本發(fā)明屬于檢測，具體涉及一種牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒的通用型試劑盒。

背景技術(shù)：

1、牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lumpy?skin?disease，lsd)又稱為牛疙瘩皮膚病，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(lsdv)引起的一種疾病。lsd是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織法定的通報(bào)性動(dòng)物疫病，目前在我國屬于二類動(dòng)物疫病。lsdv感染后，患牛會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱，淋巴結(jié)腫大，皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結(jié)節(jié)。lsdv屬于痘病毒科，羊痘病毒屬，該病毒屬還包括山羊痘病毒(gtp?v)和綿羊痘病毒(sppv)。lsdv、gtpv和sppv的核苷酸序列相似性高達(dá)96％以上，抗原相似度高，血清學(xué)呈現(xiàn)交叉反應(yīng)，為此我國臨床上選用皮內(nèi)注射5倍劑量的山羊痘弱毒疫苗防控lsd。

2、世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(oie)推薦的用于診斷l(xiāng)sdv的血清學(xué)方法包括病毒中和試驗(yàn)(vn?t)、免疫印跡(wb)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)等，vnt是檢測山羊痘病毒屬抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，該實(shí)驗(yàn)操作過程中需使用活毒且對操作實(shí)驗(yàn)室要求較高，不適于臨床血清學(xué)檢測。wb也因?qū)嶒?yàn)操作過程繁瑣，不適于臨床血清學(xué)檢測。elisa方法由于其便捷、快速、敏感、特異且不需要特殊的儀器設(shè)備的特性被廣泛應(yīng)用于臨床血清學(xué)檢測。

3、本技術(shù)通過對牛結(jié)節(jié)性皮膚病的感染血清和不同時(shí)期的免疫血清(0dpi、15dpi、30dpi、45dpi和60dpi)分析發(fā)現(xiàn)，牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒的p122蛋白血清豐度高。進(jìn)一步通過序列比對發(fā)現(xiàn)p122蛋白在牛結(jié)節(jié)性皮膚病、綿羊痘病毒和山羊痘病毒上均高度保守，因此選擇p122蛋白作為靶標(biāo)蛋白建立牛結(jié)節(jié)雙抗原夾心elisa抗體檢測試劑盒，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明該試劑盒能同時(shí)檢測綿羊痘病毒和山羊痘病毒，因此，該試劑盒是一種牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用型的試劑盒。另外，該方法不受待檢血清亞型的限制，能同時(shí)檢測免疫或感染后不同時(shí)期(早期、中期和晚期)、不同亞型(iga、igm和igg)血清中的抗體。因?yàn)樵摲椒ú恍枰苽涮禺愋缘目贵w，只需要一個(gè)抗原蛋白即可完成試劑盒的制備，因此，該試劑盒具有成本低、反應(yīng)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、敏感性高的特性，便于大規(guī)模推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明基于p122蛋白的制備，以血清為檢測樣本，提供了一種針對lsdv、gtpv和sppv三種病原的通用型雙抗原夾心elisa方法，具體包括以下內(nèi)容：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種p122蛋白作為包被抗原在制備牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒的通用型雙抗原夾心elisa試劑盒中的應(yīng)用。

3、第二方面，本發(fā)明提供了一種牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒的通用型雙抗原夾心elisa試劑盒，所述試劑盒包括：包被抗原、酶標(biāo)抗原、包被液、稀釋液、酶標(biāo)板、tbst緩沖液、封閉液、顯色液、終止液；所述包被抗原為p122蛋白，所述酶標(biāo)抗原為酶標(biāo)記的p122蛋白。

4、優(yōu)選地，所述包被液為ph?9.6的碳酸鹽緩沖液。

5、優(yōu)選地，所述封閉液為含5％bsa的tbst緩沖液。

6、優(yōu)選地，所述酶標(biāo)抗原為：hrp標(biāo)記的帶his標(biāo)簽的p122蛋白。

7、第三方面，本發(fā)明提供了上述第二方面所述的試劑盒在以非疾病診斷為目的的牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒檢測中的應(yīng)用。

8、優(yōu)選地，所述試劑盒的使用方法為：

9、(1)包被抗原和酶標(biāo)抗原的制備；

10、(2)抗原包被：用包被液將p122蛋白包被于酶標(biāo)板中，4℃過夜；

11、(3)封閉：先用tbst緩沖液對包被后的酶標(biāo)板進(jìn)行洗板，洗板之后加入封閉液，37℃孵育；

12、(4)加待檢樣品：封閉后用tbst緩沖液對酶標(biāo)板進(jìn)行洗板，洗板后分別加入待檢血清樣品、陽性對照和陰性對照，37℃孵育；

13、(5)加酶標(biāo)抗原：孵育后用tbst緩沖液對酶標(biāo)板進(jìn)行洗板，洗板后加入酶標(biāo)抗原，37℃孵育；

14、(6)顯示：孵育后用tbst緩沖液對酶標(biāo)板進(jìn)行洗板，洗板后加入顯色液，37℃避光孵育；孵育后加入終止液，于酶標(biāo)儀上讀取450nm波長的od值；

15、(7)結(jié)果判定：s/p>0.304時(shí)判定為陽性，當(dāng)s/p<0.304時(shí)判定為陰性；其中s/p＝(od樣品-od陰性平均值)/(od陽性-od陰性平均值)。

