本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種基于過(guò)濾原理的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法。

背景技術(shù)：

1、膠內(nèi)酶解(in-gel?digestion)是目前蛋白質(zhì)化學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一種主流前處理方法。該方法涉及將蛋白通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)分離并染色，然后切下條帶，并使用蛋白酶將膠內(nèi)的蛋白水解成多肽。隨著近些年來(lái)大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，前處理技術(shù)也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。雖然溶液內(nèi)酶解以及基于濾膜或磁珠的酶解方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用日益增多，但膠內(nèi)酶解依然是最為經(jīng)典且無(wú)法替代的前處理方法。

2、膠內(nèi)酶解方法的建立可以追述到上世紀(jì)90年代matthias?mann組在nature雜志上發(fā)表的關(guān)于使用納升電噴霧離子源質(zhì)譜測(cè)序丙烯酰胺膠中的蛋白序列，該方法可適用于考馬斯亮藍(lán)或銀染色的膠。經(jīng)過(guò)十年時(shí)間的上千次反復(fù)實(shí)踐及淬煉，matthias?mann組于2006年在nature?protocol雜志上發(fā)表了題為《in-gel?digestion?for?mass?spectrometriccharacterization?of?proteins?and?proteomes》的論文。該文章詳細(xì)闡述了進(jìn)行膠內(nèi)酶解實(shí)驗(yàn)的試劑儀器、實(shí)驗(yàn)步驟方法，以及可能出現(xiàn)的問(wèn)題和解決策略。這篇文章所記錄的實(shí)驗(yàn)方法被蛋白質(zhì)化學(xué)及組學(xué)的研究者廣泛使用，并被奉為行業(yè)內(nèi)經(jīng)典。之后雖然也有關(guān)于膠內(nèi)酶解方法改進(jìn)的工作，但主要是針對(duì)使用試劑以及反應(yīng)步驟時(shí)間的調(diào)整，整體實(shí)驗(yàn)還都是在ep管里進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)框架并沒(méi)有很大改動(dòng)。

3、在離心管內(nèi)進(jìn)行膠內(nèi)酶解的方法，進(jìn)行樣品前處理時(shí)需要人工對(duì)每個(gè)樣品多次吸取廢液，耗費(fèi)實(shí)驗(yàn)耗材，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，并且不易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。此外，在多次轉(zhuǎn)移和處理過(guò)程中，對(duì)于性狀軟的蛋白膠，吸取廢液時(shí)可能會(huì)堵住槍頭或者將膠體吸走，導(dǎo)致樣品損失；性狀硬而脆的蛋白膠容易破裂并產(chǎn)生碎膠小顆粒，這些碎片同樣可能被誤吸走導(dǎo)致?lián)p失。因此，亟需研發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)更短、更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，并提供一種基于過(guò)濾原理的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法。

2、本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供一種基于過(guò)濾原理的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法，具體步驟如下：

4、s1：將樣品蛋白通過(guò)凝膠電泳分離并對(duì)蛋白膠染色脫色后，切下目標(biāo)條帶并切成膠粒；

5、s2：將步驟s1得到的膠粒轉(zhuǎn)移至含有濾膜或篩板的過(guò)濾裝置中，在過(guò)濾裝置下方設(shè)置抽吸設(shè)備或者上方設(shè)置正壓送氣設(shè)備；所述過(guò)濾裝置中的濾膜或篩板孔徑小于膠粒的尺寸；用水沖洗膠粒后，利用抽吸設(shè)備或者正壓送氣設(shè)備排干水分，保持膠粒位于過(guò)濾裝置的濾膜或篩板上；

6、s3：向步驟s2中的過(guò)濾裝置中加入脫色液，進(jìn)行震蕩脫色，脫除樣品蛋白上的染色液；每次震蕩脫色后，利用抽吸設(shè)備或正壓送氣設(shè)備排干脫色液，直至膠粒脫色完全；

7、s4：向步驟s3中的過(guò)濾裝置中加入有機(jī)溶劑潤(rùn)洗膠粒，膠粒完全脫水干燥后，利用抽吸設(shè)備或正壓送氣設(shè)備排干有機(jī)溶劑；

8、s5：向步驟s4中的過(guò)濾裝置中加入沒(méi)過(guò)膠粒的蛋白酶溶液，進(jìn)行酶解反應(yīng)，得到肽段溶液；利用抽吸設(shè)備或正壓送氣設(shè)備將肽段溶液轉(zhuǎn)移至其它容器中，用于后續(xù)研究。

9、作為優(yōu)選，對(duì)步驟s4脫水干燥后的膠粒進(jìn)行二硫鍵還原和烷基化修飾，具體如下：

10、向步驟s4中的過(guò)濾裝置中加入沒(méi)過(guò)膠粒的二硫蘇糖醇溶液或三(2-羧乙基)膦溶液，在24-55℃進(jìn)行還原反應(yīng)20-60分鐘，還原蛋白中的二硫鍵；排去還原反應(yīng)后的廢液，加入有機(jī)溶劑潤(rùn)洗膠粒，膠粒完全脫水后，排走有機(jī)溶劑；

11、隨后加入沒(méi)過(guò)膠粒的氯乙酰胺溶液、碘乙酰胺溶液、碘乙酸溶液或n-乙基馬來(lái)酰亞胺溶液，在室溫或室溫避光條件下對(duì)還原巰基進(jìn)行烷基化修飾20-30分鐘；排走烷基化修飾反應(yīng)后的廢液，加入有機(jī)溶劑潤(rùn)洗膠粒，膠粒完全脫水后，排走有機(jī)溶劑；

