBS稀釋用辣根過氧化物酶(Bio-Rad Lab.，CA，U.S.A.)標記的山羊抗人IgG而制備的；在室溫下振蕩1小時。用含0.2％Tween20的PBS洗濾膜4次，每次5分鐘，然后用50mM Tris緩沖液(pH7.0)洗兩次。
向濾膜加入含有400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％過氧化氫的50mM Tris緩沖液以產生顏色反應。由上述蛋白質印跡分析所得的結果示于圖9B，圖B中每條泳道的樣品與圖9A相同。
結果證實在重組E.coli中產生的蛋白特異性地與KHCV抗體結合。<步驟6>轉化KHCV UBCORE14蛋白和KHCV UB897蛋白<步驟6-A>純化KHCV UBCORE14蛋白(6-A-1)破碎細胞和除去可溶性蛋白將在<步驟4>中獲得的4g E.coli細胞沉淀物懸浮于20ml 4℃緩沖液1(50mM Tris，pH7.5，5mM EDTA，10mM β—巰基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑胃酶肽A)中，向懸浮物中加入4mg溶菌酶，在冰上攪拌混合物30分鐘，然后在冰浴上用一能率循環(huán)輸出為80％和50％的超聲處理器(HEAT SYSTEMS ULTRASONIC INC.，W225,U.S.A.)超聲處理20分鐘以破碎細胞并獲得E.coli細胞勻漿。(6-A-2)用尿素處理在12000rpm下用離心機(BeckmanJ2-21，Rotor JA20)離心(6-A-1)中獲得的細胞勻漿20分鐘以除去不溶性沉淀物，獲得上清。
向上清中加入9M尿素使終濃度為8M，在室溫下攪拌所得物12小時。(6-A-3)用酸處理向(6-A-2)中得到的溶液中加入1M乙酸鈉(pH4.5)以使終濃度為10mM，隨后加入1M乙酸調節(jié)pH為5.0，室溫攪拌1小時。用離心機(Beckman J2-21，ROtor JA14)在11000rpm下離心溶液以除去沉淀，獲得上清。(6-A-4)CM離子交換層析在(6-A-3)中獲得的含KHCV UB-CORE14蛋白的溶液以1ml/分鐘的流速過用緩沖液2(8M尿素，1mM EDTA，100mMβ-巰基乙醇和10mM乙酸鹽，pH5.0)平衡的含25ml CM-Sepharose樹脂(Pharmacia，Sweden)的柱(2.5cm×10cm)，用所述的緩沖液充分洗滌以自由形式留在柱中的物質，隨后以3ml/分鐘的流速加入500ml氯化鈉濃度梯度為0-0.5M的上述緩沖液2以洗脫結合蛋白，將洗脫物進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，顯示KHCV UBCORE14蛋白在約0.3M濃度下被洗脫，收集含KHCV UBCORE14的組分用于下一步驟。(6-A-5)S-200凝膠滲透層析用YM5超濾膜(Amicon，U.S.A.)將(6-A-4)中收集的組分濃縮至10ml，濃縮物以0.5ml/分鐘的流速通過用含6M尿素，1mMEDTA和1mMβ-巰基乙醇的PBS溶液平衡的S-200 Sephacryl柱(2.5cm×100cm，Pharmacia，Sweden)以根據(jù)分子量分離蛋白，將蛋白組分進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，收集含KHCV UBCORE14的組分。(6-A-6)Mono-S層析用相同體積的緩沖液3(6M尿素，1mMEDTA，1mMβ-巰基乙醇和10mM磷酸鹽，pH7.0)稀釋(6-A-5)中獲得的含KHCV UBCORE14蛋白的組分，隨后通過用緩沖液A平衡的FPLCMono-S柱(HR5/5，Pharmacia，Sweden)，用所述的緩沖液A洗柱，然后以0.8ml/分鐘的流速逐漸加入含6M尿素，1mMEDTA，1mMβ-巰基乙醇，10mM磷酸鹽和0.4mM氯化鈉的緩沖液B，加量為前5分鐘加35％，以下55分鐘加70％，最后10分鐘加100％，以洗脫結合蛋白。當緩沖液B的用量達到60％，即氯化鈉濃度為0.25M時，KHCV UB-CORE14蛋白被洗脫。
將組分在4℃對PBS溶液進行透析，獲得4mg純度至少為90％的KHCV UB-CORE14蛋白。<步驟6-B)純化KHCV UB897蛋白(6-B-1)細胞破碎和除去可溶性蛋白4g由<步驟4>中獲得的E.coli細胞沉淀物如<步驟6-A>的(6-A-1)所述進行處理以破碎細胞并從中獲得不溶性沉淀物。(6-B-2)用Triton X-100和Tris緩沖液洗不溶性沉淀物將(6-B-1)中得到的沉淀物懸浮于50ml含1％Triton X-100的緩沖液4(50mM Tris，pH8.5，5mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)中，室溫下攪拌懸浮液30分鐘并用離心機(Beckman J2-21，RotorJA14)在11000rpm離心25分鐘，除去上清，獲得不溶性沉淀物。隨后將沉淀重新懸浮于50ml緩沖液4中。再一次攪拌和離心懸浮液，棄去上清，得到不溶性沉淀物。
僅通過上述簡單的洗滌程序即可獲得純度至少為60％的KHCV UB897蛋白。(6-B-3)用8M尿素溶解不溶性沉淀物。
將在(6-B-2)中獲得的含KHCV UB897蛋白的不溶性沉淀物懸浮于50ml含8M尿素的緩沖液5(20mM磷酸鹽，pH6.0，2mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)中，室溫攪拌懸浮液1小時并離心棄去不溶性沉淀物，獲得上清。(6-B-4)S-Sepharose離子交換層析在(6-B-4)中獲得的上清通過用含4M尿素的緩沖液5平衡的S-Sepharose柱(Pharmaeia，F(xiàn)F，2.5cm×7cm，U.S.A.)，用600ml氯化鈉濃度梯度為0-0.2M的緩沖液洗脫，將蛋白組分進行SDS-PAGE，收集含高純度KHCV UB897蛋白的組分。(6-B-5)除去尿素及FPLC-Mono Q離子交換層析(6-B-4)中收集的含KHCV UB897蛋白的蛋白組分對緩沖液6(10mM Tris，pH8.5，2mM EDTA，2mMβ-巰基乙醇)透析以除去尿素，加樣至用所述緩沖液平衡的FPLCMono Q離子交換樹脂柱(Pharmacia，HR5/5)，用40ml含有氯化鈉濃度梯度為0-0.4M的緩沖液洗脫，收集含高度純化的KHCVUB897蛋白的組分，得到純度至少為90％的KHCV UB897蛋白。實施例2制備KHCV UB NS4E蛋白<步驟1>擴增KHCV NS4E DNA(1-1)制備引物為制備KHCV NS4E DNA(其由KHCV-LBC1的第5422-5547核苷酸區(qū)組成(并將其克隆至一在色氨酸啟動子控制下的含遍在蛋白基因的表達載體中，合成下列引物PNS4ET2引物5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′包含SacII識別位點和KHCV-LBC1的第5422-5442核苷酸；以及PNS4ESAL引物5′-AAAAAAGTCGACTATTACAACCCGAGCGCCTTCTGTTT-3′包含位于KHCV-LBC1第5547核苷酸后的翻譯終止密碼子，和一個SalI識別位點。(1-2)聚合酶鏈反應在一試管中加入2μg PNS4ET2引物和2μg PNS4ESAL引物，再加入50ng KHCV-LBC1 DNA (ATCC 75008)，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 2mMdNTP(2mM dGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mM dCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水調節(jié)總體積為100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物將上述(1-2)中獲得的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實約130bp DNA被擴增。如上所述用相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化DNA并命名為NS4E片段。<步驟2>制備表達載體在NEB緩沖液3中用SacII和SalI完全消化2μg ptrpH-UB-CORE14(ATCC68642，見韓國專利公開出版物93-683)，得到的混合物進行7％瓊脂糖凝膠電泳以分離2.7kb片段，其被命名為ptrpH-UB-T2/L片段。
