本發(fā)明屬于熒光檢測傳感器領(lǐng)域，尤其涉及一種組合特異性靜電復(fù)合熒光陣列傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌廣泛存在于人類的生活中，可引起一系列的環(huán)境污染，并導(dǎo)致人類感染疾病。目前，細(xì)菌感染的主要治療手段為廣譜抗生素治療，它們主要通過與細(xì)菌的表面或細(xì)胞核發(fā)生作用，影響細(xì)菌的正常狀態(tài)，無差別地殺死細(xì)菌。但隨著細(xì)菌的變異，耐藥菌株逐漸變多，抗生素的選用也逐步向結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的高級抗生素發(fā)展，用量也較之前大大提高。由于細(xì)菌逐步耐藥，及時鑒別出患者所感染的細(xì)菌種類并對癥下藥變得非常重要。

2、目前，細(xì)菌的鑒定技術(shù)主要有基于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察、聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)等技術(shù)?；趯?shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察仍然是細(xì)菌鑒別的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)菌培養(yǎng)周期過長，不能及時給患者治療提供正確指導(dǎo)。聚合酶鏈反應(yīng)靈敏度高，檢測速度快。但此方法所使用的儀器較為昂貴，操作人員需經(jīng)過專業(yè)性訓(xùn)練，這在一些最容易產(chǎn)生細(xì)菌感染的欠發(fā)達(dá)地區(qū)難以實(shí)現(xiàn)，限制了聚合酶鏈反應(yīng)的廣泛應(yīng)用。

3、膿毒血癥是一種在重癥監(jiān)護(hù)室(icu)中常見的感染疾病，極易引起血管功能障礙和多器官衰竭且發(fā)病快、致死率高。膿毒血癥患者血液中成分復(fù)雜，可同時包含多種細(xì)菌，且治療黃金時間較短。目前一般醫(yī)院的檢測手段仍然為耗時較長的血培養(yǎng)方法，此方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但會延誤患者的最佳診斷時機(jī)。

4、熒光分析法設(shè)計簡單、靈敏度高、檢測結(jié)果直觀。熒光陣列傳感技術(shù)通過模擬動物嗅覺系統(tǒng)和味覺系統(tǒng)的功能，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的多通道信號傳輸，具有廣譜響應(yīng)和交互響應(yīng)。目前，已有的檢測細(xì)菌的熒光陣列傳感器存在一定的缺陷，其用于細(xì)菌種類測試時需先將檢測元件同細(xì)菌共孵育一段時間，雖然相比于傳統(tǒng)方法已經(jīng)縮短了檢測周期，但仍不能及時快速地實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌種類的檢測區(qū)分。此外，這類傳感器構(gòu)建一般也較復(fù)雜，不適合大規(guī)模推廣使用。因此仍需要建立更便捷、快速、準(zhǔn)確的檢測方法，用以膿毒血癥等細(xì)菌感染性疾病的快速實(shí)時檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在提供一種組合特異性靜電復(fù)合熒光陣列傳感器，解決了測試過程中需要專業(yè)人員對樣本預(yù)處理、耗時長和所需檢測儀器昂貴等問題。

2、本發(fā)明還提供組合特異性靜電復(fù)合熒光陣列傳感器制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明制備的熒光陣列傳感器構(gòu)建簡單、操作簡便、反應(yīng)快速，可以應(yīng)用于實(shí)際臨床樣本膿毒血癥患者血清檢測，能夠快速精確地對多種細(xì)菌樣品實(shí)現(xiàn)區(qū)分。

3、技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種組合特異性靜電復(fù)合熒光陣列傳感器，所述熒光陣列傳感器包括若干個由tamra修飾的陽離子amp(tamra-amp)和由fam修飾的陰離子ssdna(fam-ssdna)組成的傳感單元，所述ssdna包括ssdna1～4中任意一種序列如seq?id?no.1～4所示，所述amp包括amp1～3中任意一種序列如seq?id?no.5～7所示，所述fam分子結(jié)構(gòu)式如下所示：

4、

5、所述tamra分子結(jié)構(gòu)式如下：

6、

7、其中，ssdna1?seq?id?no.1，其序列為：5'-gggacagggagtgcgctgctccc?c-3'，

8、ssdna2?seq?id?no.2，其序列為：5'-ggggactagaggacttgtgcggcc-3'，

9、ssdna3?seq?id?no.3，其序列為：5'-ccttctaacagaatgttgttagatagctttgaagctggtc-3'，

10、ssdna4?seq?id?no.4，其序列為：5'-ataccagcttattcaattgggtgagggg?gggttcacaacgttaaagatagacgggggaagatagtaagtgcaatct-3'；

