本發(fā)明屬于體外檢測，具體涉及一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物磷酸化tau-181蛋白（p-tau181蛋白）的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

1、全球現(xiàn)有約5000萬癡呆癥患者，至2050年該數(shù)量預(yù)計將超過1.5億人。在所有癡呆癥中，阿爾茨海默?。╝d,?alzheimer’s?disease）是最為常見的一種類型，約占所有癡呆癥患者的60%-80%。ad診斷由于臨床精準(zhǔn)診斷難度大，同時由于目前ad尚無特效藥，因此臨床醫(yī)生對患者的診斷通常較為慎重。

2、目前ad診斷主要通過幾種不同方法進(jìn)行輔助診斷，主要包括：神經(jīng)心理學(xué)評估量表、腦脊液檢測、ct/mri常規(guī)影像學(xué)檢查以及以aβ和tau-pet為主的靶向分子影像學(xué)診斷方法。然而，由于評估量表存在主觀判斷問題，受到評估者臨床經(jīng)驗(yàn)與判斷能力的較大影響。腦脊液采集難度、采集過程的有創(chuàng)損害以及國內(nèi)臨床資源的限制，腦脊液檢測難以大規(guī)模普及；而且基于腦脊液的檢測和診斷目前主要集中在需要入院治療的重度癡呆群體中，難以在門診有效應(yīng)用。ct/mri等常規(guī)影像學(xué)檢查僅能反映大腦的結(jié)構(gòu)變化，對ad的精準(zhǔn)診斷存在困難。pet設(shè)備成本昂貴、設(shè)備運(yùn)行效率較低，同時受到aβ和p-tau示蹤劑的應(yīng)用限制，因此該方法在ad診斷中難以廣泛普及。與上述四種診斷方法相比，血液樣本穩(wěn)定性較好，易于采集，血液中生物標(biāo)志物濃度較為均一穩(wěn)定，是一種理想的檢測樣本。

3、ad血液生物標(biāo)志物，尤其是atn框架相關(guān)的aβ、p-tau以及神經(jīng)損傷相關(guān)生物標(biāo)志物，在過去幾年的研究中，血液標(biāo)志物作為臨床輔助ad診斷手段的證據(jù)質(zhì)量顯著上升。血液中的ad生物標(biāo)志物由于主要來自腦脊液，這些生物標(biāo)志物在穿過血腦屏障進(jìn)入血液后，通常濃度大幅度下降，顯著增加檢測難度。另外，受限于原理層面的限制，現(xiàn)有的免疫檢測技術(shù)，例如傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光技術(shù)，通常檢測下限在亞ng/ml級別，對許多pg/ml或亞pg/ml濃度范圍的生物標(biāo)志物束手無策，使得大量生物標(biāo)志物無法在臨床有效應(yīng)用。開發(fā)出超出飛克靈敏度性能的一種檢測技術(shù)，被認(rèn)為是開發(fā)這些低豐度新型生物標(biāo)志物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在開發(fā)一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p-tau181蛋白的新方法，以將檢出限降低至pg/ml或亞pg/ml級別，為ad臨床檢測提供無創(chuàng)、可靠的途徑。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p-tau181蛋白的試劑盒，其包括以下組分：

4、磁珠工作液，由p-tau181抗體標(biāo)記的磁珠和緩沖溶液組成；

5、可視化非磁性微球工作液，由總tau抗體標(biāo)記的可視化非磁性微球和緩沖溶液組成；

6、其中，緩沖溶液ph為6.5-8.0，p-tau181抗體標(biāo)記的磁珠中磁珠的尺寸為1-10?μm，總tau抗體標(biāo)記可視化的非磁性微球中可視化非磁性微球的尺寸為1-10?μm。

7、在上述試劑盒中，磁珠表面修飾有羧基、氨基、甲苯磺?；玩溍褂H和素中任一種，且p-tau181抗體通過磁珠表面修飾標(biāo)記在磁珠上。

8、在上述試劑盒中，可視化非磁性微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶?，具體可以為單分散聚苯乙烯微球、彩色聚苯乙烯微球、聚苯乙烯熒光微球等，其中彩色聚苯乙烯微球的顏色包括但不限于為紅色、藍(lán)色、黃色、綠色、黑色等；聚苯乙烯微球表面同樣修飾有羧基、氨基、甲苯磺?；玩溍褂H和素中的任一種，且總tau抗體通過表面修飾標(biāo)記在可視化非磁性微球上。

9、在上述試劑盒中，緩沖溶液可以選自磷酸鹽緩沖液（pbs）、三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris）、3-馬啉丙磺酸緩沖液（mops）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（hepes），在該緩沖溶液中還可以添加牛血清白蛋白、海藻糖、吐溫20、防腐劑等。

