本發(fā)明提出一種污水污泥蛋白質(zhì)含量測定的方法，屬于污泥蛋白質(zhì)測量領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、隨著污水處理系統(tǒng)中生物過程的發(fā)展，了解可溶性微生物產(chǎn)物(smps)和細(xì)胞外聚合物(eps)的組成變得越來越重要。smps和eps是多種化合物的混合物，例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、dna、腐殖質(zhì)和小分子物質(zhì)等。蛋白質(zhì)作為各種污水處理系統(tǒng)中的主要化合物，對聚集過程和絮凝能力具有重要意義。因此，需要對生物污水處理污泥中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2、目前，還沒有污泥蛋白提取和定量測量的標(biāo)準(zhǔn)方法。對于蛋白質(zhì)的測量，目前常用的幾種比色法有l(wèi)owry法、改進(jìn)的lowry(m-lowry)法、bca(bicinchonic?acid)法和bradford法。對于lowry法，首先，在堿性條件下，cu2+被蛋白質(zhì)還原為cu+；其次通過還原folin-ciocalteu試劑(磷鉬酸鹽和磷鎢酸鹽)進(jìn)行放大階段會，呈現(xiàn)特征性的藍(lán)色，進(jìn)而進(jìn)行測定。然而，污泥中的腐殖質(zhì)會干擾lowry法的準(zhǔn)確性，因此對其進(jìn)行了修改以減少腐殖酸的干擾，成為m-lowry法。此外，smith等通過用bicinchonic?acid代替folin-cioalteu試劑開發(fā)了bca法，提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度。然而，這三種方法之間存在一個矛盾：ras等研究表明bca比m-lowry方法更合適。jimenez等基于靈敏度、線性、準(zhǔn)確性、正確性和特異性的統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)表明lowry方法優(yōu)于bca方法。有研究表明m-lowry方法與lowry方法相比的優(yōu)勢。至于bradford法，基于coomassie?brilliant?blue?g-250在酸性ph值下與組氨酸精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸殘基的結(jié)合，以及疏水相互作用。研究表明：與lowry法相比，bradford法在測量污水樣品和提取的eps時低估2-4倍的蛋白質(zhì)含量，然而其確切機(jī)制仍未完全了解，可以肯定的是蛋白質(zhì)沒有充分溶解。

3、另一種方法是凱氏氮(kjedahl-n)法，該方法通過測定有機(jī)氮的含量進(jìn)行計算，蛋白質(zhì)含量可通過蛋白質(zhì)/氮轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.25(或6.25g蛋白質(zhì)g?n-1)。然而，由于不同污泥樣品的蛋白質(zhì)/氮轉(zhuǎn)換因子不同，kjedahl-n法并不準(zhǔn)確，這一點已得到公認(rèn)。為避免了kjedahl-n法中蛋白質(zhì)/氮轉(zhuǎn)換因子的變化，有研究提出用氨基酸之和來表示蛋白質(zhì)含量。然而該方法忽略了一個事實，即游離氨基酸的分子量比蛋白質(zhì)結(jié)合時大18個質(zhì)量單位。另外，在氨基酸分析的樣品制備過程中，氨基酸可能會被破壞。例如，在堿化處理過程中，色氨酸會損失約5-10％。在使用鹽酸水解處理時，幾乎破壞所有色氨酸以及部分其他如酪氨酸，絲氨酸和蘇氨酸。此外，它需要比凱氏定氮法更復(fù)雜的設(shè)備，因此可能超出了許多實驗室的能力，特別是那些只進(jìn)行間歇分析的實驗室，不能滿足需要及時蛋白質(zhì)測定的要求。因此，對于蛋白質(zhì)濃度的測定，還需要尋找新的方法。

4、另一方面，為準(zhǔn)確確定污水污泥蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)的提取效率同樣重要。多種物理化學(xué)方法用來增加污水污泥中蛋白質(zhì)的提取效率，如物理法的陽離子交換樹脂、超聲、超離心、加熱和化學(xué)法的堿性試劑、乙二胺四乙酸(edta)、醛溶液等。研究表明triton?x-100可以更有效地提取。但該方法提取效率還需要進(jìn)一步提高，還需要尋找新的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有存在的上述缺陷，提供一種更高效率提取污水污泥蛋白質(zhì)和更準(zhǔn)確測定所提取蛋白質(zhì)濃度的方法，從而更加準(zhǔn)確的確定污水污泥中蛋白質(zhì)的含量。

2、技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，如圖4所示，本發(fā)明提出一種污水污泥蛋白質(zhì)含量測定的方法，該方法包括以下步驟：

3、(1)采用重量法測量污泥的濃度，其濃度記作ρ1；

4、(2)量取1-2ml的污泥，其體積記作v1，置于2ml裂解管中進(jìn)行離心處理，離心的轉(zhuǎn)數(shù)為10000-15000g，時間10-20min，溫度4℃，離心后分離和收集上清液，保留污泥沉淀物，其中，上清液標(biāo)記為樣品①；

5、(3)量取1-2ml蛋白提取試劑，其體積記作v2，置于步驟(2)中的裂解管，將裂解管置于研磨器進(jìn)行震蕩研磨，震蕩速度為3000-5000rpm，時間為30-60s，混合均勻污泥沉淀物和蛋白提取劑；

