專利名稱:超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，屬于掃描顯微成像領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在材料科學(xué)領(lǐng)域，大量研究結(jié)果表明物質(zhì)在納米尺度的尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)、表面效應(yīng)等使得納米材料與納米器件展現(xiàn)出非常優(yōu)異的性能。只有在納米尺度深入研究納米功能器件中表面與界面的物理化學(xué)過程以及不同表界面分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，了解納米功能器件的工作機(jī)制，才能實(shí)現(xiàn)人工設(shè)計(jì)、制備具有特定性能納米器件的科學(xué)目標(biāo)。
生命科學(xué)中生化反應(yīng)和生物分子結(jié)構(gòu)與性能的研究更是如此，由于生物分子結(jié)構(gòu)(如構(gòu)象)的多樣性、生化反應(yīng)的非同步性和所處環(huán)境的非均一性，在納米尺度實(shí)現(xiàn)生理?xiàng)l 件下蛋白質(zhì)、核酸等單個(gè)生物分子成像表征，對(duì)揭示生命的奧秘、提高疾病的預(yù)防、診斷、治療水平具有重要意義。
光學(xué)成像是最常用的成像表征技術(shù)，但是由于光學(xué)衍射原理的限制，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能達(dá)到波長量級(jí)的空間分辨率(一般在200nm-500nm)，限制了它在納米尺度對(duì)分子結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng)用。2006年以來各國研究人員提出了光活化定位顯微鏡(PALM)、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)、受激福射耗盡(Stimulated emission depletion-STED)顯微鏡等幾種突破衍射極限的熒光成像新原理，其中STED顯微鏡以其時(shí)間分辨的優(yōu)勢(shì)在對(duì)動(dòng)態(tài)過程的成像應(yīng)用中具有很大的前景。
STED顯微鏡作為一種超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡,是一種掃描成像技術(shù)，它是在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加一路STED光束，通過調(diào)制STED光束波前在物鏡焦平面上形成空殼形狀焦斑，將激發(fā)光衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射態(tài)，實(shí)現(xiàn)了好于50納米的空間分辨率。目前超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡的研究還處于起步階段，與其他成像技術(shù)的聯(lián)用尚未開展。
掃描探針顯微鏡(SPM)是二十世紀(jì)末發(fā)展起來的納米表界面掃描顯微成像技術(shù)。SPM具有很高的空間分辨率，能夠在三維實(shí)空間下實(shí)時(shí)觀察單個(gè)原子、分子在物質(zhì)表面的狀態(tài)并且研究與表面電子行為有關(guān)的物理及化學(xué)性質(zhì)，已成為在原子分子尺度上研究表界面行為的最有力的手段之一。SPM技術(shù)包括基于表界面的電子態(tài)的掃描隧道顯微技術(shù)、基于表面原子間相互作用力的原子力顯微技術(shù)、基于電解液離子電流的離子電導(dǎo)顯微技術(shù)等。
因?yàn)闊晒獬上窨梢远ㄎ惶囟ǖ陌蟹肿?，將熒光成像技術(shù)與SPM技術(shù)聯(lián)用，通過熒光成像引導(dǎo)SPM探針在樣品表面特定位置進(jìn)行形貌成像和多參量研究，既可以獲得單分子的光學(xué)信號(hào)和形貌圖像，又可以獲得單對(duì)分子間相互作用的其它參量信息。但是由于光學(xué)衍射極限的限制，現(xiàn)有的激光共聚焦顯微鏡空間分辨率只能達(dá)到250nm — 300nm，難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中納米級(jí)光學(xué)成像，對(duì)SPM探針的弓I導(dǎo)定位也不夠精確。

發(fā)明內(nèi)容
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，通過在共聚焦光學(xué)顯微鏡中加入第二路調(diào)制光，實(shí)現(xiàn)超分辨的共聚焦光學(xué)顯微成像，突破傳統(tǒng)的光學(xué)衍射極限的限制；本發(fā)明通過將SPM與超分辨的共聚焦光學(xué)顯微系統(tǒng)結(jié)合，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，在獲得單分子的光學(xué)信號(hào)和形貌圖像的同時(shí)，可以獲得單對(duì)分子間相互作用的其它參量信息，實(shí)現(xiàn)在納米尺度和分子水平對(duì)復(fù)雜體系多參量成像和分析，還可以首先進(jìn)行超分辨的光學(xué)顯微成像，然后利用該高分辨的光學(xué)顯微圖像對(duì)SPM探針進(jìn)行納米級(jí)精確引導(dǎo)定位，實(shí)現(xiàn)特定靶點(diǎn)的SPM分析。
本發(fā)明所提供的一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)中，激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡,激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后匯聚至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測(cè)器，所述光電探測(cè)器輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器；
