專利名稱：均三嗪類染料親和毛細(xì)管電泳柱及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種對(duì)一素列重要的酶，例如乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、已糖激酶、核糖核酸酶等具有很高選擇性的均三嗪類染料親和毛細(xì)管電泳柱及其制備方法。該電泳柱也可以用于普通蛋白質(zhì)和肽等高分子物質(zhì)的分離。
毛細(xì)管電泳技術(shù)在80年代后期崛起，它使傳統(tǒng)的電泳過程在25～100μm內(nèi)徑的毛細(xì)管內(nèi)實(shí)現(xiàn)，具有前者無法比擬的高效、快速、微量和自動(dòng)化的特點(diǎn)。親和電泳是利用大分子所具有的專一的親和力而設(shè)計(jì)的電泳技術(shù)，通常把在毛管內(nèi)實(shí)現(xiàn)的親和電泳技術(shù)稱之為毛細(xì)管親和電泳。與本發(fā)明的技術(shù)較為接近(Anal.Chem.1991.63.2038～2042)曾報(bào)導(dǎo)在凝膠(聚丙烯酰胺)中加入一種可溶性配基以提高選擇性。但是作為該技術(shù)基礎(chǔ)的凝膠栓，需要向柱內(nèi)灌入丙烯酰胺并使之聚合，制備困難又難以重復(fù)。同時(shí)所提供技術(shù)還不能對(duì)一些酶提供一定的選擇性。
本發(fā)明的目的是提供一種均三嗪類染料親和毛細(xì)管電泳柱及這種電泳柱的制備方法。利用該柱可對(duì)一系列重要的酶，例如乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、已糖激酶、核糖核酸酶等具有很高的選擇性，同時(shí)又能用于普通蛋白質(zhì)和肽等高分子物質(zhì)的分離。
本發(fā)明借鑒親和色譜，親和電泳技術(shù)，考慮到毛細(xì)管電泳的各種性能，將三嗪染料通過偶聯(lián)劑鍵合到電泳毛細(xì)管的管壁上，而制成均三嗪染料親和毛細(xì)管電泳柱。本發(fā)明的電泳柱可用下結(jié)構(gòu)式(1)表示
上結(jié)構(gòu)式(1)中，B為毛細(xì)管壁;
為偶聯(lián)劑與石英或玻璃毛細(xì)管的管壁Sl元素鍵合的偶聯(lián)劑基團(tuán)，偶聯(lián)劑可用結(jié)構(gòu)式(2)表示
式(2)所表示的偶劑是指帶有易水解基團(tuán)的三取代的硅烷衍生物，其中X為易水解基團(tuán)，如烷氧基(三甲氧基、三乙氧基等)或氯、水解后通常生成硅醇。Y為相應(yīng)的有機(jī)管能團(tuán)，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯酸丙酯基及乙二胺基等。
結(jié)構(gòu)式(1)中-Z為均三嗪類染料基團(tuán)，具體地說為含有三嗪雜環(huán)的一類染料，而雜環(huán)通常是氮雜環(huán)，如二氯均三嗪和一氯均三嗪類，可用下結(jié)構(gòu)式(3)、(4)及(5)表示一氯均三嗪類
止式中D為染料生色體系，如蔥醌環(huán)、苯磺酸基或萘磺酸基等，其典型的化合物及國際通用名稱如，汽巴藍(lán)(Clbacron Blue，F(xiàn)3G-A)，普施安藍(lán)(Proclon Blue MX-R)及普施安黃(Proclon Yellow，HA)。
本發(fā)明均三嗪染料親和毛細(xì)管電泳柱的制備方法是按下述步驟1、取一定內(nèi)徑(25～100μm)的石英或玻璃毛細(xì)管，分別用堿(KOH或NaOH)和無機(jī)酸(HNO3，HCl，H2SO4)進(jìn)行洗滌;
2、然后將硅烷類偶聯(lián)劑水溶液用真空泵抽入毛細(xì)管內(nèi)，偶聯(lián)劑溶液在管內(nèi)和管壁進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間應(yīng)不少于15分鐘，最好為1～5小時(shí)，偶聯(lián)劑將與管壁中Sl元素形成Sl-O鍵，使偶聯(lián)劑鍵合在毛細(xì)管壁上;
