本發(fā)明涉及快速檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于轉(zhuǎn)換柱的正讀模式競(jìng)爭(zhēng)免疫層析小分子快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

0、技術(shù)背景

1、免疫層析方法因具有操作簡(jiǎn)便、快速和抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的常用方法。根據(jù)其檢測(cè)原理，免疫層析方法可分為兩類：雙抗夾心法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法。雙抗夾心法通常用于具有多種抗原決定簇的大分子物質(zhì)，比如蛋白質(zhì)，檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)弱與待測(cè)物濃度成正比，當(dāng)極微量的待測(cè)物存在時(shí)，即可形成裸眼可辨別的微弱條帶；而在檢測(cè)小分子時(shí)，因?yàn)樾》肿訜o法同時(shí)與一種以上的抗體結(jié)合，通常采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法，檢測(cè)線上的信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)物濃度成反比，小分子含量越高則檢測(cè)線信號(hào)越弱，定性分析常以檢測(cè)線信號(hào)完全消失作為陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)，此模式需要大量的小分子才能完全阻斷檢測(cè)線信號(hào)，因此檢測(cè)靈敏度不高，很難滿足小分子痕量存在時(shí)的檢測(cè)。如能將傳統(tǒng)的小分子檢測(cè)模式轉(zhuǎn)換為檢測(cè)大分子的“雙抗夾心”模式，則可顯著提高小分子檢測(cè)的靈敏度。

2、基于上述情況，我們通過轉(zhuǎn)換柱將檢測(cè)小分子的競(jìng)爭(zhēng)抑制模式轉(zhuǎn)化為檢測(cè)大分子的雙抗夾心模式，使檢測(cè)分子量數(shù)百的小分子轉(zhuǎn)化為檢測(cè)分子量十五萬的免疫球蛋白g(igg)，極大地提高了小分子檢測(cè)的靈敏度。同時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)簡(jiǎn)易紙支架以替代傳統(tǒng)的鐵架臺(tái)或塑料支架，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換柱的垂直固定，不僅可以節(jié)省成本，而且環(huán)保。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種小分子檢測(cè)試劑盒，主要包括目標(biāo)小分子的鼠igg單克隆抗體、轉(zhuǎn)換柱、通用igg檢測(cè)試紙條和環(huán)保紙支架四部分。

2、目標(biāo)小分子的鼠igg單克隆抗體可以特異性結(jié)合目標(biāo)小分子。

3、轉(zhuǎn)換柱由目標(biāo)小分子(或其人工抗原)與瓊脂糖或纖維素等具有支撐功能的凝膠共價(jià)偶聯(lián)后填裝而成，包含頂部封口膜，底塞和承接皿。

4、通用試紙條包括濾紙、樣本墊、結(jié)合釋放墊、nc膜和吸水紙五部分。其中，結(jié)合釋放墊上固定具有信號(hào)輸出能力的探針(比如標(biāo)記抗鼠igg單克隆抗體1的膠體金或熒光微球)，nc膜檢測(cè)線上固定抗鼠igg單克隆抗體2，對(duì)照線上固定protein?g?？故骾gg抗體可以是牛、羊、兔、驢等動(dòng)物的抗鼠igg抗體，抗鼠igg單克隆抗體1和2是一對(duì)檢測(cè)igg的配對(duì)抗體。

5、環(huán)保紙支架用于轉(zhuǎn)換柱的垂直固定，包括兩種設(shè)計(jì)：一種是可以通過四條虛線折疊成支架的硬質(zhì)紙片，稱為四腳式的可折疊支架(圖1)；另一種是帶有粘膠和圓孔的硬質(zhì)紙片，稱為粘貼式的粘貼式支架(圖2)，將紙片對(duì)折后去掉粘膠保護(hù)膜，粘貼在任何可固定的垂直面上，如試劑盒的外包裝盒，粘貼位置距離桌面垂直高度約2cm。