另外，如參考例1所述在NEB緩沖液3中用SacII和SalI充分消化2μg上述<步驟1>的(1-3)中獲得的NS4E片段。
在一連接試管中加入100ng上述得到的DNA片段，同時加入50ng上述得到的ptrpH-UB-T2/L片段、2μl 10×連接緩沖液、10單位T4 DNA連接酶，加入蒸餾水使總體積調至20μl，在16℃進行連接反應12小時。
用連接混合物轉化E.coli W3110(ATCC37339)以獲得含有包含NS4E片段的ptrpH-UB-NS4E質粒的重組E.coli細胞(圖10)。<步驟3>制備KHCV NS4E蛋白用上述<步驟2>制備的質粒ptrpH-UB-NS4轉化E.coli W3110(ATCC37339)。
轉化后的E.coli細胞在含50μg/ml氨芐青霉素的液體Luria培養(yǎng)基(6％Bacto胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中于37℃振蕩培養(yǎng)12小時。將3ml培養(yǎng)物接種至300ml M9培養(yǎng)基(40mMK2HPO4，22mMKH2PO4，8.5mM NaCl，18.7mM NH4Cl，1％葡萄糖，0.1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4％酪蛋白水解物，10μg/ml維生素B1，40μg/ml氨芐青霉素)中，在37℃振蕩培養(yǎng)4小時，當在650nmOD值達到0.3時，向培養(yǎng)物中加入吲哚丙烯酸(IAA)使終濃度為50μg/ml，5小時后以11000rpm離心培養(yǎng)物25分鐘，收集E.coli細胞沉淀物。<步驟4>用丙型肝炎患者的血清確定UB NS4E蛋白的表達及其反應性用Laemmli方法(Nature227，680(1970))將上述<步驟3>獲得的細胞沉淀物進行15％SDS-PAGE，凝膠用考馬斯亮藍R250染色以確定重組蛋白的表達(圖11A)。在圖11A中，泳道1代表標準分子量標記物，泳道2-13示出了用質粒ptrpH-UB-NS4E轉化的E.coli產物，泳道14顯示了具有不帶任何KHCV DNA片段的質粒的E.coli產物。
將在凝膠上分離的蛋白用Towbin方法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，76,4750(1979))印到硝酸纖維素濾膜(Bio-Rad Lab.，孔徑0.22μm，CA.U.S.A.)上，將濾膜放入含0.5％Tween20的PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，0.15M NaCl)，在室溫輕搖2小時以阻斷IgG和蛋白的非特異性結合。將濾膜放入IgG溶液中，該溶液是通過用含0.5％明膠和0.05％Tween20的PBS稀釋從韓國HCV患者中純化的IgG至終濃度16μg/ml而制備的；在室溫溫和振蕩1小時以使蛋白和IgG反應。隨后用含0.2％Tween20的PBS洗濾膜4次，每次5分鐘。將濾膜放入抗人IgG抗體溶液中，該溶液是通過用500倍體積的含0.5％明膠和0.05％Tween20的PBS稀釋用辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG(山羊抗人IgG-HRP，Bio-RadLab.，CA.，U.S.A.)而制備的；在室溫振蕩1小時，用含0.2％Tween20的PBS洗濾膜4次，每次5分鐘；隨后用50mM Tris緩沖液(pH7.0)洗二次。向濾膜上加入含400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％過氧化氫的50mM Tris緩沖液以產生顏色反應。上述蛋白質印跡分析的結果示于圖11B，其中泳道1-4示出了用質粒ptrpH-UB-NS4E轉化的E.coli產物，泳道5顯示了含有不帶任何KHCV DNA片段的質粒的E.coli產物，泳道6示出了標準分子量標記物。<步驟5>純化UBNS4E蛋白(5-1)破碎細胞及除去不溶性蛋白將3g在上述<步驟3>中得到的E.coli細胞沉淀物懸浮于40ml緩沖液7(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mMβ-巰基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/ml抑胃酶肽A)中，向懸浮液中加入溶菌酶使終濃度為0.2mg/ml，將得到的溶液置于冰上30分鐘。得到物在冰浴中用能率循環(huán)輸出為80％和50％的超聲處理器進行15分鐘超聲處理以破碎細胞，得到E.coli細胞勻漿。
將上述得到的細胞勻漿在一離心機(BeckmanJ2-21，Rotor JA20)中以15000rpm離心25分鐘以除去不溶性沉淀物，獲得溶解蛋白。(5-2)DEAE-Sepharose離子交換層析向(5-1)中得到的蛋白溶液加入1M HCl調整溶液pH為9.0，得到以2ml/分鐘流速通過用緩沖液8(20mM Tris，pH9.0，1mM EDTA和1mMβ-巰基乙醇)平衡的DEAE-Sepharose柱，用同樣的緩沖液洗脫存留在柱中的自由蛋白。隨后以8ml/分鐘的流速加入300ml含有濃度梯度為0-0.4M的NaCl的緩沖液8以洗脫結合蛋白，每4ml組分收集洗脫液。將蛋白組分進行15％SDS-PAG E以收集含UBNS4E蛋白的組分。(5-3)S-200凝膠過濾層析用YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)濃縮(5-2)中收集的蛋白組分至體積為5ml，然后以1ml/分鐘的流速通過用PBS平衡的S-200樹脂柱(Pharmacia，2.5cm×90cm)，每3ml組分收集洗脫下來的蛋白并進行15％SDS-PAGE以收集含高純度UBNS4E蛋白的組分。(5-4)FPLC-phenyl-superose層析向(5-3)中收集的蛋白組分中加入NaCl至終濃度為2.0M，得到物以0.7ml/分鐘的流速通過用含2.0MNaCl的PBS平衡的FPLC-phenyl-superose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)，加入同樣的緩沖液以洗脫存留在柱中的自由蛋白。隨后加入40ml含線性濃度梯度為2.0M-OM的NaCl的PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0)以洗脫結合蛋白，每1.4ml組分收集洗脫液。