6、(4)震蕩研磨后，將裂解管置于離心機(jī)進(jìn)行離心處理，離心速度為10000-15000g，時間10-20min，溫度4℃，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管，標(biāo)記為樣品②，保存溫度為4℃；

7、(5)步驟(4)轉(zhuǎn)移上清液后，對裂解管按照步驟(3)和(4)操作步驟再次提取，獲得上清液，標(biāo)記為樣品③；其中，在重復(fù)步驟(3)時，加入的1-2ml蛋白提取試劑的體積標(biāo)記為v3；

8、(6)將100份顯色劑a與1份顯色劑b混合均勻制成混合顯色劑；

9、(7)分別取濃度為2mg/ml的牛血清蛋白0，5，10，15，20和25μl于6個2ml離心管，6個離心管中牛血清蛋白的含量分別為0，10，20，30，40和50μg；

10、(8)分別量取1-50μl的樣品①、②和③，其體積分別記作v11，v22，v33，置于3個2ml離心管；

11、(9)步驟(7)和(8)合計9個2ml離心管，對每個離心管，添加0.5ml沉淀劑c，并使用旋渦混合器混合均勻，室溫靜置2-3min后，添加0.5ml沉淀劑d，并使用旋渦混合器混合均勻后，將離心管置于離心機(jī)進(jìn)行離心處理，離心速度為12000g，時間5min，去除上清液后，加入100μl銅溶液和400μl超純水，使用旋渦混合器混合均勻，此時，離心管中沉淀物處于溶解狀態(tài)，取步驟(6)中1ml混合顯色劑加入離心管，混合均勻后，室溫靜置15-20min；此時，每個2ml離心管中液體體積為1.5ml；

12、和步驟(7)對應(yīng)的6個2ml離心管，其對應(yīng)的牛血清蛋白質(zhì)濃度為0μg/1.5ml，10μg/1.5ml，20μg/1.5ml，30μg/1.5ml，40μg/1.5ml，50μg/1.5ml，對應(yīng)濃度記作ρx1，ρx2，ρx3，ρx4，ρx5，ρx6；

13、(10)步驟(9)靜置結(jié)束后，對每個離心管，顛倒混合三次后轉(zhuǎn)移至比色皿中，將比色管置于分光光度計中讀取吸光度，獲得9個吸光度數(shù)值，分別對應(yīng)步驟(9)中的9個離心管；

14、(11)步驟(10)中9個吸光度數(shù)值中的6個分別對應(yīng)步驟(9)的6個離心管所含牛血清蛋白濃度ρx1，ρx2，ρx3，ρx4，ρx5，ρx6，將該6組相對應(yīng)的吸光度和牛血清蛋白濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得橫坐標(biāo)為牛血清蛋白濃度和縱坐標(biāo)為吸光度的二維標(biāo)準(zhǔn)曲線，對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合后獲得線性方程y＝ax+b，y表示吸光度，x表示牛血清蛋白濃度，a和b為擬合系數(shù)；

15、步驟(10)中9個吸光度數(shù)值中的另外3個分別對應(yīng)步驟(9)的樣品①、②和③3個離心管，將獲得的3個吸光度數(shù)值，通過y＝ax+b得到步驟(9)樣品①、②和③對應(yīng)離心管中等同牛血清蛋白濃度x1，x2，x3；

16、(12)通過步驟(1)污泥濃度ρ1和步驟(2)污泥體積v1獲得污泥質(zhì)量m＝ρ1×v1；

17、通過步驟(10)牛血清蛋白濃度x1，x2，x3和相對應(yīng)的步驟(9)體積1.5ml，獲得步驟(8)體積分別記作v11，v22，v33含有的蛋白質(zhì)量，記作m1，m2，m3，即m1＝x1×1.5ml，m2＝x2×1.5ml，m3＝x3×1.5ml，通過步驟(2)中體積v1，獲得樣品①中蛋白質(zhì)含量，記作m1＝m1×v1/v11，通過步驟(3)中的體積v2，獲得樣品②中蛋白質(zhì)含量，記作m2＝m2×v2/v22，通過步驟(5)，獲得樣品③中蛋白質(zhì)含量，記作m3＝m3×v3/v33；

18、將樣品①、②和③中的蛋白質(zhì)量相加獲得污泥蛋白總質(zhì)量，記作m0＝m1+m2+m3；

19、獲得污泥蛋白含量為m0/m＝(m1+m2+m3)/(ρ1×v1)。

20、進(jìn)一步的，步驟(2)中，使用的裂解管為lysing?matrix?e管。

21、進(jìn)一步的，步驟(3)中，蛋白提取試劑為b-per試劑。

22、進(jìn)一步的，步驟(6)中，顯色劑a為ge?healthcare?28955980，顯色劑b為gehealthcare?28955984。

23、進(jìn)一步的，步驟(9)中，沉淀劑c為ge?healthcare?28955971，沉淀劑d為gehealthcare?28955977，超純水電阻率為18-18.3mω*cm。

24、進(jìn)一步的，步驟(10)中，分光光度計的分析波長為480nm，并使用超純水做參比溶液。

25、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下有益技術(shù)效果：

26、(1)本發(fā)明的蛋白質(zhì)濃度測定方法更加準(zhǔn)確；

27、(2)本發(fā)明的蛋白質(zhì)提取效率更高，且耗時短；

28、(3)本發(fā)明測定污水污泥蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確度更高。