本發(fā)明涉及一種基于金納米球的黃曲霉毒素m1適配體試紙條的制備方法及應(yīng)用，屬于食品安全檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、黃曲霉毒素m1(afm1)是黃曲霉毒素b1(afb1)的羥基化衍生物。它是一類動物因攝入被afb1污染的飼料和食品后，在其機(jī)體內(nèi)羥基化產(chǎn)生的有毒代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，世界衛(wèi)生組織(who)已將其列為ⅱb類致癌物。afm1進(jìn)入人體或其他哺乳動物有機(jī)體內(nèi)后顯著抑制肝組織蛋白質(zhì)的正常合成，導(dǎo)致肝中毒，表現(xiàn)為損害肝組織；致癌、致畸、致突變，引發(fā)多種肝病，進(jìn)一步誘發(fā)肝癌等，毒性是砒霜毒性的近70倍。afm1在牛奶巴氏殺菌或其他熱處理過程中具有相對較高的穩(wěn)定性，裂解溫度高達(dá)300℃，一旦形成難以消除。為保證食品安全，世界各國均對afm1含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。

2、目前，檢測afm1殘留量的方法有高效液相色譜(high?performance?liquidchromatography，hplc)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid?chromatograph?massspectrometer，lc-ms)、薄層色譜(thin?layer?chromatography，tlc)、酶聯(lián)免疫法(enzymelinked?immunosorbent?assay，elisa)和膠體金免疫層析法等，這些方法雖然準(zhǔn)確度和靈敏性高，但都需要專業(yè)人員操作大型儀器，樣品也需要復(fù)雜的預(yù)處理，檢測成本高，故不適用于快速、簡單、性價比高的食品安全檢測。

3、適配體與抗體相比，具有合成成本低、效率高、穩(wěn)定性高、易定向固定等優(yōu)點，對靶標(biāo)具有高親和性和高特異性。基于適配體的橫向流動試紙條相較于傳統(tǒng)的檢測方法(如hplc、elisa等)，在檢測中不需專用儀器，不需復(fù)雜前處理，整體用時較短，操作簡便易學(xué)，對檢測人員需求少、要求低，具有成本低、操作簡便、檢測速度快、高靈敏等優(yōu)點，可成為檢測真菌毒素的有效分析手段，特別適合于現(xiàn)場快速檢測和大規(guī)模篩查。但現(xiàn)有的檢測afm1的橫向流動試紙條以抗體為識別元件，穩(wěn)定性差，合成成本高。缺乏針對afm1穩(wěn)定、高靈敏、低成本的適配體橫向流動試紙條。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明目的在于提供一種基于aunps的黃曲霉毒素m1適配體橫向流動試紙條的制備方法及應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種特異性識別黃曲霉毒素m1的aunps適配體偶聯(lián)物(aunps@sh-polya-a21)，是將金納米粒子aunps與含適配體的探針偶聯(lián)；所述含適配體的探針具有5’-actgctagagattttccacataaaaaaaaaaaaaaaaaa(seq?id?no.1)-sh-3’。

4、在一種實施方式中，所述aunps適配體偶聯(lián)物aunps@sh-polya-a21是將濃縮的aunps與適配體溶液避光孵育一段時間后，加入nacl溶液繼續(xù)避光孵育一段時間，離心后用重懸液重懸沉淀，制備而成。

5、在一種實施方式中，所述制備過程具體為：取濃縮的aunps?1ml，加入濃度為100μm已活化的適配體溶液，4℃避光孵育24h后，加入90μl濃度為1m的nacl溶液，繼續(xù)4℃避光孵育24h，然后10000rpm離心20min，加入重懸液重懸，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

6、在一種實施方式中，金納米粒子aunps的制備方法具體為：取99ml超純水于錐形瓶中，加入1ml、1％氯金酸(haucl4)，將配置好的溶液攪拌加熱至沸騰，然后加入適量濃度為1％的檸檬酸三鈉，待溶液變?yōu)榧t色后沸騰半小時，最后攪拌冷卻至室溫，以10000rpm離心10min，再用0.05％吐溫-20重懸，制備而成。

7、在一種實施方式中，所述的重懸液為：含有1％聚乙二烯、0.02％mgso4、2.5％蔗糖、0.25％吐溫-20、5％bsa的混合溶液，并將其混合物用0.01mol/l?pbs緩沖溶液進(jìn)行稀釋。

8、本發(fā)明已提供了一種基于aunps的黃曲霉毒素m1適配體試紙條，含有aunps適配體偶聯(lián)物aunps@sh-polya-a21、適配體互補(bǔ)鏈和鏈霉親和素復(fù)合物；所述適配體互補(bǔ)鏈和鏈霉親和素復(fù)合物包括sa-bio-dnat和sa-bio-dnac；所述sh-polya-a21具有5’-actgctagagattttccacataaaaaaaaaaaaaaaaaa-sh-3’所示序列。