將蛋白組分進行15％SDS-PAGE以收集包含具有至少95％純度的UBNS4E蛋白的組分，用蛋白質印跡分析測定純化蛋白的抗原特異性。實施例3制備KHCV UBE1E2蛋白<步驟1>擴增KHCV E1E2 DNA(1-1)制備引物為了擴增包含HCV包膜蛋白抗原表位的KHCVE1E2基因并將其克隆至在色氨酸啟動子控制下的包含遍在蛋白基因的表達載體中，合成下列引物PE2ET2引物5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGTGAC-3′包含一個SacII識別位點和KHCV-LBC1的第2281-2298核苷酸；PE2EGE1G引物5′-TTCCTTCTTCTGGCGGACGCGGTTTCCCAGCTGTTCACCTTC-3′包含為E2E DNA3’末端區(qū)的KHCV-LBC1的第2509-2529核苷酸區(qū)，以及為E1G基因的5’末端區(qū)的KHCV-LBC1的第1201-1221核苷酸區(qū)；以及PE2AXHO引物5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′包含位于KHCV-LBC1第1749核苷酸之后的翻譯終止密碼子，以及一個XhoI識別位點。(1-2)聚合酶鏈反應在一試管中加入2μg PE2EGE1G引物和2μg PE2AXHO引物，同時加入50ngKHCV-LBC1 DNA(ATCC 75008)作為模板，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 2mM dNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mM TTP，2mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水使總體積調至100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6所述相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物將上述(1-2)中得到的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約550bpDNA被擴增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化該DNA并命名為GE1GE2A片段。(1-4)第二聚合酶鏈反應在一試管中加入2μg PE2ET2引物和2μg PE2AXHO引物，同時加入作為模板的50ng質粒pYLBC-A/G-UBE2C(ATCC74117，見韓國專利公開出版物93-683)和50ng GE1GE2A片段，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 2mM dNTP(2mMdGTP，2mM dATP，2mM TTP，2mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，向其中加蒸餾水使總體積調至100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次參考例6所述相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-5)分離和純化PCR產物將上述(1-4)中得到的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約800bp DNA被擴增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化所述的DNA并命名為E1E2片段。<步驟2>制備表達載體根據(jù)參考例1在NEB緩沖液3中用SacII和XhoI完全消化2μg(1-5)中得到的DNA片段。
在一試管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在實施例2的<步驟2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×連接緩沖液，10單位T4 DNA連接酶，加蒸餾水調整總體積為20μl，在16℃進行連接反應12小時。
用連接混合物轉化E.coli W3110(ATCC37339)獲得含有包含E1E2片段的質粒ptrpH-UB-E1E2的重組E.coli細胞(圖12)。<步驟3>表達KHCV UBE1E2蛋白用上述<步驟2>制備的質粒ptrpH-UB-E1E2轉化的E.coli W3110(ATCC37339)細胞以實施例2<步驟3>相同的方法進行培養(yǎng)，然后離心收集E.coli細胞沉淀物。<步驟4>用丙型肝炎患者的血清確定UBE1E2蛋白的表達及其反應性以實施例2的<步驟4>相同的方式用上述<步驟3>的細胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清證實了UBE1E2蛋白的表達及其反應性，結果示于圖13，其中A是SDS-PAGE結果，B是蛋白質印跡分析結果。
在圖13A和B中，泳道1和4為具有不帶任何KHCV DNA片段的質粒的E.coli產物；泳道2和5示出用ptrpH-UB-E1E2轉化的E.coli產物；泳道3為標準分子量標記物，即從凝膠上至下為43、29、18和14千道爾頓。<步驟5>純化UBE1E2蛋白(5-1)破碎細胞和除去可溶性蛋白將3g上述<步驟3>中獲得的E.coli細胞沉淀物如實施例2<步驟5>(5-1)所述進行處理以破碎細胞并從中獲得不溶性沉淀物。(5-2)洗滌不溶性沉淀物將(5-1)中獲得的沉淀物懸浮于40ml含1％Triton X-100的緩沖液8中，在室溫攪拌懸液30分鐘并在一離心機(Beckman J2-21，Rotor JA20)中以15000rpm離心25分鐘以除去溶解蛋白，獲得不溶性沉淀物。(5-3)用4M尿素和0.5％Triton X-100洗滌將(5-2)的不溶性沉淀物懸浮于100ml含8M尿素和0.5％Triton X-100的緩沖液9(20mM磷酸鹽，pH6.0，1mM EDTA和10mMβ-巰基乙醇)中，室溫攪拌懸液2小時并離心除去溶解蛋白，獲得不溶性沉淀物。(5-4)用1％SDS溶解沉淀物將(5-3)的不溶性沉淀物懸浮于10ml含1％SDS的PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，150mM NaCl)中，室溫下攪拌懸液12小時并離心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-5)S-200凝膠過濾層析用YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)將20ml(5-4)中得到的上清濃縮至4ml，隨后用一離心機(Beckman J2-21，Rotor JA21)在15000rpm離心25分鐘以除去不溶性沉淀物，得到上清。該上清以40ml/小時的流速通過用含1％SDS的PBS平衡的S-200樹脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)。每3ml組分收集洗脫下的蛋白并進行15％SDS-PAGE以收集包含純度至少為90％的UBE1E2蛋白的組分。實施例4制備KHCV NS4E1E2蛋白<步驟1>擴增NS4E1E2基因(1-1)制備引物為擴增編碼HCV包膜蛋白抗原表位的基因和KHCV NS4E DNA并將其克隆至一在色氨酸啟動子控制下的含遍在蛋白基因的表達載體中，合成下列引物。PNS4ET2引物5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATCATCCCCGATAGGGAAGTT-3′包含一個SacII識別位點和KHCV-LBC1的第5422-5442核苷酸；PNS4EGE2C3引物5′-CAGAAGGCGCTCGGGTTGCCAGGAGGAGGAGGTGGTACTCGGGGAGAGCGTTGT-3′.