本發(fā)明涉及分析檢測，尤其涉及萃取棒及其制備方法和檢測25-羥基維生素d的方法。

背景技術(shù)：

1、目前臨床25-羥基維生素d檢測較為常用的方法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，其可區(qū)分25-羥基維生素d2和25-羥基維生素d3，且具有出色的靈敏度和準(zhǔn)確性。采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測25-羥基維生素d時樣本前處理方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法（常用填料有c18、聚苯乙烯-二乙烯基苯等），但是采用這些前處理方法會提取到較多不必要的非目標(biāo)物，從而造成較強的基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種萃取棒及其制備方法和檢測25-羥基維生素d的方法，采用本發(fā)明提供的萃取棒用于檢測25-羥基維生素d，基質(zhì)干擾小、特異性強，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種萃取棒的制備方法，包括以下步驟：

4、將玻璃棒依次進行刻蝕處理、硅烷化處理、熱處理與活化處理，得到活化玻璃棒；

5、將所述活化玻璃棒置于25-羥基維生素d抗體溶液中進行偶聯(lián)處理，得到偶聯(lián)抗體玻璃棒；

6、將所述偶聯(lián)抗體玻璃棒依次進行去活化處理與共價鍵固定，得到所述萃取棒。

7、優(yōu)選地，所述25-羥基維生素d抗體溶液中25-羥基維生素d抗體的濃度為0.1~0.6mg/ml；所述25-羥基維生素d抗體為25-羥基維生素d單克隆抗體或25-羥基維生素d多克隆抗體。

8、優(yōu)選地，所述偶聯(lián)處理的溫度為30~40℃，時間為1~4h。

9、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的萃取棒。

10、本發(fā)明提供了一種非疾病診斷目的檢測25-羥基維生素d的方法，包括以下步驟：

11、將待測生物樣本與解離劑混合，進行解離處理，得到解離料液；所述解離劑中含有8-苯胺基-1-萘磺酸和全氟辛酸；

12、將上述技術(shù)方案所述萃取棒置于所述解離料液中，進行萃取，得到富集萃取棒；

13、將所述富集萃取棒依次進行清洗與洗脫，得到待測液；

14、將所述待測液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，得到待測液的色譜圖；

15、根據(jù)25-羥基維生素d的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及所述待測液的色譜圖，得到待測生物樣本中25-羥基維生素d的含量。

16、優(yōu)選地，所述25-羥基維生素d包括25-羥基維生素d2和25-羥基維生素d3。

17、優(yōu)選地，所述解離劑中8-苯胺基-1-萘磺酸的濃度為0.1~0.5wt%，全氟辛酸的濃度為1~5wt%；所述解離劑的ph值為7.0~7.5；所述解離處理的溫度為30~40℃，時間為10~30min。

18、優(yōu)選地，所述萃取的溫度為30~40℃，時間為5~30min；

19、所述洗脫所用洗脫液包括甲醇、乙腈或衍生劑溶液，所述衍生劑包括4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮、4-[2-(6,7-二甲氧基-4-甲基-3,4-二氫喹啉基)乙基]-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮或4-(4'-二甲氨基苯基)-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮；所述洗脫的溫度為30~40℃，時間為10~30min。

20、優(yōu)選地，所述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的液相條件包括：

21、流動相包括流動相a與流動相b，所述流動相a為濃度為2mmol/l的乙酸銨水溶液，所述流動相b為濃度為2mmol/l的乙酸銨的甲醇溶液；

22、梯度洗脫程序：0~1min，流動相b的體積分?jǐn)?shù)為10%；1~3.5min，流動相b的體積分?jǐn)?shù)由10%增加至100%；3.5~4.5min，流動相b的體積分?jǐn)?shù)保持100%；4.5~4.6min，流動相b的體積分?jǐn)?shù)由100%降低至10%；4.6~5min，流動相b的體積分?jǐn)?shù)保持10%。

23、優(yōu)選地，所述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的質(zhì)譜條件包括：

24、采集離子模式：esi正離子模式；毛細管電壓：3.6kv；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流速：1000l/h；錐孔氣：150l/h；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式。

25、有益效果：本發(fā)明將玻璃棒依次進行刻蝕處理、硅烷化處理、熱處理與活化處理，得到活化玻璃棒；將所述活化玻璃棒置于25-羥基維生素d抗體溶液中進行偶聯(lián)處理，得到偶聯(lián)抗體玻璃棒；將所述偶聯(lián)抗體玻璃棒依次進行去活化處理與共價鍵固定，得到萃取棒。本發(fā)明在玻璃棒基礎(chǔ)上利用抗體免疫富集技術(shù)制備萃取棒（即維生素d抗體免疫親和萃取棒），利用該萃取棒對25-羥基維生素d進行提取后再檢測，基質(zhì)干擾小、特異性強、準(zhǔn)確度好；且該萃取棒使用方法簡單，易實現(xiàn)自動化操作，尤其適合臨床大批量樣本的檢測。

技術(shù)特征：

1.一種萃取棒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述25-羥基維生素d抗體溶液中25-羥基維生素d抗體的濃度為0.1~0.6mg/ml；所述25-羥基維生素d抗體為25-羥基維生素d單克隆抗體或25-羥基維生素d多克隆抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述偶聯(lián)處理的溫度為30~40℃，時間為1~4h。

4.權(quán)利要求1~3任一項所述制備方法制備得到的萃取棒。

5.一種非疾病診斷目的檢測25-羥基維生素d的方法，其特征在于，包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述25-羥基維生素d包括25-羥基維生素d2和25-羥基維生素d3。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述解離劑中8-苯胺基-1-萘磺酸的濃度為0.1~0.5wt%，全氟辛酸的濃度為1~5wt%；所述解離劑的ph值為7.0~7.5；所述解離處理的溫度為30~40℃，時間為10~30min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5~7任一項所述的方法，其特征在于，所述萃取的溫度為30~40℃，時間為5~30min；

9.根據(jù)權(quán)利要求5~7任一項所述的方法，其特征在于，所述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的液相條件包括：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測的質(zhì)譜條件包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了萃取棒及其制備方法和檢測25?羥基維生素D的方法，屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將玻璃棒依次進行刻蝕處理、硅烷化處理、熱處理與活化處理，得到活化玻璃棒；將所述活化玻璃棒置于25?羥基維生素D抗體溶液中進行偶聯(lián)處理，得到偶聯(lián)抗體玻璃棒；將所述偶聯(lián)抗體玻璃棒依次進行去活化處理與共價鍵固定，得到萃取棒。本發(fā)明在玻璃棒基礎(chǔ)上利用抗體偶聯(lián)技術(shù)制備萃取棒，利用萃取棒上的抗體免疫富集技術(shù)對25?羥基維生素D進行提取后再檢測，基質(zhì)干擾小、特異性強、準(zhǔn)確度好；且該萃取棒使用方法簡單，易實現(xiàn)自動化操作，尤其適合臨床大批量樣本的檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：楊方星,鄧童慶
受保護的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)長三角智慧綠洲創(chuàng)新中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23