經(jīng)收集透鏡匯聚后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設(shè)于所述樣品臺(tái)的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測(cè)器，所述·SPM探測(cè)器輸出的電信號(hào)輸入至SPM信號(hào)采集器；
所述SPM探針和樣品臺(tái)均與一位移控制器相連接。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述激光器a輸出的所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡，以調(diào)整光路對(duì)準(zhǔn)。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述待測(cè)樣品的熒光信號(hào)在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡，用于對(duì)準(zhǔn)光路；所述待測(cè)樣品的熒光信號(hào)在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一濾波片，用于濾除激發(fā)光。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后再經(jīng)一半反半透鏡后入射至SPM探測(cè)器。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述SPM探針具體可為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或尚子電導(dǎo)探針。
本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)具有以下有益效果
I、在一套成像平臺(tái)上同時(shí)實(shí)現(xiàn)光學(xué)成像與SPM成像，在獲得單分子的光學(xué)信號(hào)和形貌圖像的同時(shí)，可以獲得單對(duì)分子間相互作用的其它參量信息。
2、同時(shí)成像克服了現(xiàn)在流行的二次成像帶來的定位不準(zhǔn)和信息變化的缺點(diǎn)。
3、由超分辨的光學(xué)成像引導(dǎo)SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，可以實(shí)現(xiàn)更高精度的靶點(diǎn)定位。


圖I為本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為使用本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)熒光標(biāo)記的納米微球的原子力形貌圖像(左)和超分辨共聚焦顯微圖像(右)。
圖中各標(biāo)記如下1激光器a、2 二向色性濾光片a、3,9反射鏡、4顯微物鏡、5激光器b、6位相板、7 二向色性濾光片b、8樣品臺(tái)、10濾波片、11收集透鏡a、12光電探測(cè)器、13光學(xué)信號(hào)采集器、14半反半透鏡、15收集透鏡b、16AFM探針、17SPM探測(cè)器、18SPM信號(hào)采集器、19位移控制器。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，
激光器al輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a2濾光后經(jīng)反射鏡3反射后匯聚至顯微物鏡4，激光器b5輸出的激光依次經(jīng)位相板6和二向色性濾光片b7濾光后經(jīng)反射鏡3反射后匯聚至顯微物鏡4 ;經(jīng)過顯微物鏡4匯聚的激光照射至樣品臺(tái)8上，待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)顯微物鏡4匯聚后經(jīng)反射鏡3、二向色性濾光片a2、二向色性濾光片b7、反射鏡9、濾波片10和收集透鏡all收集后入射至光電探測(cè)器12，光電探測(cè)器12輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器13 ;透射過半反半透鏡14的激光經(jīng)收集透鏡bl5收集后入射至AFM探 針16的懸臂上，該AFM探針16設(shè)于樣品臺(tái)8的上方j(luò)^AFM探針16反射后的光經(jīng)收集透鏡bl5收集后入射至SPM探測(cè)器17，該SPM探測(cè)器17輸出的電信號(hào)輸入至SPM信號(hào)采集器18 ;本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，AFM探針16和樣品臺(tái)8均與一位移控制器19相連接，用于控制AFM探針16和樣品臺(tái)8的移動(dòng)。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所用的SPM探針具體可選擇為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或離子電導(dǎo)探針等。
本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，激發(fā)用激光器al經(jīng)過二向色性濾光片a2、反射鏡3反射入顯微物鏡4，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后，激發(fā)樣品發(fā)射熒光；退激發(fā)用激光器b5，經(jīng)過位相板6調(diào)整光束波前，經(jīng)二向色性濾光片b7和反射鏡3反射后，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后形成空殼型焦斑，將激發(fā)光激發(fā)的熒光斑周圍熒光分子退激發(fā)，最后只有小體積的熒光分子自發(fā)輻射熒光，實(shí)現(xiàn)超分辨光學(xué)成像；樣品臺(tái)8在位移控制器19的控制下對(duì)樣品進(jìn)行掃描，獲得不同位置的光學(xué)信號(hào)。熒光信號(hào)經(jīng)顯微物鏡4收集后，經(jīng)反射鏡3和反射鏡9反射后，由濾波片10濾除熒光以外的其它光，經(jīng)收集透鏡all匯聚后，由光電探測(cè)器12轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；由光電探測(cè)器12獲得的光電信號(hào)，經(jīng)過光學(xué)信號(hào)采集器13采集后，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行重構(gòu)和處理獲得超分辨熒光顯微圖像。
