本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物，具體涉及多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、帕金森病(parkinson’s?disease，pd)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要由黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變引起。目前尚未發(fā)現(xiàn)帕金森病的有效治療方法，治療策略仍側(cè)重于通過多巴胺能活性的恢復(fù)進(jìn)行癥狀管理，例如：使用左旋多巴的藥物治療及腦深部電刺激。這些治療方法的治療效果都極其有限，無法阻止疾病的發(fā)展。細(xì)胞移植和替代被認(rèn)為是最具希望和潛力的pd新療法，可能實(shí)現(xiàn)治愈帕金森病。1987年，瑞典隆德大學(xué)首次使用胎兒的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞移植。然而，除了胎兒細(xì)胞移植中的倫理問題之外，供體細(xì)胞的來源以及免疫排斥問題都阻礙著這項(xiàng)治療的發(fā)展。近年來，隨著以多能干細(xì)胞為代表的生物技術(shù)的發(fā)展，人多能干細(xì)胞(hpscs)包括人胚胎干細(xì)胞(hescs)和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipscs)能夠被誘導(dǎo)體外分化得到具有功能性的多巴胺能神經(jīng)元。其誘導(dǎo)分化過程包括底板誘導(dǎo)分化生成增殖前體細(xì)胞(包括底板前體細(xì)胞，floor?plate?progenitors)，然后經(jīng)神經(jīng)源性轉(zhuǎn)化分化為有絲分裂停止后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞(postmitoticdopaminergic?neuron?progenitors)，進(jìn)而分化為成熟的多巴胺能神經(jīng)元(kriks?et?al.(2011)nature480,547-551；kikuchi?et?al.(2017)nature?548,592-596)。在pd細(xì)胞治療中，通常是移植主要包含多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞和/或分裂停止后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的細(xì)胞類群，這些細(xì)胞移植后可以在體內(nèi)分化為含有多巴胺能神經(jīng)元的移植物。然而，hpscs分化得到的供體細(xì)胞存在異質(zhì)性，并不是單一類型的神經(jīng)前體細(xì)胞，是多種類型和命運(yùn)的神經(jīng)前體(祖)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)前體(祖)細(xì)胞的混合物。這可能會影響細(xì)胞的體內(nèi)評估，甚至增加副作用的風(fēng)險，阻礙了其廣泛的臨床應(yīng)用。因此建立生成高純化和穩(wěn)定的中腦多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞和/或前體細(xì)胞供體細(xì)胞對pd細(xì)胞替代療法的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

2、通過對多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化及多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育過程的解析，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)報道了一些在多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞中選擇性表達(dá)的基因，例如lrp4/corin(wo2004/065599，wo?2006/009241)、nato3(wo?2007/021003)、msx1/2(wo?2007/021004)?？紤]到增殖前體細(xì)胞存在腫瘤發(fā)生的風(fēng)險，另外多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞具有多種命運(yùn)分化潛能，分化的終末細(xì)胞除了多巴胺能神經(jīng)元還包括其它類型神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞等多種細(xì)胞類型(jerber?et?al.(2021)nat?genet.53，304～312)。而有絲分裂期后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞能夠更好得定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，因此細(xì)胞治療中使用有絲分裂期后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞優(yōu)于使用增殖前體細(xì)胞。一些多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)記物，例如lmx1a(wo?2005/052190)以及包括clstn2和ptpro的多種標(biāo)志物(wo2022/222974)也被報道。然而這些基因在特異性上有所欠缺，在多巴胺能神經(jīng)元增殖前體細(xì)胞和有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞均有表達(dá)，利用這些標(biāo)記分子不能有效富集有絲分裂后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。因此，尋找、鑒定特異性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞表面標(biāo)志物，優(yōu)化分離純化多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的技術(shù)，提供pd細(xì)胞療法的產(chǎn)品具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的表面標(biāo)志物及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一方面提供了多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物，所述表面標(biāo)志物包括f3或sstr2中的至少一種。

3、本發(fā)明中，f3(凝血因子iii)又被稱為組織因子、cd142，屬于組織因子家族的單通道i型膜蛋白。人f3由295個氨基酸組成，其大小約為47kda，包含了一個跨膜區(qū)域(252～274號殘基)。

4、本發(fā)明中，sstr2是生長抑素受體(somatostatin?receptor，sstr)家族的成員，屬于g蛋白偶聯(lián)受體，其天然配體是生長抑素(sst)。人sstr2由369個氨基酸組成，包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域。