11、amp1，其序列如seq?id?no.5所示：

12、h2n-arg-leu-phe-lys-lys-leu-leu-lys-tyr-leu-arg-lys-phe-nh2，

13、amp2，其序列如seq?id?no.6所示：

14、h2n-trp-trp-trp-leu-arg-lys-ile-trp-oh，

15、amp3，其序列如seq?id?no.7所示：

16、h2n-val-lys-leu-phe-pro-val-lys-leu-phe-pro-oh，

17、進(jìn)一步地，所述傳感器包括12個傳感單元，分別為fam-ssdna1/tamra-amp1、fam-ssdna1/tamra-amp2、fam-ssdna1/tamra-amp3、fam-ssdna2/tamra-amp1、fam-ssdna2/tamra-amp2、fam-ssdna2/tamra-amp3、fam-ssdna3/t?amra-amp1、fam-ssdna3/tamra-amp2、fam-ssdna3/tamra-amp3或fam-s?sdna4/tamra-amp1、fam-ssdna4/tamra-amp2、fam-ssdna4/tamra-amp3中任意一種。

18、作為優(yōu)選，所述傳感器的傳感單元包括fam-ssdna1/tamra-amp1、fam-ssdn?a1/tamra-amp2、fam-ssdna1/tamra-amp3、fam-ssdna2/tamra-amp1、fa?m-ssdna2/tamra-amp3、fam-ssdna3/tamra-amp3或fam-ssdna4/tamra-a?mp3中任意一種。

19、本發(fā)明所述靜電復(fù)合熒光陣列傳感器的制備方法，包括如下過程：用緩沖溶液稀釋fam-ssdna，再加入不同濃度的tamra-amp進(jìn)行復(fù)合反應(yīng)即可。

20、進(jìn)一步地，所述fam-ssdna濃度為1～100nm，所述tamra-amp抗菌肽濃度為1～100nm。

21、優(yōu)選地，靜電復(fù)合熒光陣列傳感單元制備過程為：將fam-ssdna用pbs緩沖溶液稀釋，然后均分成若干份，并分別加入不同濃度的tamra-amp，分別測量不同溫度、不同ph條件下的熒光強(qiáng)度，選擇tamra-amp濃度為10nm時的復(fù)合比例用于構(gòu)建傳感器。

22、優(yōu)選地，根據(jù)12個傳感單元建立12×6個孔板陣列傳感器，12為12個傳感單元孔板陣列列數(shù)，6為每一列的孔數(shù)，每一列構(gòu)成一個傳感器，同一列的6個孔中均裝有100μl上述傳感單元的pbs溶液或血清。

23、進(jìn)一步地，復(fù)合反應(yīng)為在25～37℃下反應(yīng)0.5-1h。

24、優(yōu)選地，復(fù)合反應(yīng)為在37℃下反應(yīng)1h。

25、本發(fā)明所述靜電復(fù)合熒光陣列傳感器在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用。

26、進(jìn)一步地，所述靜電復(fù)合熒光陣列傳感器在制備細(xì)菌檢測的試劑或者工具中的應(yīng)用。

27、優(yōu)選地，所述熒光陣列傳感器在膿毒血癥細(xì)菌感染性疾病實(shí)時快速檢測方面應(yīng)用。

28、進(jìn)一步地，所述靜電復(fù)合熒光陣列傳感器在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用過程為：

29、(1)細(xì)菌的培養(yǎng)：采用平板劃線法將細(xì)菌母液接種在固體培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)菌生長到穩(wěn)定期時，挑選生長狀況良好的單個菌落，并將其放置于液體培養(yǎng)基中，在37℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜。

30、(2)細(xì)菌的收集：將以上得到的培養(yǎng)基菌液離心，棄上清，用緩沖液重懸細(xì)菌；

31、(3)待測未知細(xì)菌的檢測：向含有傳感單元的孔板中加入待測未知細(xì)菌樣本孵育，使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，得到未知細(xì)菌樣本的熒光光譜強(qiáng)度i，將上述過程重復(fù)n次，便得到不同的熒光光譜數(shù)據(jù)i，扣除對應(yīng)空白值i0，計算相對熒光變化強(qiáng)度；