AFM探針16和樣品臺(tái)8在位移控制器19的統(tǒng)一控制下，實(shí)現(xiàn)樣品的探針掃描，AFM信號(hào)經(jīng)過半反半透鏡14反射后由SPM探測(cè)器17轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，經(jīng)過SPM信號(hào)采集器18采集后，由計(jì)算機(jī)進(jìn)行重構(gòu)和處理獲得掃描探針顯微圖像。
AFM探針16由位移控制器19控制實(shí)現(xiàn)探針和光學(xué)焦斑的對(duì)準(zhǔn)，然后位移控制器19控制樣品臺(tái)8掃描樣品，實(shí)現(xiàn)超分辨光學(xué)成像和SPM成像的同步成像。光學(xué)信號(hào)采集器13和SPM信號(hào)采集器18由位移控制器19觸發(fā)，實(shí)現(xiàn)同步采集。
使用上述聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)熒光標(biāo)記的40納米直徑的納米微球進(jìn)行了超分辨共聚焦顯微和原子力聯(lián)用成像試驗(yàn)，通過原子力針尖與物鏡焦點(diǎn)的精確對(duì)準(zhǔn)，同時(shí)獲得了圖2所示原子力形貌圖像(左)和超分辨共聚焦顯微圖像(右)，其中超分辨共聚焦顯微圖像的分辨率已經(jīng)達(dá)到50nm的橫向空間分辨率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡。
權(quán)利要求
1.超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于 激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡,激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測(cè)器，所述光電探測(cè)器輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器； 經(jīng)收集透鏡b收集后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設(shè)于所述樣品臺(tái)的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測(cè)器，所述SPM探測(cè)器輸出的電信號(hào)輸入至SPM信號(hào)采集器； 所述SPM探針和樣品臺(tái)均與一位移控制器相連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求
I所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述激光器a輸出的所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述待測(cè)樣品的熒光信號(hào)在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡和一濾波片。
4.根據(jù)權(quán)利要求
I或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后再經(jīng)一半反半透鏡后入射至SPM探測(cè)器。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4中任一所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述SPM探針可為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或離子電導(dǎo)探針。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種超分辨共聚焦光學(xué)顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)。激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測(cè)器，所述光電探測(cè)器輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器；經(jīng)收集透鏡b收集后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設(shè)于所述樣品臺(tái)的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測(cè)器，所述SPM探測(cè)器輸出的電信號(hào)輸入至SPM信號(hào)采集器。由超分辨的光學(xué)成像引導(dǎo)SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，可以實(shí)現(xiàn)更高精度的靶點(diǎn)定位。
文檔編號(hào)G01Q60/02GKCN102809672SQ201210277343
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年8月6日
發(fā)明者方曉紅, 袁景和, 于建強(qiáng), 張雪潔 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan