本發(fā)明涉及唾液外泌體中生長激素在制備用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒或系統(tǒng)中的用途。

背景技術(shù)：

內(nèi)分泌代謝疾病、腫瘤、心血管疾病是三大最常見的慢性病。內(nèi)分泌代謝疾病是內(nèi)分泌異常性疾病的總稱，包括激素來源異常、激素受體異常和由于激素或物質(zhì)代謝失常引起的生理紊亂所發(fā)生的癥候群。常見的疾病包括糖尿病、甲狀腺疾病、胰島素瘤以及泌乳素瘤、垂體功能減退癥等。這些疾病的診斷通常要通過多次檢測激素水平，其中不乏各種肽類激素(peptidehormones)，主要包括：1、人體生長激素(gh)2、胰島素3、紅細(xì)胞生成素(epo)4、促性腺素，這些激素都需要多次檢測確定內(nèi)分泌狀態(tài)。如垂體功能減退癥，檢測垂體功能時，需要檢測gh，prl,acth,tsh,lh,fsh等激素水平，而且都是多次進(jìn)行的，就檢測gh水平而言，就有4個試驗(yàn)需要穿刺抽血檢測，第一個試驗(yàn)需要在-30,0，30,60,120分鐘抽血測血糖和gh，第二個試驗(yàn)需要在0,15,30,45,60,120分鐘抽血檢測gh，第三個試驗(yàn)需要在0,30,60,120分鐘抽血測gh，最后一個試驗(yàn)需要在0,30,60,120分鐘抽血測gh。如此多的試驗(yàn)都是不能交叉進(jìn)行的，必須分開分批進(jìn)行，所需時間長，穿刺抽血次數(shù)多，抽血量大，病人負(fù)擔(dān)重。這些檢查均為有創(chuàng)檢查，導(dǎo)致病人的依從性低，難以進(jìn)行規(guī)律的預(yù)后的監(jiān)測，病情不能得到穩(wěn)定控制。

目前，蛋白結(jié)合測定是最通用的一種激素測定方法，也是命名最混亂的一種測定方法。通常用的免疫測定法，放射免疫測定法，受體結(jié)合測定法和血漿蛋白結(jié)合測定法，都屬于這一類測定方法。

這些檢測方法都采用病人血清標(biāo)本，并且需要多次反復(fù)檢測，才能確定患者激素水平，判斷內(nèi)分泌功能狀態(tài)?；颊邔Χ啻纬檠a(chǎn)生的抵觸心理與激素水平檢測所需要的多次檢測要求就產(chǎn)生了矛盾，而液體活檢技術(shù)可以解決這一問題。液體活檢中，其中一個技術(shù)是外泌體的檢測。外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多泡體與細(xì)胞膜融合后,釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的一種直徑約30～120nm的膜性囊泡。t細(xì)胞、b細(xì)胞、血小板、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞等血細(xì)胞及上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等其他非血源性細(xì)胞都會分泌外泌體，被分泌出的外泌體會進(jìn)入血液、唾液、尿液、及乳汁等體液中。外泌體的最重要的生物學(xué)功能是它們可能用作臨床診斷中的生物標(biāo)志物。和常規(guī)標(biāo)本如血清或尿中鑒定的肽類激素相比，外泌體因?yàn)橛兴鼈儍?yōu)異的穩(wěn)定性，故可以提供最高的靈敏度和特異性。

目前內(nèi)分泌疾病需多次檢查激素水平，如垂體功能減退癥，檢測垂體功能時，需要檢gh，prl,acth,tsh,lh,fsh等激素水平，而且都是多次進(jìn)行的，就檢測gh水平而言，就有4個試驗(yàn)需要穿刺抽血檢測，第一個試驗(yàn)需要在-30,0，30,60,120分鐘抽血測血糖和gh，第二個試驗(yàn)需要在0,15,30,45,60,120分鐘抽血檢測gh，第三個試驗(yàn)需要在0,30,60,120分鐘抽血測gh，最后一個試驗(yàn)需要在0,30,60,120分鐘抽血測gh。如此多的試驗(yàn)都是不能交叉進(jìn)行的，必須分開分批進(jìn)行，所需時間長，穿刺抽血次數(shù)多，抽血量大，病人負(fù)擔(dān)重。這些檢查均為有創(chuàng)檢查，導(dǎo)致病人的依從性低，難以進(jìn)行規(guī)律的預(yù)后的監(jiān)測，病情不能得到穩(wěn)定控制。