32、(4)將步驟(3)熒光變化強(qiáng)度通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法得到待測未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”，與不同細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本前期構(gòu)建的“指紋圖譜”進(jìn)行比對，未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”最接近哪種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本的“指紋圖譜”則認(rèn)定此未知細(xì)菌樣本為哪種細(xì)菌類別，并將未知細(xì)菌樣本判別為與之“指紋圖譜”相匹配的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本的類別。

33、本發(fā)明收集熒光陣列傳感器的傳感單元與細(xì)菌作用后的熒光響應(yīng)數(shù)據(jù)，使用統(tǒng)計分析軟件systat(版本13.0)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析，通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分類，將數(shù)據(jù)可視化，從而構(gòu)建模型實(shí)現(xiàn)對多種細(xì)菌的檢測和區(qū)分，也可以將細(xì)菌隨機(jī)順序進(jìn)行盲測，按照同樣步驟進(jìn)行測試，記錄熒光響應(yīng)數(shù)據(jù)，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，驗(yàn)證模型對未知樣品檢測能力。

34、進(jìn)一步地，步驟(3)中所述細(xì)菌與傳感單元的孵育時間為1～2h，溫度為25～37℃。

35、進(jìn)一步地，步驟(3)中所述測定熒光強(qiáng)度的激發(fā)波長為470-548nm，發(fā)射波長為520-588nm，所述重復(fù)次數(shù)為3～7次。

36、進(jìn)一步地，步驟(4)中所述熒光變化強(qiáng)度通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行分析訓(xùn)練得到多個判別函數(shù)，是從所得的多個判別函數(shù)中選取區(qū)分貢獻(xiàn)度最大的兩個判別函數(shù)作為判別函數(shù)f1和判別函數(shù)f2，以判別函數(shù)f1的數(shù)值為x值，判別函數(shù)f2的數(shù)值為y值，以此為橫縱坐標(biāo)并保留95％置信區(qū)間，繪制不同種類細(xì)菌標(biāo)樣的判別函數(shù)散點(diǎn)圖，該判別函數(shù)散點(diǎn)圖可作為t種不同種類細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的“指紋圖譜”，將待測未知細(xì)菌樣本的相對熒光變化強(qiáng)度，通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行分析訓(xùn)練得到多個判別函數(shù)，從所得的多個判別函數(shù)中選取區(qū)分貢獻(xiàn)度最大的兩個判別函數(shù)作為判別函數(shù)f1和判別函數(shù)f2，以判別函數(shù)f1的數(shù)值為x值，判別函數(shù)f2的數(shù)值為y值，以此為橫縱坐標(biāo)并保留95％置信區(qū)間，繪制未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”，將未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”與t種不同種類細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的“指紋圖譜”進(jìn)行匹配，當(dāng)未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”最接近或重合于某種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)樣品的“指紋圖譜”時，則判定此未知樣本為該種類細(xì)菌。

37、進(jìn)一步地，所述細(xì)菌包括膿毒血癥感染的細(xì)菌，包括肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、霍氏腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、銅綠假單胞菌、路鄧葡萄球菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、鮑曼不動桿菌、沙門氏菌中的任意一種或多種組合。

38、進(jìn)一步地，所述區(qū)分不同種類細(xì)菌的方法是：將上述得到的靜電復(fù)合熒光陣列傳感單元中加入100μl不同種類細(xì)菌(細(xì)菌濃度od600＝0.001)，包括肺炎克雷伯菌(bact.1)、奇異變形桿菌(bact.2)、霍氏腸桿菌(bact.3)、金黃色葡萄球菌(bact.4)、屎腸球菌(bact.5)、大腸桿菌(bact.6)、粘質(zhì)沙雷菌(bact.7)、產(chǎn)酸克雷伯菌(bact.8)、銅綠假單胞菌(bact.9)、路鄧葡萄球菌(bact.10)、糞腸球菌(bact.11)、產(chǎn)氣腸桿菌(bact.12)、鮑曼不動桿菌(bact.13)、沙門氏菌(bact.14)，每種細(xì)菌重復(fù)測6次，記錄熒光響應(yīng)信號。

39、本發(fā)明在膿毒血癥細(xì)菌感染性疾病實(shí)時快速檢測的方法，包括如下步驟：

40、(1)構(gòu)建陣列傳感器和數(shù)據(jù)處理：構(gòu)建的靜電復(fù)合物熒光陣列傳感器有z個傳感單元。建立z×n個孔板陣列傳感器，z為z個傳感單元孔板陣列列數(shù)，n為每一列的孔數(shù)，每一列構(gòu)成一個傳感器，同一列的n個孔中均裝有100μl上述傳感單元的pbs溶液；