9、在一種實施方式中，適配體互補(bǔ)鏈dnat核酸序列如：5’-biotin-atgtggaaaatctctagcagtaaa(seq?id?no.2)-3’所示。

10、在一種實施方式中，適配體互補(bǔ)鏈dnac核酸序列如：5’-biotin-tttttttttttttttttt(seq?id?no.3)-3’所示。

11、本發(fā)明還提供了制備基于aunps的黃曲霉毒素m1適配體試紙條的方法，包括：

12、(a)制備所述aunps適配體偶聯(lián)物aunps@sh-polya-a21；

13、(b)制備適配體互補(bǔ)鏈和鏈霉親和素復(fù)合物(sa-bio-dnat和sa-bio-dnac)：

14、將濃度為1mg/ml的鏈霉親和素與濃度分別為100μm的互補(bǔ)鏈dnat和dnac的pbs溶液混合，4℃孵育2h以上，然后用30kda的超濾管以6000rpm離心20min，總共離心兩次，內(nèi)管倒置以1800rpm離心8min，收集液體，制成sa-bio-dnat和sa-bio-dnac，4℃儲存?zhèn)溆茫?/p>

15、(c)制備t線、c線：

16、將制備好的sa-bio-dnat和sa-bio-dnac用劃膜噴金儀分別噴灑在硝酸纖維膜(nc膜)上，制成t線和c線，烘箱干燥2h以上；

17、(d)組裝適配體試紙條：

18、將樣品墊在樣品墊處理液中浸泡1h以上，37℃烘干，然后將樣品墊、nc膜、吸水墊組裝固定在聚乙烯底板上，切成3.5mm寬，密封干燥保存。

19、在一種實施方式中，步驟(b)所述的互補(bǔ)鏈dnat核酸序列具體為：5’-biotin-atgtggaaaatctctagcagtaaa-3’。

20、在一種實施方式中，步驟(b)所述的互補(bǔ)鏈dnac核酸序列具體為：5’-biotin-tttttttttttttttttt-3’。

21、在一種實施方式中，步驟(d)所述的樣品墊處理液為：含有0.1％吐溫-20、1％bsa、2％蔗糖的混合溶液，并將其混合物用0.01mol/l?pbs緩沖溶液進(jìn)行稀釋。

22、本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述試紙條檢測黃曲霉毒素m1含量的方法，所述方法是將待測樣品與aunps適配體偶聯(lián)物aunps@sh-polya-a21在含hepes的結(jié)合緩沖液中混合，于36～38℃孵育45～90min，滴加在所述試紙條上，根據(jù)t線、c線的灰度值，計算得到黃曲霉毒素m1含量。

23、在一種實施方式中，所述方法是將待測樣品與aunps適配體偶聯(lián)物aunps@sh-polya-a21在含hepes的結(jié)合緩沖液中混合，于37℃孵育45min，滴加在所述試紙條上，根據(jù)t線、c線的灰度值，計算得到黃曲霉毒素m1含量。

24、在一種實施方式中，混合溶液的ph為6.0±0.2。

25、在一種實施方式中，所述方法是將試紙條的顯色情況拍照，用軟件image?j測量t線、c線的灰度值，獲得t/c值，并根據(jù)t/c值與afm1濃度的線性關(guān)系，計算得到黃曲霉毒素m1含量。

26、本發(fā)明還提供了所述試紙條以及該試紙條在afm1檢測中的應(yīng)用。

27、在一種實施方式中，所述應(yīng)用包括但不限于檢測食品中的黃曲霉毒素m1。

28、有益效果：

29、(1)本發(fā)明提供了一種基于aunps的黃曲霉毒素m1適配體試紙條的制備方法及應(yīng)用，該試紙條可以通過便攜式設(shè)備(手機(jī))進(jìn)行拍攝再通過image?j軟件實現(xiàn)定量檢測。

30、(2)本發(fā)明制備的檢測afm1的適配體橫向流動測試條檢測快速，耗時短，檢測時間在15min內(nèi)，且檢測批次穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重復(fù)性高。該試紙條在2-500ng/ml的濃度范圍內(nèi)，相對比色信號強(qiáng)度(t/c)與afm1的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r2＝0.9901。該試紙條靈敏度高，檢出限(limit?of?detection,lod)低至0.26ng/ml，比抗體試紙條(《sensitive?competitivedirect?enzyme-linked?immunosorbent?assay?and?gold?nanoparticleimmunochromatographic?strip?for?detecting?aflatoxin?m1?in?milk》0.5-1.0ng/ml)更低，符合國標(biāo)法gb/t?2761-2017的要求(限量0.5ng/ml)。