內(nèi)分泌疾病屬于慢性疾病，需要多次檢查激素水平，需要規(guī)律的監(jiān)測來及時調(diào)整藥物劑量及療程，現(xiàn)有的抽血檢查需要通過穿刺手段，且需血量大，不方便反復(fù)多次進(jìn)行。這種有創(chuàng)檢查病人接受程度低，依從性差，無法動態(tài)觀測病人治療效果，難以穩(wěn)定控制疾病的發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明開發(fā)了一種用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒，本發(fā)明還提供了一種用于內(nèi)分泌疾病診斷的液體診斷系統(tǒng)，利用病人體液提取外泌體，并檢測其中的生長激素的表達(dá)量，具有穩(wěn)定性好，重復(fù)率高，獲取簡單，解決了內(nèi)分泌疾病缺乏一種可連續(xù)取樣，病人易耐受的生長激素的液體診斷方法的難題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒，包括檢測唾液外泌體中生長激素的試劑，以及提取唾液外泌體的試劑。

優(yōu)選地，所述提取唾液外泌體的試劑包括外泌體沉淀溶液和外泌體懸浮液。

優(yōu)選地，所述外泌體沉淀溶液包括聚乙二醇6000，所述外泌體懸浮液包括磷酸鹽緩沖溶液。

本發(fā)明提供了一種用于內(nèi)分泌疾病診斷的系統(tǒng)，包括上述所述的內(nèi)分泌疾病診斷試劑盒，以及檢測唾液外泌體中生長激素的儀器。

本發(fā)明提供了唾液外泌體中生長激素在制備用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒或系統(tǒng)中的用途。

本發(fā)明提供了檢測唾液外泌體中生長激素的試劑在制備用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒或系統(tǒng)中的用途。

實(shí)施本發(fā)明的用于內(nèi)分泌疾病診斷的試劑盒和系統(tǒng)，通過從體液中提取外泌體，檢測其中生長激素，可以簡單、方便且準(zhǔn)確地診斷內(nèi)分泌疾病。

有益效果：

1、目前液體活檢正在不斷發(fā)展中，由此開發(fā)的檢測唾液外泌體中生長激素的試劑盒，是一種具有非侵襲性、高敏感性高特異性、適用于普查篩查大樣本調(diào)查的液體診斷監(jiān)控試劑盒。

2、通過檢測唾液外泌體生長激素的表達(dá)，提供一種能夠利用體液等生物樣本進(jìn)行生長激素的檢測，穩(wěn)定性高、定量精確的試劑盒和系統(tǒng)，并由于其微創(chuàng)，易于檢測，便于反復(fù)多次取樣，有助于實(shí)時反映動態(tài)檢測內(nèi)分泌疾病患者的疾病狀態(tài)，有助于臨床醫(yī)生迅速掌握患者病情，從而及時制定更具有個體化的治療措施。

3、采用本發(fā)明所述試劑盒和系統(tǒng)可以避免多次穿刺抽血，減輕病人負(fù)擔(dān)，指導(dǎo)臨床用藥，利于動態(tài)觀察病人治療情況。

附圖說明

圖1為矮小癥兒童唾液中提取的外泌體電鏡圖，

圖2為矮小癥兒童唾液中提取的外泌體蛋白質(zhì)免疫印跡圖；

圖3為矮小癥兒童唾液中提取的外泌體納米粒子跟蹤分析圖；

圖4為矮小癥兒童唾液外泌體中生長素測定情況；

圖5為隨機(jī)選擇的12位矮小癥兒童唾液外泌體中與血清中生長素檢測相關(guān)性的情況。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