41、(2)細(xì)菌的培養(yǎng)：將不同細(xì)菌置于mh培養(yǎng)基中，在37℃下震蕩培養(yǎng)8～12h；

42、(3)細(xì)菌的收集：在3000～5000rmp條件下離心5min，棄上清，用生理鹽水清洗細(xì)菌3次，最后用10mm、ph＝7.4的pbs緩沖液重懸細(xì)菌。

43、(4)建立細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本的熒光光譜數(shù)據(jù)：向96孔板陣列傳感器加入100μl不同種類細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本，將上述過程重復(fù)n次(已知樣本n為6組，即每列的6個孔中加入100μl不同種類細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本)。在激發(fā)波長470nm下，收集520nm和588nm處的發(fā)射波長對應(yīng)的信號，在激發(fā)波長548nm下，收集588nm處的發(fā)射波長對應(yīng)的信號，依據(jù)傳感單元的數(shù)量，一共收集m個信號通道(m為z個傳感單元的信號通道)。使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，得到細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本的熒光光譜強(qiáng)度i，便得到的n×m個熒光光譜數(shù)據(jù)i，扣除對應(yīng)空白值i0，通過公式(i-i0)/i0計算相對熒光變化強(qiáng)度。

44、(5)對t種不同類型的細(xì)菌樣品重復(fù)步驟(4)，得到t×n×m個熒光光譜數(shù)據(jù)i，扣除對應(yīng)空白值i0，通過公式(i-i0)/i0計算相應(yīng)熒光變化強(qiáng)度。然后通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法對相應(yīng)熒光變化強(qiáng)度進(jìn)行分析，得到t種不同類型細(xì)菌的“指紋圖譜”。

45、(6)待測未知細(xì)菌的檢測：向96孔板陣列傳感器加入100μl待測未知細(xì)菌樣本，將上述過程重復(fù)n次(未知樣本n為4組，即每列的4個孔中加入100μl不同種類細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本)。在激發(fā)波長470nm下，收集520nm和588nm的發(fā)射波長對應(yīng)的信號，在激發(fā)波長548nm下，收集588nm處的發(fā)射波長對應(yīng)的信號，依據(jù)傳感單元的數(shù)量，一共收集m個信號通道(m為z個傳感單元的信號通道)。使用多功能酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，得到未知細(xì)菌樣本的熒光光譜強(qiáng)度i，便得到的n×m個熒光光譜數(shù)據(jù)i?？鄢龑?yīng)空白值i0，通過公式(i-i0)/i0計算相對熒光變化強(qiáng)度。

46、(7)將步驟(6)待測未知細(xì)菌樣本的相應(yīng)熒光變化強(qiáng)度通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，將待測未知細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”分別與t種不同類別的細(xì)菌樣本的“指紋圖譜”進(jìn)行比較，并將未知細(xì)菌樣本判別為與之“指紋圖譜”相匹配的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)樣本的類別。

47、(8)篩選傳感單元：將步驟(4)步驟和(6)得到的相對熒光響應(yīng)值，分別通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法，篩選因子貢獻(xiàn)度最大的傳感單元，最終獲得的傳感單元即構(gòu)成靜電復(fù)合物熒光陣列傳感器。

48、本發(fā)明所述的熒光陣列傳感器具有z個傳感單元，所述的z個傳感單元由多個tamra-amp和多個fam-ssdna通過靜電作用形成的組合特異性復(fù)合物。其中fam-ssdna能夠特異性識別細(xì)菌表面的肽聚糖、脂多糖和外膜囊泡等多種共有成分。tamra-amp具有識別廣譜細(xì)菌的功能。通過響應(yīng)不同類型的細(xì)菌所產(chǎn)生差異的熒光信號，分析檢測前后的熒光強(qiáng)度，即可快速區(qū)分多重細(xì)菌。

49、本發(fā)明所述的傳感單元由tamra-amp和fam-ssdna通過靜電相互作用復(fù)合而成。

50、本發(fā)明利用多種機(jī)器學(xué)習(xí)算法對陣列傳感單元與細(xì)菌樣品作用的熒光響應(yīng)信號進(jìn)行處理，對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分類，得到細(xì)菌的陣列可視化“指紋圖譜”實(shí)現(xiàn)可視化識別。將得到的陣列區(qū)分“指紋圖譜”用作模型對未知的樣本進(jìn)行檢測，并計算未知樣本預(yù)測的準(zhǔn)確率，實(shí)現(xiàn)對未知細(xì)菌的檢測和區(qū)分。