5、本發(fā)明所述的表面標(biāo)志物為采用兩種常規(guī)人多能干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元定向分化的方法誘導(dǎo)分化后，通過對分化過程多個時間點(diǎn)的分化產(chǎn)物單細(xì)胞測序分析獲得，具有顯著的細(xì)胞特異性。第一種分化方法為lorenz?studer團(tuán)隊(duì)在2011年開發(fā)的利用底板誘導(dǎo)從多能干細(xì)胞體外定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法，(kriks?et?al.(2011)nature480，547～551)，目前其他誘導(dǎo)分化方法是在此方法基礎(chǔ)上的調(diào)整。第二種分化方法為lorenz?studer團(tuán)隊(duì)在2021年報道的對第一種方法的優(yōu)化，分化過程中采用“chir-boost”對wnt信號通路進(jìn)行雙相激活(kim?et?al.(2021)cell?stem?cell?28，343～355)。本技術(shù)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)f3基因在第一種分化方法獲得的有絲分裂期后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)，該多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞群還特異性表達(dá)ascl1、th、和tph1這些基因，可以定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。sstr2基因在第二種分化方法獲得的有絲分裂期后的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞中特異性表達(dá)，該多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞群還特異性表達(dá)成神經(jīng)細(xì)胞(neuroblasts)的特征基因neurod1/4、nhlh1/2、和neurog1/2(la?manno?et?al.(2016)cell167，566～580；jerber?et?al.(2021)nat?genet.53，304～312)，也能夠定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，因此本發(fā)明將f3和/或sstr2陽性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞命名為定向多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。f3和sstr2表面標(biāo)志物可以用于分離、純化或者檢測、鑒定具有定向分化能力的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。

6、本發(fā)明所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞表面標(biāo)志物f3，其為一種多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性表面受體，用于純化多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，通過使用該特異性表面受體分選多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞，能夠有效富集巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞；并且，利用該多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞能夠高效的分化為多巴胺能神經(jīng)元，分化效率可達(dá)30％以上，作為優(yōu)選的分化率可達(dá)40％以上，更優(yōu)選的50％以上，更優(yōu)選的60％以上，更優(yōu)選的70％以上，更優(yōu)選的80％以上；本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，分化效率高達(dá)69％。

7、本發(fā)明所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)志物sstr2，其為一種多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性表面受體，用于純化多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，通過使用該特異性表面受體分選多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞，能夠有效富集巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞；并且，利用該多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞能夠高效的分化為多巴胺能神經(jīng)元，分化效率可達(dá)30％以上，作為優(yōu)選的分化率可達(dá)40％以上，更優(yōu)選的50％以上，更優(yōu)選的60％以上，更優(yōu)選的70％以上，更優(yōu)選的80％以上；本發(fā)明的一些具體實(shí)施例中，分化效率高達(dá)66％。

8、并且，在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)志物f3和sstr2與其他多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物相比，可對多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞進(jìn)行更為精準(zhǔn)的標(biāo)記，篩選獲得的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)分化為多巴胺能神經(jīng)元的分化效率高；且與其他標(biāo)志物相比，所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)志物f3和sstr2具有較高的細(xì)胞選擇性。

9、本發(fā)明的第二方面提供了所述的表面標(biāo)志物在鑒別、分離和/或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的應(yīng)用。所述多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞能夠經(jīng)體內(nèi)和體外分化為多巴胺能神經(jīng)元。

10、進(jìn)一步的，所述鑒別包括：

11、判斷候選細(xì)胞表面是否具備下述標(biāo)志物：f3和/或sstr2,

12、將具備所述標(biāo)志物的候選細(xì)胞鑒別為多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。

13、優(yōu)選的，所述候選細(xì)胞為神經(jīng)元前體細(xì)胞。

14、優(yōu)選的，所述神經(jīng)元前體細(xì)胞通過分離胎兒或人體腦組織、誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化，和人組織細(xì)胞轉(zhuǎn)分化獲得；

15、優(yōu)選的，所述人多能干細(xì)胞包括人胚胎干細(xì)胞和/或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

