本發(fā)明屬于細胞明場識別用的染色，涉及一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑及其應用。

背景技術：

1、網(wǎng)織紅細胞是紅細胞在成熟過程中的一個過渡階段，是介于未成熟的紅細胞(原紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞)與成熟紅細胞之間的一種形態(tài)。它們對于理解造血功能、評估貧血狀況及血液疾病的治療效果等方面具有重要意義。網(wǎng)織紅細胞在血液中的數(shù)量比例(網(wǎng)織紅細胞百分率)和絕對值(網(wǎng)織紅細胞計數(shù))反映了骨髓生成紅細胞的能力和速度，是評估機體紅細胞生成狀態(tài)的重要指標。在貧血的診斷過程中，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)有助于判斷貧血的類型。如再生障礙性貧血(aa)患者的網(wǎng)織紅細胞計數(shù)通常顯著降低，提示骨髓紅系造血功能減低；而溶血性貧血患者則表現(xiàn)為網(wǎng)織紅細胞計數(shù)明顯增高，反映骨髓對紅細胞破壞后的代償性增生。正常人的網(wǎng)織紅細胞占比約為0.5-1.5％。

2、網(wǎng)織紅細胞胞漿內含有一種稱為網(wǎng)狀結構的嗜堿性物質，這是由核糖核酸(rna)、蛋白質和少量線粒體等成分組成的未完全退化的細胞器。這些網(wǎng)狀物質在瑞氏染色或煌焦油藍染色下呈現(xiàn)藍色或紫色，通過顯微鏡油鏡可以清晰觀察到。如未經(jīng)染色，網(wǎng)織紅細胞無法與正常紅細胞區(qū)分。

3、現(xiàn)有研究中，已有專門針對網(wǎng)織紅細胞的染色方法，如“網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的參考方法”中說明了一種網(wǎng)織紅細胞的染色方法，其中直接采用了磷酸鹽用作緩沖鹽提供一個等滲的離子濃度環(huán)境，采用新亞甲藍染料進行染色，將血液樣本和染色試劑，以1:1或1:2的比率混合進行，染色的時間約為3分鐘到5分鐘；染色后的樣本再涂敷在載玻片上進行涂片后觀察。由于采用等滲的離子濃度環(huán)境，該方法對核酸物質含量比較豐富的網(wǎng)織紅細胞染色效果較好，但是染色需要的時間比較長，且不同網(wǎng)織紅細胞比值需要計數(shù)不同紅細胞數(shù)，手工計數(shù)復雜且繁瑣，這種耗時、繁瑣的標準方法對臨床檢測是一大挑戰(zhàn)。

4、專利公開號為“cn?116413110?a”名稱為“網(wǎng)織紅細胞染色試劑組，盒以及網(wǎng)織紅細胞染色方法”中，提供了一種在細胞懸浮狀態(tài)下的進行細胞染色的染色試劑，該試劑是兩步染色法(含兩種獨立的液體試劑)，先將樣本加入染色試劑a，等待m秒(m秒大于等于20秒)，再加入穩(wěn)定試劑b，混勻后形成染色混合液體再進行觀察，該方法直接對血液細胞懸浮液染色，且不破壞紅細胞，對網(wǎng)織紅細胞進行計數(shù)，受稀釋倍數(shù)的限制(血液約稀釋50-100倍)，該方法計數(shù)的網(wǎng)織紅細胞數(shù)量有限且染色效果一般，對內容物含量較少的網(wǎng)織紅細胞染色效果較差，對網(wǎng)織紅細胞的漏識別率高。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中網(wǎng)織紅細胞染色時間長且染色不夠充分的問題，本發(fā)明提供了一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑及其應用，本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定性好、染色效率高、分類特征明顯、僅用一種液體試劑就能對網(wǎng)織紅細胞進行快速染色的方法，且不受稀釋倍數(shù)的限制，該試劑能裂解絕大部分正常紅細胞，網(wǎng)織紅細胞的特征突出；使其能夠適用于基于機器視覺原理、以細胞形態(tài)學分析技術對樣品中網(wǎng)織紅細胞進行自動識別與分類計數(shù)，保證檢測結果的準確性；紅細胞無需固定洗脫處于懸浮狀態(tài)下的一種染色方法，能在明場實現(xiàn)對網(wǎng)織紅細胞的識別。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

3、一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑，試劑成分中包含有染色劑、調節(jié)鹽、穿膜劑、防腐劑、固定劑。