3、將均三嗪染料溶液通入毛細(xì)管，在管內(nèi)染料將和偶聯(lián)劑反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)不少于1小時(shí)，染料基團(tuán)(結(jié)構(gòu)式(3)～(5))將與偶聯(lián)劑鍵合，即通過偶聯(lián)劑使均三嗪染料鍵合到毛細(xì)管的管壁上。再經(jīng)水洗，用惰性氣體吹干可制成本發(fā)明的電泳柱。在上述堿、酸洗滌毛細(xì)管時(shí)，可采用濃度為1～20%的NaOH或KOH溶液及濃度為1～30%無機(jī)酸作洗滌液，偶聯(lián)劑可采用濃度為0.01～5%的溶液，而染料可采用濃度為0.01～0.1M的溶液。下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)給予進(jìn)一步地說明。
實(shí)例1均三嗪染料親和毛細(xì)管電泳柱的制備1先后用5%KOH和10%的HCl洗柱，各半小時(shí)，每次洗完后用兩次水沖3分鐘，用丙酮脫水、氮?dú)獯蹈?，把r-縮水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷水溶液通入柱子逾5分鐘，后再靜止15分鐘，再通氮?dú)?0分鐘以吹去殘余偶聯(lián)劑，用2%HCl沖柱10分鐘，水洗至中性，再把0.01ml/L的Clbacron藍(lán)F3G-A通入柱內(nèi)2小時(shí)，水洗至滴出液無色，即可供電泳使用。
實(shí)例2電泳柱的制備2柱子預(yù)處理過程和所用偶聯(lián)劑同例1，用0.005mol/L的Prlclon藍(lán)MX-R溶液代替Clbacron藍(lán)參與反應(yīng)，清洗過程仍和例1相同。
實(shí)例3電泳柱制備3柱子預(yù)處理過程同實(shí)例1，用r-氨丙基三乙氯基硅烷代替r-縮水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷，完成管壁的硅烷化反應(yīng)，仍用0.01mol/L的Clbacron藍(lán)F3G-A通入柱內(nèi)反應(yīng)，其余過程同例1。
實(shí)例4親和柱的選擇性實(shí)驗(yàn)用按上述實(shí)例1制備的親和毛細(xì)管柱對(duì)核糖核酸酶的遷移值進(jìn)行測定，用胰酶和牛血清白蛋白作對(duì)照樣品，用未涂漬柱作為對(duì)照柱，在同樣的操作條件下核糖酸酶在親和柱和空白柱上淌度的變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照樣品(胰酶和牛血清白蛋白)在相應(yīng)柱上的變化。
μ為扣除電滲后的電泳淌度計(jì)算方法如下μ＝ (QL)/(V) ( (l)/(t) - (l)/(t) 。)其中Q為柱的有效長度L為柱總長度V為運(yùn)動(dòng)電壓t為樣品遷移時(shí)間t。為測電滲用的二甲基亞砜遷移時(shí)間操作條件進(jìn)樣電壓12KV時(shí)間12秒運(yùn)行電壓10KV緩沖液PH6.830.1M磷酸鹽柱總長54.8cm(親和柱)
內(nèi)徑50μm檢測紫外200nm0.01AUFS儀器HPE-100(Blo-Rad)實(shí)例5親和柱的性能實(shí)驗(yàn)除此之外，上述親和柱還具有一段涂漬柱的通用性，即能作為改性柱用于毛細(xì)管區(qū)帶電泳操作模式下，肽和蛋白的分離，柱效、對(duì)照性、重復(fù)性和壽命均佳。表3為一組標(biāo)準(zhǔn)肽的基本性質(zhì)，

圖1為標(biāo)準(zhǔn)肽在實(shí)例2所制親和柱上的譜圖，表4為各組分的柱效和拖尾因子，表5為三次恒壓操作所得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值，此柱在PH2.5下運(yùn)行50余次，在PH6.83下運(yùn)行100余次，仍未見柱性能下降跡象。