16、進(jìn)一步的，所述誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化包括以下步驟：

17、將人多能干細(xì)胞與第一誘導(dǎo)試劑接觸進(jìn)行第一誘導(dǎo)分化，分化為中腦底板前體細(xì)胞；

18、將獲得的中腦底板前體細(xì)胞與第二誘導(dǎo)試劑接觸進(jìn)行第二誘導(dǎo)分化，分化為多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。

19、本發(fā)明中，所述第一誘導(dǎo)試劑包括bmp信號通路抑制劑、tgf-β信號通路抑制劑、shh信號通路激動劑、嘌嗎啡胺、gsk-3信號通路抑制劑、成纖維細(xì)胞生長因子；

20、優(yōu)選的，所述第一誘導(dǎo)試劑包括100～250nm的bmp信號通路抑制劑、1～10μm的tgf-β信號通路抑制劑、100～500ng/ml的shh信號通路激動劑、0.7～7.5μm的gsk-3信號通路抑制劑、100ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子和/或1～2μm的嘌嗎啡胺；

21、更優(yōu)選的，所述第一誘導(dǎo)試劑包括：100～250nm的bmp信號通路抑制劑ldn193189、1～10μm的tgf-β信號通路抑制劑sb431542、100～500ng/ml的shh信號通路激動劑shhc25ii、0.7～7.5μm的gsk-3信號通路抑制劑chir99021、100ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子fgf8a和/或1～2μm的嘌嗎啡胺；

22、所述第二誘導(dǎo)試劑包括bdnf、gdnf、二丁酰環(huán)腺苷酸、tgf-β3、dapt、維生素c和/或gsk-3信號通路抑制劑；

23、優(yōu)選的，所述第二誘導(dǎo)試劑包括20ng/ml?bdnf、20ng/ml?gdnf、200μm～500μm二丁酰環(huán)腺苷酸、1ng/ml?tgf-β3、10μm?dapt、200μm維生素c和/或3μm?gsk-3信號通路抑制劑；

24、更優(yōu)選的，所述第二誘導(dǎo)試劑包括20ng/ml?bdnf、20ng/ml?gdnf、200μm～500μm二丁酰環(huán)腺苷酸、1ng/ml?tgf-β3、10μm?dapt、200μm維生素c和/或3μm?gsk-3信號通路抑制劑chir99021。

25、本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述判斷包括使用靶向f3和/或sstr2的試劑與所述候選細(xì)胞接觸后，檢測所述候選細(xì)胞的f3和/或sstr2的表達(dá)和/或活性水平。

26、進(jìn)一步的，所述靶向f3和/或sstr2的試劑包括靶向編碼f3和/或sstr2的核酸分子的試劑，和/或靶向f3和/或sstr22蛋白的試劑。

27、更進(jìn)一步的，

28、所述靶向編碼f3和/或sstr2的核酸分子的試劑包括能夠特異性擴(kuò)增編碼f3和/或sstr2的核酸分子的引物和/或能夠特異性識別編碼f3和/或sstr2的核酸分子的探針；

29、所述靶向f3和/或sstr22蛋白的試劑包括能夠特異性結(jié)合f3和/或sstr2蛋白的試劑和/或能夠測定f3和/或sstr2蛋白活性的試劑。

30、更進(jìn)一步的，

31、所述特異性結(jié)合f3和/或sstr2蛋白的試劑包括f3和/或sstr2的抗體，或f3和/或sstr2的抗抗體；

32、優(yōu)選的，所述f3的抗體用量為0.15～0.2μg每100萬侯選細(xì)胞；

33、優(yōu)選的，所述sstr2的抗體用量為10μl每100萬侯選細(xì)胞；

34、優(yōu)選的，所述試劑上帶有標(biāo)記熒光素。

35、本發(fā)明的第三方面提供了鑒別、分離或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的試劑，其以本發(fā)明所述的表面標(biāo)志物為靶標(biāo)。

36、進(jìn)一步的，所述試劑包括：靶向編碼f3和/或sstr2的核酸分子的試劑，和/或靶向f3和/或sstr22蛋白的試劑。

37、更進(jìn)一步的，

38、所述靶向編碼f3和/或sstr2的核酸分子的試劑包括能夠特異性擴(kuò)增編碼f3和/或sstr2的核酸分子的引物和/或能夠特異性識別編碼f3和/或sstr2的核酸分子的探針；