4、各成分作用具體如下：

5、染色劑在液體狀態(tài)下通過膜上的孔迅速進入網(wǎng)織紅細胞，與胞質內嗜堿性物質結合而使其著色；

6、調節(jié)鹽用于調節(jié)試劑的滲透壓，為染色提供適宜的ph環(huán)境，使染料更易進入細胞；

7、穿膜劑在紅細胞細胞膜上打孔，因正常紅細胞染料進入也不會著色，沒有能被上色的內容物，受低滲透壓的影響，正常紅細胞會被完全破壞，因網(wǎng)織紅細胞較正常紅細胞內容物多，且溶液內有固定劑成分，網(wǎng)織紅細胞以及白細胞不會被完全破壞且能保持一定形態(tài)；因穿膜劑的存在，樣本與試劑混合均勻后即可上色，較其他染色方法明顯縮短了染色時間；

8、固定劑一定程度能使細胞在保持細胞的完整形態(tài)；

9、防腐劑則使試劑能夠長久保存。

10、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

11、一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑，包括調節(jié)鹽、穿膜劑、固定劑、抗凝劑、防腐劑、染色劑，染色24h后細胞形態(tài)仍如即時染色的效果，不會褪色或者染色程度加深導致無法辨別；

12、試劑中各成分和濃度為如下：

13、調節(jié)鹽，選自磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液中的一種，濃度為0.01-0.1m，ph為7.0-8.0；調節(jié)鹽中還添加nacl或kcl，濃度為0.01-2g/l；

14、穿膜劑，選自洋地黃皂苷、皂苷，或者tritonx-100，np-40和brij-58非離子型表面活性劑中的一種，穿膜劑濃度為2-6g/l；

15、固定劑，選自海藻糖，濃度為10-20g/l；

16、抗凝劑，選自edta鹽，包括edta2k、edta3k、edta2na中的一種，濃度為2-10mm；

17、防腐劑，選自proclin950或proclin300；

18、染色劑，選自新亞甲藍、燦爛甲酚藍等核酸結合染料中的一種，濃度為0.1-0.5g/l；

19、所述的快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑的配制方法：

20、依次稱取調節(jié)鹽、穿膜劑、固定劑、抗凝劑、防腐劑置于燒杯中，加入超純水，最后加入染色劑攪拌至完全溶解，過濾后即可使用。

21、進一步的，試劑中：

22、調節(jié)鹽選自na2hpo4、kh2po4組成的磷酸鹽緩沖液，其中添加nacl；

23、通透劑選自tritonx-100；

24、固定劑選自海藻糖；

25、抗凝劑選自edta2na；

26、防腐劑選自proclin300；

27、染色劑選自新亞甲藍。

28、本發(fā)明還涉及上述一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑的應用，是一種用于網(wǎng)織紅細胞計數(shù)的方法，包括以下步驟：

29、1)向試劑中加入待測血液樣品，快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑和待測血液樣品的比例為(10-15):1，無染色等待的時間，搖勻后即加入到計數(shù)板中孵育；

30、2)將孵育后的計數(shù)板送入基于機器視覺原理、以ai識別技術進行自動識別與分類計數(shù)的分析儀中，分層掃描檢測獲得網(wǎng)織紅分類計數(shù)結果；

31、染色后網(wǎng)織紅細胞的具體形態(tài)特征如下：細胞無細胞核，但胞質內能看見藍色點狀物，從而與正常紅細胞與白細胞明顯區(qū)分；

32、染色24h后細胞形態(tài)仍如即時染色的效果，不會褪色或者染色程度加深導致無法辨別。

33、步驟2)所述的分層掃描檢測，是因為網(wǎng)織紅細胞細胞密度較輕，在計數(shù)板上沉降時間較慢，分層掃描可解決這一問題。

34、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

35、1、本發(fā)明所述的一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑，固定劑不能從現(xiàn)有的甲醛、多聚甲醛或戊二醛等常規(guī)固定劑中選擇，現(xiàn)有的這些固定劑會導致紅細胞的破膜效果變差，影響儀器識別。本技術選擇海藻糖，因為海藻糖能夠在實驗條件下在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護生物分子結構不被破壞；本發(fā)明使用的兩種染料均不具備親脂性，透過磷脂雙分子層的效率極低，創(chuàng)新性的配合穿膜劑和固定劑使用，可以溶解部分磷脂雙分子層，使染料進入細胞的效率大幅提高，同時胞內物質不會外流，即使核酸物質含量少的網(wǎng)織紅細胞也能被檢測到；本技術使用的固定劑使磷脂雙分子層不被穿膜劑完全裂解導致細胞破裂，染色24h后細胞形態(tài)仍如即時染色的效果，不會褪色或者染色程度加深導致無法辨別。

36、2、本發(fā)明所述的一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑，操作簡便，一步上色；無染色等待時間，樣本與試劑混合后即可上色；合適的固定劑，提高染色效率的同時，目標細胞保留染色特征。

37、3、本發(fā)明所述的一種快速網(wǎng)織紅細胞染色試劑，破壞正常紅細胞，僅計數(shù)網(wǎng)織紅細胞，網(wǎng)織紅細胞密度高，計算準確。