圖1所示為標(biāo)準(zhǔn)肽在實(shí)例2所制親和柱上的譜圖中操作條件為進(jìn)樣電壓10KV時(shí)間6秒運(yùn)行電壓10KV緩沖液PH2.50.1M磷酸鹽;
檢測紫外200nm，0.01AuFs儀器HPE-100(Blo-Rad)毛細(xì)管內(nèi)徑50μm毛細(xì)管柱長31.4cm。
上述實(shí)例，本發(fā)明提供的親和毛細(xì)管電泳柱對(duì)酶具有很高的選擇性，也可作為微制備的手段。同時(shí)該電泳柱的制備過程簡單有效。此外，本發(fā)明還可作為一種親的柱改性方法，用于普通肽、蛋白質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離，其柱效、對(duì)稱性、重復(fù)性和壽命等基本參數(shù)都達(dá)到其它改性柱的水平。
權(quán)利要求
1.一種均三嗪類染料親和毛細(xì)管電泳柱，是將均三嗪類染料通過偶聯(lián)劑鍵合到毛細(xì)管的管壁上，其特征在于電泳柱的結(jié)構(gòu)可用下結(jié)構(gòu)式表示
其中B為石英或玻璃毛累管壁；
為偶聯(lián)劑基團(tuán)，偶聯(lián)劑為帶易水解基團(tuán)的三取代的硅烷衍生物，可用下結(jié)構(gòu)式表示
其中，X為易水解基團(tuán)，如烷氧基或氯；Y為有機(jī)管能團(tuán)，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯丙酯基及乙二胺等，-Z為均三嗪類染料基團(tuán)，如二氯均三嗪或一氯均三嗪類。可用下結(jié)構(gòu)式表示
其中D為染料生色體系，如蔥酯環(huán)基、苯磺酸基或萘磺酸基等。
2.按照權(quán)利要求1所述的電泳柱，其特征在于毛細(xì)管是采用內(nèi)徑為25～10μm的石英或玻璃毛細(xì)管。
3.一種用于按照權(quán)利要求1所述電泳柱的制備方法，包括對(duì)毛細(xì)管柱的堿和酸洗滌及涂有機(jī)相，其特征在于(1)毛細(xì)管經(jīng)堿和酸洗滌后，將硅烷類偶聯(lián)劑水溶液用真空泵抽入毛細(xì)管內(nèi)，偶聯(lián)劑在管內(nèi)和管壁進(jìn)行反應(yīng)時(shí)間應(yīng)不少于15分鐘;(2)再將均三嗪染料溶液通入毛細(xì)管，使染料與偶聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，其時(shí)間應(yīng)不少于1小時(shí)，然后經(jīng)水洗用惰性氣體吹干。
4.按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于偶聯(lián)劑可采用濃度為0.01～5%的溶液，染料可采用濃度為0.01～0.1M的溶液。
全文摘要
一種均三嗪類染料親和毛細(xì)管電泳柱是將均三嗪類染料通過帶易水解基團(tuán)的硅烷衍生物的偶聯(lián)劑鍵合到石英或玻璃毛細(xì)管管壁上而制成的電泳柱。該柱對(duì)一系列重要酶具有很高選擇性。此外，所提供方法還可以作為一種柱改性方法，用于普通肽、蛋白質(zhì)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離，其柱效、對(duì)稱性、重復(fù)性和壽命等基本參數(shù)都達(dá)到其它改性柱的水平。
文檔編號(hào)G01N30/02GK1085318SQ92109938
公開日1994年4月13日 申請(qǐng)日期1992年9月29日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月29日
發(fā)明者林炳承, 褚新華, 楊 一 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所