6、具體地，所述可折疊支架包括連接主體(11)和多個(gè)均勻分布于所述連接主體(11)的支腳(12)；所述連接主體(11)設(shè)置有第一固定孔(13)，所述第一固定孔(13)用于固定轉(zhuǎn)換柱；多個(gè)所述支腳(12)均配置為在同向折疊后使所述連接主體(11)與所述支腳(12)底部的支撐面產(chǎn)生高度差。

7、具體地，所述粘貼式支架包括位于彎折部(21)兩端的粘貼部(22)和固定部(23)；所述固定部(23)設(shè)置有第二固定孔(24)，所述第二固定孔(24)用于固定轉(zhuǎn)換柱；所述粘貼部(22)設(shè)置有粘貼件(25)，可粘貼于垂直面，用于將所述粘貼式支架固定；所述彎折部(21)用于彎折所述粘貼式支架，使轉(zhuǎn)換柱穿過第二固定孔(24)后保持豎直狀態(tài)。

8、小分子檢測(cè)試劑盒的使用方法為：打開試劑盒，取出環(huán)保紙支架折疊放置或粘貼固定；取出轉(zhuǎn)換柱，將其插入紙支架的小孔中，下置承接皿，打開底部塞子和頂部封口膜；取出裝有目標(biāo)小分子鼠igg單克隆抗體干粉的試管，與200μl待測(cè)樣液混合均勻后滴入轉(zhuǎn)換柱；2分鐘后，將試紙條樣本墊一側(cè)插入承接皿，10分鐘后取出試紙條觀察，如有條帶出現(xiàn)，說明待測(cè)液中含有目標(biāo)小分子，還可以通過試紙條信號(hào)讀取儀測(cè)定目標(biāo)小分子的含量。

9、本發(fā)明包括以下技術(shù)方案：

10、(1)轉(zhuǎn)換柱的制備

11、稱取30gcnbr活化的sepharose凝膠干粉，懸浮于250ml的1mm鹽酸溶液中，完全溶脹后得到100ml溶膠；在抽濾漏斗中以250ml體積的1mm鹽酸洗滌，再用1l含有0.1m碳酸氫鈉和0.5m氯化鈉的結(jié)合液潤洗5次；隨后將凝膠與等體積2mg/ml的小分子全抗原室溫緩慢攪拌3小時(shí)，然后加入50mg/ml牛血清白蛋白(bsa)200ml室溫緩慢攪拌1.5小時(shí)；轉(zhuǎn)到抽濾漏斗，以15倍體積0.01m磷酸鹽緩沖溶液(pbs)分5次充分洗滌，最后一次用含有0.3％疊氮鈉(nan3)的0.01m?pbs洗滌，抽干后裝入轉(zhuǎn)換柱，轉(zhuǎn)換柱大小和形狀類似于200μl移液器吸頭，上下置2個(gè)墊片(上墊片321和下墊片322)將凝膠(33)固定，底端用塞子(34)封口，頂端用薄膜(31)密封(圖3)。

12、(2)通用試紙條的制備

13、通用試紙條由濾紙、樣本墊、結(jié)合釋放墊(固定具有信號(hào)輸出能力的納米探針，比如標(biāo)記抗鼠igg單克隆抗體1的膠體金或熒光微球)、nc膜(檢測(cè)線固定抗鼠igg單克隆抗體2，質(zhì)控線固定protein?g)和吸水紙五部分組成。

14、a.樣本墊的制備

15、用含有1.0％?bsa、0.25％?tween-20和20mm硼酸鈉緩沖液(0.1％(w/v)nan3,ph8.0)浸泡玻璃纖維紙，室溫下自然晾干。

16、b.結(jié)合釋放墊的制備

17、聚酯纖維膜用10mm的磷酸鹽緩沖鹽水(含0.1％吐溫-20和1％?bsa，ph7.4)浸潤5分鐘，37℃干燥過夜。

18、具有信號(hào)輸出能力的納米探針(比如：膠體金和熒光微球)標(biāo)記抗鼠igg單克隆抗體1的步驟如下：

19、(1)膠體金標(biāo)記抗鼠igg單克隆抗體1

20、將1ml的1％?haucl4溶液加入99ml純水中并加熱至沸騰，在不斷攪拌下加入2.3ml的1％檸檬酸鈉溶液，保持沸騰10分鐘，冷卻后將ph調(diào)至6.5～7.8。