依次包含為NS4E DNA3’末端區(qū)的KHCV-LBC1第5530-5547核苷酸區(qū)，一個脯氨酸密碼子，六個甘氨酸密碼子，以及為E2E基因5’末端區(qū)的KHCV-LBC1第2281-2298核苷酸區(qū)；以及PE2AXHO引物5′-AAAAAACTCGAGTTACCACCCCTGCGCGAATGTATC-3′包含位于KHCV-LBC1第1749核苷酸之后的翻譯終止密碼子以及一個XhoI識別位點。(1-2)聚合酶鏈反應在一試管中放入2μg PNS4EGE2C-3引物和2μg PE2AXHO引物，再加入50ng作為模板的ptrpH-UB-E1E2(實施例3的<步驟2>)，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl2mM dNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水至總體積為100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止揮發(fā)，重復25次與參考例6相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物將上述(1-2)中得到的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約800bp DNA被擴增。用上述同樣的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化該DNA并命名為GENVEPI-III片段。(1-4)第二聚合酶鏈反應在一試管中放入2μg PNS4ET2引物和2μg PE2AXHO引物，再加入作為模板的50ng實施例2的<步驟2>中獲得的質粒ptrpH-UB-NS4E，50ng上述(1-3)獲得的GENVEPI-III片段，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl2mMd NTP(2mMd GTP，2mM dATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水至總體積為100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-5)分離和純化PCR產物將上述(1-4)獲得的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約920bp DNA被擴增，用上述同樣的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化該DNA并命名為NS4E1E2片段。<步驟2>制備表達載體如參考例1所述在NEB緩沖液3中用SacII和XhoI完全消化2μg<步驟1>的(1-5)中獲得的DNA片段。
在一試管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng實施例2<步驟2>中獲得的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl10×連接緩沖液，10單位T4 DNA連接酶，加蒸餾水至總體積為20μl，在16℃進行連接反應12小時。
用連接混合物轉化E.coli W3110(ATCC37339)以獲得含有包含NS4E1E2片段的質粒ptrpH-UB-NS4E1E2的重組E.coli細胞(圖14)。<步驟3>NS4E1E2 DNA片段的表達以實施例2的<步驟3>相同的方式培養(yǎng)帶有上述<步驟2>中制備的質粒ptrpH-UB-NS4E1E2的E.coli W3110(ATCC37339)轉化子，然后離心收集E.coli細胞沉淀物。<步驟4>用丙型肝炎患者的血清確定UBNS4E1E2蛋白的表達及其反應性以實施例2的<步驟4>相同的方式用上述<步驟3>的細胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清證實了UBNS4E1E2蛋白在E.coli中的表達及其反應性，結果示于圖15，其中A是SDS-PAGE結果，B是蛋白質印跡分析結果。
在圖15A和B中，泳道1和4為具有不帶任何KHCV DNA片段的質粒的E.coli產物；泳道2和5示出用ptrpH-UB-NS4E1E2轉化的E.coli產物；泳道3為標準分子量標記物，即從凝膠上至下為92、70、43、29和18千道爾頓。<步驟5>純化UBNS4E1E2蛋白(5-1)破碎細胞和除去可溶性蛋白將3g上述<步驟3>中獲得的E.coli細胞沉淀物如實施例2<步驟5>所述進行處理以破碎細胞并從中獲得不溶性沉淀物。(5-2)洗滌不溶性沉淀物將(5-1)中獲得的不溶性沉淀物如實施例3<步驟5>(5-2)所述進行處理以除去溶解蛋白，獲得不溶性沉淀物。(5-3)用4M尿素洗滌將(5-2)中的不溶性沉淀物懸浮于30ml含4m尿素的緩沖液2中，室溫攪拌懸液2小時并用一離心機(Beckman J2-21，Rotor JA21)在15000rpm離心以除去溶解蛋白；獲得不溶性沉淀物。(5-4)用6M鹽酸胍洗滌將(5-3)中的不溶性沉淀物懸浮于30ml含6M鹽酸胍的緩沖液2中，室溫攪拌懸浮液2小時并用一離心機(Beckman J2-21，RotorJA21)在15000rpm離心以除去溶解蛋白，獲得不溶性沉淀物。(5-5)用1％SDS溶解沉淀物將(5-3)的不溶性沉淀物懸浮于10ml含1％SDS的PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，150mM NaCl)中，室溫下攪拌懸液12小時并在一離心機(Beckman J2-21，Rotor JA21)中以15000rpm離心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-6)S-300凝膠過濾層析用YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)將10ml(5-5)中得到的上清濃縮至4ml，隨后用一離心機(Beckman J2-21，Rotor JA21)，在15000rpm離心25分鐘以除去不溶性沉淀物，得到上清。該上清以40ml/小時的流速通過用含0.1％SDS的PBS平衡的S-300樹脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)進行凝膠過濾層析。每2ml組分收集洗脫下的蛋白并進行15％SDS-PAGE以收集包含純度至少為90％的UBNS4E1E2蛋白的組分，純化蛋白的抗原特異性由蛋白質印跡分析得以證實。實施例5制備KHCV NS5-1.2蛋白<步驟1>擴增NS5-1.2DNA(1-1)制備引物為了擴增KHCV NS5-1.2DNA(其由KHCV-LBC1的第6649-7824核苷酸組成)并將其克隆至一在色氨酸啟動子控制下的含遍在蛋白基因的表達載體中，合成下列引物。PNS5T2引物5′-TGAGACTCCGCGGTGGTACGGGCATGACCACTGACAAC-3′包含一個SacII識別位點和KHCV-LBC1的第6649-6669核苷酸；以及PNS51.2SAL引物5′-AAAAAAGTCGACTATTACGCCTTCCCCTTCATCTCCTT-3′包含位于KHCV-LBC1第7824核苷酸之后的翻譯終止密碼子，以及一個SalI識別位點。(1-2)聚合酶鏈反應在一試管中加入2μg PNS5T2引物和2μg PNS51.2SAL引物，同時加入50ngKHCV-LBC1 DNA(ATCC75008)作為模板，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl2mMdNTP(2mMdGTP，2mMdATP，2mMTTP，2mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水使總體積調至100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6所述相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物將上述(1-2)中得到的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約1.3kbDNA被擴增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化該DNA并命名為NS5-1.2片段。<步驟2>制備表達載體根據(jù)參考例1在NEB緩沖液3中用SacII和SalI完全消化2μg<步驟1>(1-3)中得到的DNA片段。
在一試管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在實施例2的<步驟2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×連接緩沖液，10單位T4 DNA連接酶，加蒸餾水調整總體積為20μl，在16℃進行連接反應12小時。
用連接混合物轉化E.coli W3110(ATCC37339)獲得含有包含NS5-1.2片段的質粒ptrpH-UB-NS5-1.2的重組E.coli細胞(圖16)。<步驟3>表達NS5-1.2DNA片段用上述<步驟2>制備的質粒ptrpH-UB-NS5-1.2轉化的E.coli W3110(ATCC37339)細胞以實施例2<步驟3>相同的方式進行培養(yǎng)，然后離心收集E.coli細胞沉淀物。<步驟4>用丙型肝炎患者的血清確定UBNS5-1.2蛋白的表達及其反應性以實施例2的<步驟4>相同的方式用上述<步驟3>的細胞沉淀物用丙型肝炎患者的血清證實了UBNS5-1.2蛋白的表達及其反應性，結果示于圖17，其中A是SDS-PAGE結果，B是蛋白質印跡分析結果。
在圖17A和B中，泳道1為具有不帶任何KHCV DNA片段的質粒的E.coli產物；泳道2和3示出用ptrpH-UBNS5-1.2轉化的E.coli產物。<步驟5>轉化UBNS5-1.2蛋白(5-1)破碎細胞和除去可溶性蛋白將3g上述<步驟3>中獲得的E.coli細胞沉淀物如實施例2<步驟5>(5-1)所述進行處理以破碎細胞并從中獲得不溶性沉淀物。(5-2)洗滌不溶性沉淀物如實施例3的<步驟5>(5-2)所述處理(5-1)中得到的沉淀物以除去溶解蛋白，獲得不溶性沉淀物。(5-3)溶解不溶性沉淀物將(5-2)的不溶性沉淀物懸浮于100ml含8M尿素的緩沖液3(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA，10mMβ-巰基乙醇)中，室溫攪拌懸浮液1小時并離心除去不溶性沉淀物，得到上清。(5-4)DEAE-Sepharose離子交換層析(5-3)中獲得的上清以2ml/分鐘流速通過用上述緩沖液3平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，2.5cm×3cm)，用同樣的緩沖液洗脫存留在柱中的自由蛋白。隨后以8ml/分鐘的流速加入300ml含有濃度梯度為0-0.3M的NaCl的緩沖液3以洗脫結合蛋白，每4ml組分收集洗脫液。將蛋白組分進行15％SDS-PAGE以收集含UBNS5-1.2蛋白的組分。(5-5)S-300凝膠過濾層析用YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)濃縮(5-4)中收集的蛋白組分至體積為3ml，然后以10ml/小時的流速通過用含8M尿素的緩沖液3平衡的S-300樹脂柱(Pharmacia，1.2cm×120cm)，以0.5ml組分收集洗脫下來的蛋白并進行15％SDS-PAGE以收集含高純度UBNS5-1.2蛋白的組分。(5-6)FPLC-phenyl-superose層析將(5-5)中收集的蛋白組分過YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)以濃縮其體積至4ml。用一透折膜(Spectrum MedicalIndustries，Inc.M.W.截斷值6000-8000)將濃縮液對PBS(10mM磷酸鹽，pH7.0，15mM NaCl)透析以除去尿素。向溶液中加入NaCl至終濃度為1.5M，得到物以0.7ml/分鐘的流速通過用相同緩沖液平衡的FPLC-phenyl superose柱(Pharmacia，HR5/5，0.5cm×5cm)；加入相同的緩沖液以洗脫保留在柱中的自由蛋白。然后加入含線性濃度梯度為1.5M-0M的NaCl的PBS洗脫結合蛋白，并每0.7ml為一組收集洗脫物。將蛋白組分進行15％SDS-PAGE以收集包含純度至少為95％的UBNS5-1.2蛋白的組分；純化蛋白的抗原特異性用蛋白質印跡分析得以確證。實施例6制備HBVCORE蛋白<步驟1>制備引物為了擴增HBVCORE DNA(其為韓國型乙型肝炎cDNA(pHBVadr)的一部分，見韓國專利申請出版物90-5959)并將其克隆至色氨酸啟動子控制下的包含遍在蛋白基因的表達載體中，合成下列引物PCORET2引物5′-TGAGACTCCGCGGTGGTATGGACATTGACCCGTATAAA-3’包含一個SacII識別位點和HBVCORE DNA的第1-21核苷酸。PCORESAL 引物5’-AAAAAAGTCGACTATTAACATTGAGATTCCCGAGATTG-3′包含一個在HBVCORE DNA的3’末端終止翻譯的終止密碼子和一個SalI識別位點。(1-2)聚合酶鏈反應在一試管中加入2μg PCORET2引物和2μg PCORESAL引物，同時加入50ng pHBVadr作為模板，10μl 10×聚合酶緩沖液，10μl 2mM dNTP(2mM dGTP，2mM dATP，2mMTTP，20mMdCTP)，2.5單位Taq聚合酶，加蒸餾水使總體積調至100μl。
向反應混合物中加入50μl礦物油以防止蒸發(fā)，重復25次與參考例6所述相同的熱循環(huán)以進行PCR。(1-3)分離和純化PCR產物將上述(1-2)中得到的PCR產物進行5％聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果證實有約550bpDNA被擴增。用上述相同的聚丙烯酰胺凝膠電泳純化該DNA并命名為HBVCORE片段。<步驟2>制備表達載體根據(jù)參考例1在NEB緩沖液3中用SacII和SalI完全消化2μg上述<步驟1>的(1-3)中得到的DNA片段。
在一試管中放入100ng上述得到的DNA片段，再加入50ng在實施例2的<步驟2>中得到的ptrpH-UB-T2/L片段，2μl 10×連接緩沖液，10單位T4 DNA連接酶，加蒸餾水調整總體積為20μl，在16℃進行連接反應12小時。
用連接混合物轉化E.coli W3110(ATCC37339)獲得含有包含HBVCORE片段的質粒ptrpH-UB-HBVCORE的重組E.coli轉化子(圖18)。<步驟3>表達HBVCORE DNA用上述<步驟2>制備的質粒ptrpH-UB-HBVCORE轉化的E.coli W3110(ATCC37339)細胞以實施例2<步驟3>相同的方式進行培養(yǎng)，然后離心收集E.coli細胞沉淀物。<步驟4>用乙型肝炎患者的血清確定HBVCORE蛋白的表達及其反應性以實施例2的<步驟4>相同的方式用上述<步驟3>的細胞沉淀物用乙型肝炎患者的血清證實了UBHBVCORE蛋白的表達及其反應性，結果示于圖19，其中A是SDS-PAGE結果，B是蛋白質印跡分析結果。