39、所述靶向f3和/或sstr22蛋白的試劑包括能夠特異性結(jié)合f3和/或sstr2蛋白的試劑和/或能夠測定f3和/或sstr2蛋白活性的試劑。

40、更進(jìn)一步的，所述特異性結(jié)合f3和/或sstr2蛋白的試劑包括f3和/或sstr2的抗體，或f3和/或sstr2的抗抗體；

41、優(yōu)選的，所述f3的抗體用量為0.15～0.2μg每100萬侯選細(xì)胞；

42、優(yōu)選的，所述sstr2的抗體用量為10μl每100萬侯選細(xì)胞；

43、優(yōu)選的，所述試劑上帶有標(biāo)記熒光素。

44、本發(fā)明的第四方面提供了鑒別、分離或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的試劑盒，其包括輔料和本發(fā)明所述的試劑。

45、進(jìn)一步的，所述輔料包括培養(yǎng)基、抑制劑、激活劑、生長因子、緩沖液和/或培養(yǎng)器械中的任意一種或多種。

46、本發(fā)明的第五方面提供了分離和/或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法，其利用本發(fā)明所述的試劑和/或本發(fā)明所述的試劑盒對多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞進(jìn)行分離和/或富集。

47、進(jìn)一步的，所述分離和富集的方法包括：熒光標(biāo)記細(xì)胞分選法、免疫磁珠分離法或免疫吸附柱分離法中的任意一種。

48、在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述分離和/或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法，具體包括一下步驟：

49、步驟1、提供神經(jīng)元前體細(xì)胞群；

50、步驟2、從所述神經(jīng)元前體細(xì)胞群中分離和/或富集具備下述標(biāo)志物的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞：f3或sstr2。

51、進(jìn)一步的，步驟2中分離和/或富集多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法包括熒光標(biāo)記細(xì)胞分選法、免疫磁珠分離法或免疫吸附柱分離法；優(yōu)選地，這些方法采用特異性結(jié)合f3和/或sstr2的抗體，或連接熒光標(biāo)記、磁性物質(zhì)或者吸附柱的f3和/或sstr2的抗體或特異性結(jié)合f3和/或sstr2抗體的抗體，更優(yōu)選的，采用特異性結(jié)合f3和/或sstr2的抗體。

52、本發(fā)明提供了多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞，其由本發(fā)明所述的方法獲得。

53、本發(fā)明提供了所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)分化獲得的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。

54、本發(fā)明提供了如下i)～ii)所示中的至少一種在神經(jīng)退行性疾病致病機(jī)制通路研究及制備預(yù)防、治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用：

55、i)、本發(fā)明所述的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞；

56、ii)、本發(fā)明所述的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。

57、進(jìn)一步的，所述神經(jīng)退行性疾病包括腦缺血、腦損傷、帕金森癥、腦萎縮、老年癡呆癥、或肌肉萎縮側(cè)索硬化中的至少一種。

58、本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或緩解神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥的方法，所述方法包括以下步驟：

59、判斷候選細(xì)胞表面是否具備下述標(biāo)志物：f3或sstr2；

60、挑選具備所述標(biāo)志物的細(xì)胞；和

61、向有需要的受試者施用有效劑量的具備所述標(biāo)志物的細(xì)胞。

62、本發(fā)明的有益效果：

63、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)f3和sstr2是多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞特異性的表面標(biāo)志物，f3陽性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞具備分化為多巴胺能神經(jīng)元和羥色胺能神經(jīng)元的雙向分化能力，sstr2陽性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞則可定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。從而相比于其它多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物，采用f3和/或sstr2作為表面標(biāo)志物能夠提供高純度、更均一的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞和該前體細(xì)胞分化的多巴胺能神經(jīng)元。

64、采用f3和/或sstr2作為表面標(biāo)志物結(jié)合流式細(xì)胞分選或磁珠分選等方法可快速分離純化出多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞。

65、本發(fā)明所提供的f3和/或sstr2陽性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞及其分化產(chǎn)生的多巴胺能神經(jīng)元具有廣泛的用途?？勺鳛樯窠?jīng)退行性疾病細(xì)胞治療的種子細(xì)胞、疾病機(jī)制研究、藥物篩選、多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育研究提供了理想的細(xì)胞模型。

66、本發(fā)明所提供的f3和/或sstr2陽性的多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞為有絲分裂期后的細(xì)胞，減少了腫瘤發(fā)生的風(fēng)險更加符合細(xì)胞治療供體細(xì)胞的作用和要求。