21、1ml濃度為1mg/ml的抗鼠igg單克隆抗體1加入200ml上述膠體金溶液，室溫下緩慢攪拌2小時(shí)，向混合物中加入100ml的15％?bsa水溶液，室溫下緩慢攪拌封閉1.5小時(shí)，4℃離心10分鐘(離心力為4446g)后，棄上清，沉淀重懸于10ml磷酸緩沖液(pb)(含有25％蔗糖、0.1％?bsa和0.1％異噻唑啉酮防腐劑(proclin?300)，ph?7.4)中，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

22、(2)熒光微球標(biāo)記抗鼠igg單克隆抗體1

23、取100μl熒光微球(10mg/ml)，與20ml?mes緩沖液(0.05mm,ph?6.0)渦旋混勻后；依次加入交聯(lián)劑碳二亞胺、n-羥基琥珀酰亞胺(碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺現(xiàn)配現(xiàn)用)，室溫反應(yīng)15分鐘；4℃離心20分鐘(離心力7000g)，去除上清液；加入20ml硼酸緩沖液(10mm,ph8.0)，渦旋混勻，如有必要進(jìn)行超聲處理；隨后加入150μg抗體，混勻，室溫反應(yīng)2小時(shí)后加入5ml的10％?bsa。混勻，室溫反應(yīng)30分鐘；4℃離心30分鐘(離心力為7000g)后去上清，用10mm硼酸緩沖液(ph?8.0)清洗兩遍；加入3ml保存液(2％蔗糖、1％海藻酸、1％聚乙二醇20000、1％酪蛋白和0.4％吐溫-20)4℃下儲(chǔ)存。

24、將上述制備的igg檢測(cè)探針以10μl/cm噴涂在結(jié)合釋放墊上，置于37℃的真空干燥箱中干燥6小時(shí)，置于室溫干燥條件保存。

25、c.nc膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線的制備

26、將2mg/ml抗鼠igg單克隆抗體2和4mg/ml?protein?g分別以0.75μl/cm噴涂在檢測(cè)線位置和質(zhì)控線位置，兩條線之間的距離為5mm，將nc膜置于37℃恒溫干燥箱中12小時(shí)，并放于室溫干燥條件保存。

27、d.試紙條的組裝

28、將nc膜粘附在塑料背板上中央，濾紙、樣本墊和結(jié)合釋放墊依次粘附在nc膜一端，另一端粘附吸水紙。隨后，切割成寬度為4mm的單條，密封在遮光袋中，室溫干燥條件保存。

29、(3)試劑盒的使用

30、樣本提取液經(jīng)適當(dāng)稀釋，ph調(diào)至6.5～8.0范圍內(nèi)。

31、取200μl上述待測(cè)液加入裝有目標(biāo)小分子igg單克隆抗體干粉的試管中，混勻片刻。

32、轉(zhuǎn)換柱取出插入環(huán)保紙支架，底下放置承接皿，撕開轉(zhuǎn)換柱上面的封口膜，拔掉底塞，倒入混合液，約2分鐘(當(dāng)液體不再連續(xù)滴落)，將試紙條插入承接皿中，10分鐘后，觀察檢測(cè)線條帶，如果出現(xiàn)條帶，說明待測(cè)物中含有目標(biāo)小分子，還可以通過試紙條信號(hào)讀取儀測(cè)定目標(biāo)小分子的含量。

33、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

34、本發(fā)明提供的小分子檢測(cè)試劑盒，通過轉(zhuǎn)換柱和通用的免疫層析試紙條將傳統(tǒng)檢測(cè)小分子的免疫層析競(jìng)爭(zhēng)抑制模式轉(zhuǎn)換成雙抗夾心模式。檢測(cè)線上的反讀信號(hào)轉(zhuǎn)換成正讀信號(hào)，使得小分子痕量存在時(shí)即可使試紙條的檢測(cè)線出現(xiàn)信號(hào)，相較于傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)型免疫層析方法具有檢測(cè)靈敏度高的特點(diǎn)。