在圖19中，泳道1為具有不帶任何HBVDNA片段的質粒的E.coli產物；泳道2和3示出用ptrpH-UB-HBVCORE轉化的E.coli產物。<步驟5>純化UB HBVCORE蛋白(5-1)破碎細胞和除去可溶性蛋白將3g上述<步驟3>中獲得的E.coli細胞沉淀物如實施例2<步驟5>(5-1)所述進行處理以破碎細胞并從中獲得不溶性沉淀物。(5-2)用6M尿素處理及DEAE-Sepharose離子交換層析向上述(5-1)中獲得的不溶性沉淀物中加入尿素至終濃度為6M，通過加入1M NaOH至終體積為280ml將懸液的pH調至9.0。
得到物以3ml/分鐘的流速通過用含6M尿素的緩沖液8平衡的DEAE-Sepharose柱(Pharmacia，1.25cm×5cm)，加入相同的緩沖液以洗脫存留在柱中的自由蛋白。隨后以3ml/分鐘的流速加入100ml具有濃度梯度為0-0.5M NaCl的緩沖液8以洗脫結合蛋白并每3ml一組收集洗脫物。蛋白組分進行15％SDS-PAGE以收集包含UB HBVCORE蛋白的組分。(5-3)S-300凝膠過濾層析上述(5-2)中獲得的蛋白組分用YM10超濾膜(Amicon，U.S.A.)濃縮至5ml體積，然后以1ml/分鐘的流速通過用緩沖液8平衡的S-300樹脂柱(Pharmacia LKB，2.5cm×90cm)。以3ml一組收集洗脫下來的蛋白并進行15％ SDS-PAGE以收集包含高純度UB HBVCORE蛋白的組分。(5-4)透析除去尿素使用一透析膜(Spectra/por，No.1，M.W.截斷值6000-8000)在4℃將上述(5-3)中收集的蛋白組分對緩沖液10(20mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，10mM β-巰基乙醇)進行透析以除去尿素，隨后離心以獲得含有純度至少為95％的UB HBVCORE蛋白的可溶性上清。實施例7制備HBV Pre S2 S Ag蛋白<步驟1>制備表達載體10μg包含HBV Pre S2 DNA的載體pLBC-PSAG14(見韓國專利出版物90-5959)在37℃用10單位限制性內切酶BamH處理1小時，然后進行1％瓊脂糖凝膠電泳以獲得含有編碼ADH2啟動子-前表面抗原-表面抗原-GAPDH終止子的DNA序列的BamHI盒。將該盒溶于20μl TE緩沖液，克隆至用BamHI酶切并用細菌堿性磷酸酶處理的pYLBC。根據(jù)Hinnen方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75，1929-1933(1978))轉化釀酒酵母X400-5B(Yeast Genetics Stock Center，U.S.A.)并從中分離重組表達載體pYPSAG100(圖20)。<步驟2>制備HBV Pre S2 S Ag蛋白用上述<步驟1>中得到的載體pYPSAG100轉化釀酒酵母X400-5B(Yeast Genetics Stock Center，U.S.A.)，轉化后的酵母在3ml亮氨酸缺陷培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含6.7g不含氨基酸的酵母氮源，182g山梨醇，2％葡萄糖，0.25g補加亮氨酸)于30℃培養(yǎng)24小時。
用一離心機(DYNAC，U.S.A.)在3000rpm離心培養(yǎng)物5分鐘，除去上清。沉淀物在5ml培養(yǎng)基(2％葡萄糖，1％酵母膏，2％Bacto蛋白胨)中振蕩8小時，在3000rpm離心培養(yǎng)物以除去上清，獲得沉淀物，將沉淀物在5ml YEPE培養(yǎng)基(5％乙醇，1％酵母膏，2％Bacto蛋白胨)中于30℃培養(yǎng)4小時以誘導乙型肝炎病毒的前表面抗原和表面抗原的表達。<步驟3>純化Pre S2 S Ag蛋白在一離心機(Beckman rotor JA4.2，U.S.A.)以3500rpm離心1l上述<步驟2>獲得的培養(yǎng)物10分鐘以收集酵母細胞沉淀物。細胞沉淀物溶于50ml緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5)，1mM EDTA，0.1％ Triton X-100,1mM苯甲基磺酰氟)中并向該懸液中加入等體積的直徑為0.45mm的玻璃珠，將得到的懸液劇烈振蕩3次，每次5分鐘，用一離心機(Beckman rotor JS-13，U.S.A.)在1500rpm離心得到物30分鐘，獲得上清。
上清通過與抗HBV表面抗原的單克隆抗體(CHII5-60，Lucky Central Research Institute)結合的Sepharose CL-4B親和柱(Pharmacia，U.S.A.)，其中該柱每克干Sepharose CL-4B含8mg單克隆抗體。通過洗脫緩沖液(10mM Tris，pH7.5，1MNaCl)充分洗柱以活化柱。以1ml/小時的流速加入含表面抗原的上清并用10mM Tris-1M NaCl緩沖液連續(xù)洗柱直至洗脫物的A280達到0。向柱中加入緩沖液(10mM Tris-HCl，pH7.5)以除去非特異性蛋白并調節(jié)洗脫物的A280為1。
當A280到達1時，加入緩沖液(3M NH4SCN，50mM Tris，pH7.5)以洗脫結合的表面抗原蛋白，并在A280的峰值處收集20ml洗脫下的組分，在4℃將該組分對4l緩沖液(50mM Tris，pH7.5)透析24小時。
用YM30超濾膜(Amicon，U.S.A.)將得到物濃縮至1ml，濃縮物過SepharoseCL-4B柱(1.5×90cm，Pharmacia Co.，U.S.A.)，通過以50ml/小時的流速加入緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH7.0以洗脫結合蛋白，并以每組2ml收集洗脫物。使用OszymeII(Abott Co.)測定每管并收集具有反應性的組分。向得到的溶液中加入CsCl2溶液以使其終濃度為1.2g/cm3，用一離心機(Beckman rotor 41Ti，U.S.A.)在35000rpm離心懸液24小時以獲得沉淀物。
采用Laemmli方法(Nature 227，680(1970))將沉淀物進行SDS-PAGE以收集含所述蛋白的組分(圖21)。實施例8制備免疫印跡分析試劑盒用印跡分析緩沖液(100mM碳酸鈉，pH9.5)稀釋5種HCV抗原蛋白(KHCV CORE14，KHCV NS4E，KHCV NS4E1E2，KHCV 897和KHCV NS5-1.2)，2種HBV抗原蛋白(HBV CORE和HBV Pre S2 S Ag)，遍在蛋白以及人免疫球蛋白G(hIgG)使其濃度如下hIg G5μg/ml和0.1μg/ml；KHCV CORE1410μg/ml；KHCV NS4E20μg/ml；KHCV NS4E1E210μg/ml；
KHCV89710μg/ml；KHCV NS5-1.220μg/ml；HBV CORE10μg/ml；HBV Pre S2 S Ag10μg/ml；以及UB5μg/ml。
將每種含抗原蛋白的稀釋液加到硝酸纖維素濾膜(Schliescher&Schuell，BA83，孔徑0.22μm，U.S.A.)的狹線(0.7×0.7mm)中，所述的狹線預先用一種狹線印跡裝置(Bio-Rad Lab.，Dot SF印跡裝置，Cat.No.170-6542，U.S.A.)浸上印跡緩沖液，隨后以下述順序和體積用相同的緩沖液洗一次狹線1hIgG 5μg/ml，250μl；狹線2KHCV CORE14 10μg/ml，250μl；狹線3KHCV NS4E 20μg/ml，125μl；以及KHCV NS4E1E2 10μg/ml，125μl；狹線4KHCV897 10μg/ml，250μl；狹線5KHCV NS5-1.2 20μg/ml，250μl；狹線6HBV CORE 10μg/ml，250μl；狹線7HBV Pre S2 S Ag 10μg/ml，250μl；狹線8UB 5μg/ml，250μl；以及狹線9hIgG 0.1μg/ml，250μl.
通過向硝酸纖維素濾膜上施加10-20分鐘的8-10Hg的真空壓力過濾蛋白溶液而將抗原蛋白印到硝酸纖維素濾膜上，向每一狹線中加250μl印跡緩沖液洗一次膜，并再進行一次過濾。
用一小鑷子取下硝酸纖維素濾膜并在60℃干燥約10分鐘。將干燥后的硝酸纖維素濾膜放入含0.1％明膠的由磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，在室溫輕搖30分鐘以阻斷蛋白與自由印跡位點的非特異性結合。在上述相同條件下干燥處理后的濾膜，隨后以合適的方法編號或結合于標有編號的支持體上。將濾膜切成包含所有狹線的濾膜條，每條含有一種抗原蛋白。實施例9使用免疫印跡試劑盒進行診斷將上述實施例8中制備的每條濾膜條放入一玻璃管(13×100mm)中，向管中加入含有5μg/ml UB的、用PBS(0.25％明膠，1％Triton X-100，1mM EDTA和0.02％Thimerosal)稀釋50倍的血清樣品直至完全浸沒濾膜條。將管用parafilm膜封口并在室溫輕微振蕩2小時以使濾膜條上的抗原與血清樣品中的抗體反應。
用一吸取裝置從玻璃管中除去血清，向每個玻璃管中加入4ml洗滌溶液(包含0.05％Tween20的PBS)洗一次濾膜條，振蕩管約4分鐘，隨后除去洗滌溶液。
將10個濾膜條收集在一含20ml洗滌溶液的反應皿中并用洗滌溶液洗3次。向反應皿中加入含10μg/ml UB的20ml用辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG抗體(山羊抗hIgG(γ)-HRP)，所述的抗體用5-7μg/ml酶標抗體稀釋劑(含10％胎牛血清、1％Ficoll，0.05％Tween20，0.02％Thimerosal的PBS)稀釋。
得到物在室溫輕微振蕩40分鐘以發(fā)生反應，并每次用20ml所述的緩沖液洗滌，共洗四次，然后每次用20ml反應緩沖液(50mM Tris，pH7.5)洗滌，共洗2次。向其中加入20ml含400μg/ml 4-氯-1-荼酚和0.03％過氧化氫的反應緩沖液，并在室溫輕微振蕩20分鐘以發(fā)生反應。
除去反應緩沖液后，膜用蒸餾水洗2次，轉移至吸收紙上并室溫干燥20分鐘，可見色帶示出在濾膜條中。
結果示于表1，其中樣品1-18號示出了被Ortho診斷試劑盒診斷為陽性的結果，樣品19-21號示出了用取自乙型肝炎患者的血清獲得的結果。
表1
實施例10測試結果的判斷通過比較每種抗原蛋白與兩種對照的顏色深度，如下判斷上述測試結果。
1)首先，檢查在帶1和帶9中hIgG上是否存在顏色以及在帶8中遍在蛋白上是否不存在顏色。
2)以色度為基礎示出每條帶的反應性如下在每條帶上的色度 反應性0 -小于帶9中hIgG的色度+/-類似于帶9中hIgG的色度 1+在帶1和帶9中hIgG的色度之間 2+大于帶1中hIgG的色度3+3)根據(jù)上述2)的指示，如下判斷測試樣品反應性 判斷1+或更高 陽性-或+/- 陰性1+或更高但帶8中的UB的色度為1+或更高 待定4)在乙型肝炎情況下，如果HBVCORE和HBV Pre S2 S Ag帶均為+或者只有HBV Pre S2 S Ag帶為+，則該患者被認為正處于乙型肝炎恢復期，如果只有HBVCORE帶為+，則認為患者正患有急性乙型肝炎。
根據(jù)上述標準的判斷結果示于表1中，在被Ortho第一代診斷試劑盒診斷為陽性的18種血清樣品中，用Lucky Ltd.的ELISA方法(韓國專利出版物93-683)診斷僅有5種樣品呈陽性，一種樣品為未定；而用本發(fā)明的診斷試劑盒診斷有5種樣品呈陽性。
用Lucky Ltd.的ELISA方法診斷為中性的樣品4在用本發(fā)明的診斷試劑盒診斷時為陰性。
這些結果顯示本發(fā)明的診斷試劑盒比Ortho診斷試劑盒大大降低了假陽性結果，并可用于確證由ELISA診斷為陽性的血清樣品以降低假陽性診斷幾率。
另一方面，用本發(fā)明的診斷試劑盒和PCR測試了178種肝炎患者的血清樣品，有136種樣品被診斷為陽性，測試結果顯示于下表2。
表2<
>另外，用RIBAII(Orho Diagnostic Systems Co.，USA)診斷上述血清樣品，以證實上述測試結果。
其結果與用本發(fā)明的診斷試劑盒獲得的結果的比較示于下表3。
表3
如表3所示，在被PCR診斷為陽性的123種樣品中，用本發(fā)明的診斷試劑盒診斷結果相同，而用RIBAII(Ortho Diagnostic Sytems Co.)診斷有10種樣品為未確定。
這些結果顯示本發(fā)明的診斷方法能顯著降低錯誤診斷幾率并可同時診斷兩種肝炎，即丙型和乙型肝炎。
并且，由于本發(fā)明診斷試劑盒含有許多KHCV包膜蛋白、KHCV E1E2蛋白和KHCV NS5-1.2蛋白的抗原表位，所以有可能更精確地診斷HCV侵染。
盡管本發(fā)明已結合上述具體實施方案加以描述，但應理解的是對于本發(fā)明所作出的各種改進和變化對本領域人員來說是顯而易見的，并也包含在所附權利要求書限定的范圍內。
權利要求
1.一種用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒，其包含一或多種包括丙型肝炎的核心蛋白、非結構3蛋白、非結構4蛋白和包膜蛋白的一或多個抗原表位的丙型肝炎病毒抗原蛋白；以及，一或多種包括乙型肝炎的核心蛋白和表面抗原蛋白的一或多個抗原表位的乙型肝炎病毒抗原蛋白。
2.如權利要求1所述的診斷試劑盒，其包括一或多種選自由KHCV CORE14蛋白、KHCV897蛋白、KHCV NS4E蛋白、KHCV NS4E1E2蛋白和KHCV NS5-1.2蛋白組成的一組中的丙型肝炎病毒的抗原蛋白；以及，乙型肝炎病毒的CORE蛋白和/或Pre S2 S Ag蛋白，所述的蛋白具有如下氨基酸序列KHCV CORE14MetSerThrAsnProLysProGlnArgLysThrLysArgAsnThrAsnArgArgProGlnAspIleLysPheProGlyGlyGlyGlnIleValGlyGlyValTyrLeuLeuProArgArgGlyProArgLeuGlyValArgAlaThrArgLysThrSerGluArgSerGlnProArgGlyArgArgGlnProIleProLysAlaArgArgProGluGlyArgAlaTrpAlaGlnProGlyTyrProTrpProLeuTyrGlyAsnGluGlyLeuGlyTrpAlaGlyTrpLeuLeuSerProArgGlySerArgProSerTrpGlyProThrAspProArgArgLysSerArgAsnLeuGlyLysValIleAspThrLeuThrCys；KHCV897AlaValGluPheIleProValGluSerMetGluThrThrMetArgSerProValPheThrAspAsnProSerProProAlaValProGlnThrPheGlnValAlaHisLeuHisAlaProThrGlySerGlyLysSerThrArgValProAlaAlaTyrAlaAlaGlnGlyTyrLysValLeuValLeuAsnProSerValAlaAlaThrLeuGlyPheGlyAlaTyrMetSerLysAlaHisGlyIleAspProAsnLeuArgThrGlyValArgThrIleThrThrGlyAlaProIleThrTyrSerThrTyrGlyLysPheLeuAlaAspGlyGlyGlySerGlyGlyAlaTyrAspIleIleMetCysAspGluCysHisSerThrAspSerThrThrIleTyrGlyIleGlyThrValLeuAspGlnAlaGluThrAlaGlyAlaArgLeuValValLeuSerThrAlaThrProProGlySerValThrValProHisLeuAsnIleGluGluValAlaLeuSerAsnThrGlyGluIleProPheTyrGlyLysAlaIleProIleGluAlaIleLysGlyGlyArgHisLeuIlePheCysHisSerLysLysLysCysAspGluLeuAlaAlaLysLeuSerGlyLeuGlyLeuAsnAlaValAlaTyrTyrArgGlyLeuAspValSerValIleProThrSerGlyAspValValValValAlaThrAspAlaLeuMetThrGlyPheThrGlyAspPheAspSerValIleAspCysAsnThrCys；KHCV NS4EIleIleProAspArgGluValLeuTyrGlnGluPheAspGluMetGluGluCysAlaSerHisLeuProTyrPheGluGlnGlyMetGlnLeuAlaGluGlnPheLysGlnLysAlaLeuGlyLeu；KHCV E1GValSerGlnLeuPheThrPheSerProArgArgHisGluThrValGlnAspCysAsnCysSerIleTyrProGlyArgValSerGlyHisArgMetAlaTrpAspMetMetMetAsnTrpSerProThrThrAlaLeuValValSerGlnLeuLeuArgIleProGlnAlaValValAspMetValThrGlySerHisTrpGlyIleLeuAlaGlyLeuAlaTyrTyrSerMetValGlyAsnTrpAlaLysValLeuIleAlaMetLeuLeuPheAlaGlyValAspGlyThrThrHisValThrGly；KHCV E2AGlyAlaGlnGlyArgAlaAlaSerSerLeuThrSerLeuPheSerProGlyProValGlnHisLeuGlnLeulleAsnThrAsnGlySerTrpHisIleAsnArgThrAlaLeuSerCysAsnAspSerLeuAsnThrGlyPheValAlaAlaLeuPheTyrLysTyrArgPheAsnAlaSerGlyCysProGluArgLeuAlaThrCysArgProIleAspThrPheAlaGlnGlyTrp；KHCV E2EThrArgGlyGluArgCysAspLeuGluAspArgAspArgSerGluLeuSerProLeuLeuLeuSerThrThrGluTrpGlnValLeuProCysSerPheThrThrLeuProAlaLeuSerThrGlyLeuIleHisLeuHisGlnAsnIleValAspIleGlnTyrLeuTyrGlyIleGlySerAlaValValSerPheAlaIleLysTrpGluTyrIleValLeuLeuPheLeuLeuLeuAlaAspAla；KHCV NS5-1.2ThrGlyMetThrThrAspAsnValLysCysProCysGlnValProAlaProGluPhePheThrGluValAspGlyValArgLeuHisArgTyrAlaProAlaCysArgProLeuLeuArgGluGluValValPheGlnValGlyLeuHisGlnTyrLeuValGlySerGlnLeuProCysGluProGluProAspValAlaValLeuThrSerMetLeuThrAspProSerHisIleThrAlaGluThrAlaLysArgArgLeuAlaArgGlySerProProSerLeuAlaSerSerSerAlaSerGlnLeuSerAlaProSerLeuLysAlaThrCysThrThrHisHisAspSerProAspAlaAspLeuIleGluAlaAsnLeuLeuTrpArgGlnGluMetGlyGlyAsnIleThrArgValGluSerGluAsnLysValValIleLeuAspSerPheAspProLeuArgAlaGluAspAspGluGlyGluIleSerValProAlaGluIleLeuArgLysSerArgLysPheProProAlaLeuProIleTrpAlaProProAspTyrAsnProProLeuLeuGluSerTrpLysAspProAspTyrValProProValValHisGlyCysProLeuProProThrLysAlaProProIleProProProArgArgLysArgThrValValLeuThrGluSerThrValSerSerAlaLeuAlaGluLeuAlaThrLysThrPheGlySerSerGlySerSerAlaIleAspSerGlyThrAlaThrAlaProProAspGlnAlaSerGlyAspGlyAspArgGluSerAspValGluSerPheSerSerMetProProLeuGluGlyGluProGlyAspProAspLeuSerAspGlySerTrpSerThrValSerGluGluAlaSerGluAspValValCysCysSerMetSerTyrThrTrpThrGlyAlaLeuIleThrProCysAlaAlaGluGluSerLysLeuProIleAsnProLeuSerAsnSerLeuLeuArgHisHisAsnMetValTyrAlaThrThrSerArgSerAlaGlyLeuArgGlnLysLysValThrPheAspArgLeuGlnValLeuAspAspHisTyrArgAspValLeuLysGluMetLysAlaLysAla；HBVCOREMetAspIleAspProTyrLysGluPheGlyAlaSerValGluLeuLeuSerPheLeuProSerAspPhePheProSerIleArgAspLeuLeuAspThrAlaSerAlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHisHisThrAlaLeuArgGlnAlaIleLeuCysTrpGlyGluLeuMetAsnLeuAlaThrTrpValGlySerAsnLeuGluAsPProAlaSerArgGluLeuValValSerTyrValAsnValAsnMetGlyLeuLysIleArgGlnLeuLeuTrpPheHisIleSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrValLeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrpIleArgThrProProAlaTyrArgProProAsnAlaProIleLeuSerThrLeuProGluThrThrValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThrProSerProArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgArgArgSerGlnSerArgGluSerGlnCys；andHBV preS2 sAgMetGlnTrpAsnSerThrThrPheHisGlnAlaLeuLeuAspProArgValArgGlyLeuTyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyThrValAsnProValProThrThrAlaSerProIleSerSerIlePheSerArgThrGlyAspProAlaProAsnMetGluSerThrThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArgIleLeuThrIleProGlnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlyAlaProThrCysProGlyGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProIleCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPheIleIlePheLeuPheIleLeuLeuLeuCysLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuLeuProGlyThrSerThrThrSerThrGlyProCysLysThrCysThrIleProAlaGlnGlyThrSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProSerAspGlyAsnCysThrCysIleProIleProSerSerTrpAlaPheAlaArgPheLeuTrpGluTrpAlaSerValArgPheSerTrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheAlaGlyLeuSerProThrValTrpLeuSerValIleTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrAsnIleLeuSerProPheLeuProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpValTyrIle.
3.如權利要求1所述的診斷試劑盒，其中，所述的丙型肝炎病毒抗原蛋白或乙型肝炎病毒抗原蛋白是一種重組蛋白，其中的抗原表位與另一種蛋白質融合在一個多肽分子中。
4.如權利要求3所述的診斷試劑盒，其中所述的另一種蛋白為遍在蛋白。
5.如權利要求4所述的診斷試劑盒，其包含HCV抗原重組蛋白KHCV UBCORE14蛋白、KHCV UB NS4E蛋白、KHCV UB NS4E1E2蛋白、KHCV UB897蛋白和KHCV UBNS5-1.2蛋白；HBV抗原重組蛋白HBV核心蛋白和HBV Pre S2 S Ag；作為陰性對照蛋白的遍在蛋白；以及作為陽性對照蛋白的人免疫球蛋白。
6.通過采用如權利要求1-5任一項所述的診斷試劑盒同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷方法。
7.用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷方法，其包含下述步驟(A)用一封閉溶液處理分別吸收有純化人免疫球蛋白、KHCV UB CORE14蛋白、KHCVUB NS5-1.2、HBV CORE、HBVPre S2 S Ag和遍在蛋白的濾膜；(B)將封閉后的濾膜平行貼在一支持膜上，并切割該膜以制備一個濾膜條，其中包括等面積的每個濾膜以形成8條蛋白帶；(C)將濾膜條與一待測血清樣品反應；(D)將(C)中獲得的濾膜條與用辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的抗人IgG抗體反應；(E)加入一種辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的底物；以及(F)當(E)中獲得的濾膜條呈現(xiàn)顏色反應后測定每條蛋白帶的色度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒以及采用所述的診斷試劑盒的診斷方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種包括乙型肝炎和丙型肝炎病毒抗原的用于同時診斷乙型肝炎和丙型肝炎的診斷試劑盒，以及采用所述試劑盒的診斷方法。
文檔編號G01N33/576GK1122162SQ94191953
公開日1996年5月8日 申請日期1994年4月27日 優(yōu)先權日1993年4月28日
發(fā)明者曹重明, 崔德永, 金天炯, 蘇弘燮, 梁宰榮, 金仁壽, 崔東燮 申請人:株式會社樂喜