51、設(shè)計原理：本發(fā)明選擇對細(xì)菌具有特異性識別的傳感元件，所選的4條ssdna能夠特異性靶向所有細(xì)菌表面共有的肽聚糖(seq?id?no.1～2)、脂多糖(seq?id?no.3)和外膜囊泡(seq?id?no.4)；所選的3條amp為廣譜抗菌肽，同樣能夠特異性吸附在細(xì)菌表面。其次，帶正電的amp和帶負(fù)電的ssdna分別修飾tamra和fam，含有相反電荷的傳感元件通過靜電相互作用結(jié)合，拉近了tamra和fam之間的距離，使得tamra發(fā)揮淬滅作用，fam表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低，相反ssdna中g(shù)堿基可以限制tamra的旋轉(zhuǎn)，tamra也表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度降低。由于fam-ssdna和tamra-amp靶向細(xì)菌的能力不同，加入細(xì)菌時，兩種傳感元件相互競爭與細(xì)菌結(jié)合，復(fù)合體系被破壞，靶向能力弱的一方被置換出來，熒光恢復(fù)；如果靶向能力相當(dāng)，兩種傳感元件與細(xì)菌結(jié)合形成三元復(fù)合體系，影響熒光恢復(fù)。所以，熒光信號的輸出取決于復(fù)合體系對細(xì)菌的作用力。單一的傳感元件存在不能同時區(qū)分多種細(xì)菌的可能。因此，本發(fā)明采用4條fam-ssdna和3條tamra-amp組合成12個傳感單元構(gòu)建陣列傳感器，所述12個傳感單元檢測所有細(xì)菌所輸出的熒光信號經(jīng)過判別分析(lda)分類，得到不同細(xì)菌的分布，即“指紋譜圖”。

52、本發(fā)明所用的傳感元件是生物相容性較好的生物大分子，相比其他傳感元件，所用的傳感元件對細(xì)菌有較強(qiáng)的識別能力，能夠排除環(huán)境中對細(xì)菌檢測的干擾，且傳感元件無需合成，只需要通過簡單復(fù)合即可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確識別細(xì)菌的目的。

53、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

54、本發(fā)明制備得到的傳感器選擇性較高以及無需專業(yè)技術(shù)人員操作，且通過陣列傳感的交叉反應(yīng)性，結(jié)合不同細(xì)菌的檢測結(jié)果形成“指紋圖譜”，以實(shí)現(xiàn)同時對不同種類細(xì)菌的微量檢測。本技術(shù)方案所制備得到的傳感器能夠節(jié)省細(xì)菌樣本預(yù)處理時間，實(shí)現(xiàn)快速檢測和實(shí)時檢測。本發(fā)明制備的傳感器對細(xì)菌有較強(qiáng)的識別能力，能夠排除環(huán)境中對細(xì)菌檢測的干擾，且傳感元件無需合成，只需要通過簡單復(fù)合即可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確識別細(xì)菌的目的。

55、本發(fā)明陣列傳感器制備方法簡單、成本低、靈敏度高可實(shí)現(xiàn)對84例臨床樣本的區(qū)分，可以同時檢測多個樣本或多個靶標(biāo)，在較短的時間內(nèi)完成大量樣本的檢測，不僅縮減固定成本，如設(shè)備和試劑成本，降低了每個樣本的檢測成本，還能及時檢測。此外，該傳感器能準(zhǔn)確區(qū)分多種細(xì)菌，對未知樣本的區(qū)分準(zhǔn)確率較高且重現(xiàn)性好。在實(shí)際臨床樣本的測試中，該陣列傳感器對感染不同致病菌的膿毒血癥患者與正常人血清的區(qū)分準(zhǔn)確率為85％，具有較高的實(shí)用價值。

56、本發(fā)明傳感元件采用商業(yè)化的熒光團(tuán)修飾ssdna和amp，容易獲得，無需專業(yè)人員合成，有利于后期向食品安全和醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)方面的成果轉(zhuǎn)化。在現(xiàn)實(shí)生活中，食品安全、環(huán)境污染和疾病感染等問題往往不是由單一細(xì)菌引起的。該陣列保留了陣列傳感能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測多種細(xì)菌、快速得到準(zhǔn)確結(jié)果的優(yōu)勢。