16、優(yōu)選地，所述步驟(2)中包被液用量為50μl/孔，p122蛋白濃度為2μg/ml。

17、優(yōu)選地，所述步驟(4)中待檢血清的稀釋度為1:2。

18、優(yōu)選地，所述步驟(5)中酶標(biāo)抗原的稀釋度1:60000。

19、優(yōu)選地，所述步驟(3)中封閉時(shí)間為1h。

20、優(yōu)選地，所述步驟(4)和(5)中的孵育時(shí)間為30min。

21、優(yōu)選地，所述步驟(6)中避光孵育時(shí)間為10min。

22、優(yōu)選地，所述洗板均為三次，每次5min。

23、優(yōu)選地，所述包被抗原的制備方法為：

24、將p122蛋白進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成，將合成序列克隆至pet-sumo載體，獲得重組質(zhì)粒pet-sumo-lsdv-122，相關(guān)重組質(zhì)粒構(gòu)建工作委托金開瑞生物技術(shù)有限公司完成；

25、將合成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21(de3)表達(dá)菌株內(nèi)，熱激后均勻涂于卡那抗性的平板上，放置37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h后，挑取單菌落接種于10ml卡那抗性的lb液體培養(yǎng)基中活化，37℃，220r/min搖至od值為0.6～0.8，添加終濃度為0.5mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，16℃，220r/min培養(yǎng)16h后離心收集菌體；將菌體pbs洗滌后重懸，在冰浴中超聲破碎，離心后收取出上清液通過ni親和層析預(yù)裝柱純化，用不同濃度咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，獲得lsdv-122蛋白。

26、優(yōu)選地，為便于純化及增加p122蛋白的可溶性，在上述制備的lsdv-122蛋白上分別添加了his標(biāo)簽和sumo標(biāo)簽，用sumo蛋白酶進(jìn)行切割，反應(yīng)緩沖液為25mm?tris-hcl，sumo蛋白酶和lsdv-122蛋白的比例為10u:1mg。反應(yīng)在透析袋內(nèi)進(jìn)行，4℃過夜酶切16h。反應(yīng)后將溶液置于透析袋內(nèi)進(jìn)行置換濃縮，濃縮后的蛋白作為包被抗原。

27、優(yōu)選地，所述酶標(biāo)抗原的制備方法為：將帶his標(biāo)簽的lsdv-122蛋白按照羅氏公司pe?roxidase?labeling?kit試劑盒的說明書操作，進(jìn)行hrp標(biāo)記，獲得酶標(biāo)抗原。

28、優(yōu)選地，所述具體步驟如下：

29、(1)將0.3ml帶his標(biāo)簽的lsdv-122蛋白溶液和0.1ml過氧化物酶加入ep管中，輕輕吹打混勻，4℃過夜；

30、(2)向混合物中加入40μl的三乙醇胺，吹打混勻后加入50μl的硼氫化鈉，再次吹打混勻，4℃放置30min；

31、(3)向混合物中加入10μl甘氨酸溶液，充分吹打混勻；

32、(4)將混合液移入透析袋中，放入透析液中4℃過夜；期間更換3次透析液；

33、(5)用注射器將混合液從透析袋中抽出，打入ep管中，加入與混合液等體積的保存液，輕輕吹打混勻，分裝保存于-80℃。

34、本發(fā)明的有益效果是：

35、(1)特異性強(qiáng)：利用本發(fā)明所提供試劑盒對牛結(jié)節(jié)性皮膚病(lsdv)陽性血清、綿羊痘(sppv)陽性血清、山羊痘(gtpv)陽性血清、lsdv陰性血清、sppv陰性血清、gtp?v陰性血清、布魯氏菌(brucella)陽性血清、羊口瘡(orfv)陽性血清、口蹄疫(fmdv)陽性血清和牛病毒性腹瀉(bvdv)陽性血清為樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，只有l(wèi)sdv陽性血清、sppv陽性血清和gtpv陽性血清檢測結(jié)果為陽性，其余均為陰性，該結(jié)果表明該試劑盒具有良好的特異性；

36、(2)穩(wěn)定性好：利用本發(fā)明所提供試劑盒對4份lsdv陽性血清和4份lsdv陰性血清分別設(shè)置組內(nèi)5個(gè)復(fù)孔以及組間5次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算cv值(變異系數(shù))，批內(nèi)重復(fù)cv值為1.35％-4.77％，批間重復(fù)cv值為2.08％-8.82％，表明本技術(shù)建立的方法具有良好的穩(wěn)定性；

37、(3)通用性強(qiáng)、檢測范圍廣：本發(fā)明通過對牛結(jié)節(jié)性皮膚病的感染血清和不同時(shí)期的免疫血清(0dpi、15dpi、30dpi、45dpi和60dpi)分析發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能同時(shí)檢測牛結(jié)節(jié)性皮膚病、綿羊痘病毒和山羊痘病毒，因此，該試劑盒是一種牛結(jié)節(jié)性皮膚病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒通用型的試劑盒；另外，該方法不受待檢血清亞型的限制，能同時(shí)檢測免疫或感染后不同時(shí)期(早期、中期和晚期)、不同亞型(iga、igm和igg)血清中的抗體；

38、(4)成本價(jià)格低：由于本技術(shù)所述方法不需要制備特異性的抗體，只需要一個(gè)抗原蛋白即可完成試劑盒的制備，因此，該試劑盒成本低，便于大規(guī)模推廣；

39、(5)檢測時(shí)間短：使用辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的lsdv?p122蛋白作為酶標(biāo)抗原，提高了檢測的敏感性和特異性，降低了檢測時(shí)間。同時(shí)，包被抗原和封閉步驟在試劑盒中都已經(jīng)預(yù)處理，拿到試劑盒之后直接從加入待檢血清開始，且后續(xù)步驟孵育時(shí)間最長為30min，整個(gè)檢測過程在1.5h內(nèi)完成，大大縮短了檢測時(shí)間，提高了檢測效率。