10、優(yōu)選地，在上述試劑盒中，緩沖溶液為包含0.5-5?wt%牛血清白蛋白、0.5-5?wt%海藻糖、0.01-0.1?v/v%吐溫20和0.05-0.5?v/v%?proclin?300的0.01~0.2?mol/l?hepes（ph7.4）。

11、在上述試劑盒中，還可以包括標(biāo)準(zhǔn)品，即p-tau181蛋白。

12、基于本發(fā)明提供的試劑盒，本發(fā)明第二方面提供了一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p-tau181蛋白的方法，具體為：

13、取待測樣品，加入磁珠工作液和可視化非磁性微球工作液進(jìn)行孵育，清洗后用緩沖溶液復(fù)溶，取復(fù)溶液于顯微鏡下對形成的復(fù)合物進(jìn)行計數(shù)。

14、在本發(fā)明方法中，利用p-tau181抗體標(biāo)記的磁珠富集待測樣本中的p-tau181蛋白，再與總tau抗體標(biāo)記的可視化非磁性微球共同孵育后，形成固相抗體-抗原-抗體復(fù)合物，結(jié)合在磁珠上的物質(zhì)被磁場吸附，而未結(jié)合的物質(zhì)被清洗除去。在本發(fā)明方法中，復(fù)合物數(shù)量與待測樣本中p-tau181蛋白的濃度成正比，從而達(dá)到定量分析的目的。

15、優(yōu)選地，在上述方法中，磁珠工作液的濃度為0.01-0.5?mg/ml，可視化非磁性微球工作液的濃度為0.01-0.5?mg/ml，且磁珠工作液和可視化非磁性微球工作液的體積比為1:1。

16、優(yōu)選地，在上述方法中，孵育的條件為：37℃孵育5-30?min。

17、優(yōu)選地，在上述方法中，待測樣本為全血或血清。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

19、本發(fā)明在常規(guī)免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)上，采用可視化非磁性微球標(biāo)記抗體，通過限定磁珠與可視化非磁性微球的相對尺寸以及可視化非磁性微球的種類，一方面使得生成的固相抗體-抗原-抗體復(fù)合物在顯微鏡下容易被找到并被計數(shù)，另一方面復(fù)合物中一個磁珠與一個可視化微球結(jié)合，復(fù)合物結(jié)構(gòu)一致性高，故復(fù)合物數(shù)量與樣本中待檢物的濃度成正比，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量檢測。

20、進(jìn)一步優(yōu)化工作液組成以及反應(yīng)體系中p-tau181抗體標(biāo)記的磁珠與總tau抗體標(biāo)記的可視化非磁性微球的用量比例，本發(fā)明方法的檢出限可低至0.01?pg/ml，可見本發(fā)明顯著提高了檢測靈敏度，有望提高阿爾茨海默癥早期的檢出率。

技術(shù)特征：

1.一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p-tau181蛋白的試劑盒，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述可視化非磁性微球?yàn)榫郾揭蚁┪⑶?，且所述聚苯乙烯微球表面修飾有羧基、氨基、甲苯磺?；蜴溍褂H和素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁珠表面修飾有羧基、氨基、甲苯磺?；蜴溍褂H和素。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、3-馬啉丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液中的任一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖溶液中還包含牛血清白蛋白、海藻糖、吐溫20和防腐劑。

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖溶液為包含0.5-5%牛血清白蛋白、0.5-5%海藻糖、0.01-0.1%吐溫20和0.05-0.5%?proclin?300的0.01~0.2mol/l?4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。

7.一種用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p-tau181蛋白的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)權(quán)要所述的試劑盒進(jìn)行檢測，其中所述方法不以疾病的診斷和治療為目的。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，具體為：取待測樣品，加入磁珠工作液和可視化非磁性微球工作液進(jìn)行孵育，清洗后用復(fù)溶，取復(fù)溶液于顯微鏡下對形成的復(fù)合物進(jìn)行計數(shù)。

9.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁珠工作液的濃度為0.01-0.5?mg/ml，所述可視化非磁性微球工作液的濃度為0.01-0.5?mg/ml，所述磁珠工作液和可視化非磁性微球工作液的體積比為1:1。

10.?根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述孵育的條件為：37℃孵育5-30?min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了用于檢測阿爾茨海默癥生物標(biāo)志物p?Tau181蛋白的試劑盒和方法，屬于體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，其中試劑盒包括：由p?Tau181抗體標(biāo)記的磁珠和緩沖溶液組成的磁珠工作液，由總tau抗體標(biāo)記的可視化非磁性微球和緩沖溶液組成的可視化非磁性微球工作液，其中磁珠的尺寸為1?10μm，可視化非磁性微球的尺寸為1?10μm。本發(fā)明方案具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢，可將檢出限降低至0.01?pg/mL，為阿爾茨海默癥提供了一種無創(chuàng)的、可靠的檢測手段。

技術(shù)研發(fā)人員：魏亮,劉萌萌,羅海貝,劉成杰,張佳琪,郭靜,祝丹平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30