12、所述有機(jī)溶劑采用100％乙腈溶液、甲醇溶液或乙醇溶液。

13、進(jìn)一步的，所述二硫蘇糖醇溶液中的二硫蘇糖醇濃度為25mm；所述三(2-羧乙基)膦溶液中的三(2-羧乙基)膦濃度為20mm；所述氯乙酰胺溶液中的氯乙酰胺濃度為55mm；所述碘乙酰胺溶液中的碘乙酰胺濃度為55mm；所述碘乙酸溶液中的碘乙酸濃度為55mm；所述n-乙基馬來(lái)酰亞胺溶液中的n-乙基馬來(lái)酰亞胺濃度為55mm；

14、所述二硫蘇糖醇溶液、三(2-羧乙基)膦溶液、氯乙酰胺溶液、碘乙酰胺溶液或碘乙酸溶液的溶劑采用50mm碳酸氫銨溶液、10mm磷酸鹽緩沖液、100mm碳酸氫三乙基銨溶液或20mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液。

15、作為優(yōu)選，步驟s1中所述樣品蛋白的質(zhì)量為0.01-200μg；所述染色采用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染色。

16、作為優(yōu)選，所述抽吸設(shè)備或正壓送氣設(shè)備為真空泵；步驟s2中，采用膠粒1-3倍體積的水清洗膠粒2遍，并用真空泵排干水分。

17、作為優(yōu)選，步驟s3中所述的脫色液中含有30％～50％的乙腈、甲醇或乙醇，還含有50mm碳酸氫銨、10mm磷酸鹽、100mm碳酸氫三乙基銨或20mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸；

18、加入脫色液的體積為膠粒的1-3倍；所述震蕩脫色在25-37℃恒溫混勻儀中進(jìn)行，震蕩速率為500-1000rpm，每次震蕩脫色時(shí)間為15-40分鐘。

19、作為優(yōu)選，步驟s4中加入有機(jī)溶劑的體積為膠粒的1-3倍，浸泡潤(rùn)洗膠粒多次，每次5-15分鐘，直至膠粒完全變白變硬；采用真空泵，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下排走有機(jī)溶劑；所述有機(jī)溶劑采用100％乙腈溶液、甲醇溶液或乙醇溶液。

20、作為優(yōu)選，步驟s5中所述酶解反應(yīng)前，先將膠粒置于蛋白酶溶液中，于0-5℃條件下浸泡0.1-3小時(shí)，隨后在蛋白酶具有活性的溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)1-16小時(shí)；所述蛋白酶溶液采用濃度為1-50ng/μl的胰蛋白酶。

21、作為優(yōu)選，步驟s5中酶解反應(yīng)完成后，加入酸控制ph值在1-3，終止酶解反應(yīng)。

22、作為優(yōu)選，步驟s5中酶解反應(yīng)完成后，加入沒(méi)過(guò)膠粒的萃取液提高肽段的回收率；所述萃取液采用含有30-50％乙腈和0.1％甲酸的水溶液、含有30-50％甲醇和0.1％甲酸的水溶液或者含有30-50％乙醇和0.1％甲酸的水溶液。

23、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，具有以下有益效果：

24、(1)本發(fā)明提供的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法能夠縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材：

25、蛋白膠內(nèi)酶解前處理實(shí)驗(yàn)的操作步驟重復(fù)且繁多，尤其是棄廢液的操作。采用傳統(tǒng)離心管的方式進(jìn)行樣品前處理時(shí)，每個(gè)樣品人工吸取廢液的次數(shù)為14-17次；若是銀染膠塊則吸取廢液的次數(shù)更多。在樣品數(shù)目多的情況下(如20個(gè)以上)，處理完所有樣品的時(shí)間更會(huì)成倍增加。如果采用本發(fā)明的過(guò)濾裝置進(jìn)行膠內(nèi)蛋白酶解前處理，可以同時(shí)一次棄去所有樣品的廢液，省去人工依次對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)吸棄廢液的過(guò)程，從而大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材(如槍頭)等。

26、(2)本發(fā)明提供的膠內(nèi)蛋白酶解前處理方法更加適用于不同性狀的蛋白膠樣品：

27、目前可以用于跑蛋白電泳的膠有市面上可售的預(yù)制膠和實(shí)驗(yàn)室自制膠，由于丙烯酰胺濃度以及所用緩沖鹽的不同，每種膠的性狀都有差異，軟硬程度也不同。對(duì)于只跑濃縮膠的樣品，蛋白膠樣性狀偏軟，有的膠和水融為一體。在用傳統(tǒng)離心管處理此類樣品時(shí)，吸取廢液時(shí)容易堵住槍頭，增加實(shí)驗(yàn)操作難度；或者把膠誤吸走，損失樣品。也有一些膠偏硬偏脆、容易破裂，在用傳統(tǒng)離心管處理此類樣品時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些小的碎膠顆粒，吸取廢液時(shí)容易把碎膠吸走；酶解完萃取肽段時(shí)，也會(huì)增加吸到碎膠的風(fēng)險(xiǎn)；以至于旋干復(fù)溶上機(jī)時(shí)，這些殘留下來(lái)的極小碎膠會(huì)造成質(zhì)譜上樣采集時(shí)儀器捕集柱和分析柱堵塞的風(fēng)險(xiǎn)。采用本發(fā)明提出的過(guò)濾裝置進(jìn)行膠內(nèi)蛋白酶解前處理，選擇孔徑大小合適的裝置，可以完全避免以上風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。