一、唾液的收集、保存以及運(yùn)輸

1.收集：于早晨8-10點(diǎn)，采用非刺激性滴取法于安靜舒適的環(huán)境下，對滿足下列條件受試者進(jìn)行全唾液收集：1.空腹，未進(jìn)行劇烈運(yùn)動；2.至少刷牙一小時以上；3..近期未進(jìn)行口腔護(hù)理。囑咐受試者用清水漱口2-3次，每次約30-40ml左右清水，以清除口腔內(nèi)食物等殘?jiān)?，吐盡殘留液體，頭部微下垂，靜坐5分鐘后待唾液自然流出。收集其非刺激性全唾液于無菌平板培養(yǎng)皿中，以唾液鋪滿培養(yǎng)皿為宜，約500-700ul，而后迅速分裝至無菌1.5mlep管，立即置-80℃保存待用。

2.保存：一般–80℃冰箱可以長期保存唾液，但由于唾液中含有細(xì)菌、少量殘?jiān)案鞣N酶，建議3000g/分鐘離心15min后，去除沉渣，分離上清于新的ep管中，后置于–80℃冰箱，以減少后續(xù)細(xì)菌及各種酶對實(shí)驗(yàn)的影響。若沒有-80℃冰箱，可用封口膜封口，暫存于-20℃，后盡快轉(zhuǎn)移至有條件實(shí)驗(yàn)室或盡快進(jìn)行后續(xù)處理。

3.運(yùn)輸：如需短途運(yùn)輸，可置于冰盒內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸，如需長途運(yùn)輸，可用干冰運(yùn)輸后再進(jìn)行處理。短途運(yùn)輸，盡量保證處理與收集的間隔時間不超過1h；長途運(yùn)輸，建議保證干冰的分量足夠以維持低溫。運(yùn)輸過程保證低溫，以免后續(xù)實(shí)驗(yàn)受唾液中各種微生物或酶的影響。

二、唾液外泌體提取、保存及運(yùn)輸

1.唾液外泌體的提?。?/p>

取等體積上述所得唾液如500ul(所需唾液量至少可為250ul).(未進(jìn)行離心處理的唾液)，2500-5000g/分鐘離心15min。用移液器將離心所得上清移至新的1.5ml的ep管中，約450-470ul澄清上清，加入等量的外泌體沉淀溶液混勻,4℃靜置孵育過夜，10000g4℃離心1h后棄上清，收集沉淀，將外泌體白色沉淀物用適量1x外泌體懸浮液重懸得到外泌體重懸液。

圖1：圖中示出了矮小癥兒童唾液中提取的外泌體電鏡圖，鏡下觀察到明顯的帶膜囊泡結(jié)構(gòu)以及顆粒大小在100nm左右，符合外泌體特征，說明在唾液中成功提取到外泌體。

圖2：圖中示出了矮小癥兒童唾液中提取的外泌體蛋白質(zhì)免疫印跡圖，為外泌體特異性標(biāo)志物條帶，說明在唾液中確實(shí)成功提取物到外泌體。

圖3：圖中示出了矮小癥兒童唾液中提取的外泌體納米粒子跟蹤分析圖，圖中顯示唾液提取物中顆粒大小主要集中在79nm和100nm，符合外泌體特征，說明在唾液提取物中為絕大多數(shù)的外泌體。

2.唾液外泌體的保存及運(yùn)輸：

一般外泌體置于–80℃冰箱可以長期保存1-3年，其中含有的rna、dna、蛋白等都能較為穩(wěn)定的保存。外泌體一般建議采用干冰及干冰替代物進(jìn)行長途運(yùn)輸。

三、唾液外泌體中生長激素測定

取上述最后得到的外泌體重懸液，使用美國貝克曼－庫爾特醫(yī)學(xué)診斷公司生產(chǎn)的化學(xué)發(fā)光法檢測儀器與配套試劑(r1a、r1b、r1c)檢測生長激素。

上述所述試劑成分如下表示

圖4：圖中示出了矮小癥兒童唾液外泌體中生長素測定情況。受試者在跑臺上,速度為1.5m/s,以提高坡度的方式增加負(fù)荷量,每1～6min增加2％,以后每min增加1％,持續(xù)15～20min,受試者心率在170次/min以上。在受試前(0h)及受試后指定時間點(diǎn)，受試者的生長激素水平呈現(xiàn)上升后又下降到原基礎(chǔ)水平的變化。說明唾液外泌體中生長激素能夠反映矮小癥兒童接受運(yùn)動刺激后的生長激素水平變化。

圖5：圖中示出了隨機(jī)選擇的12位矮小癥兒童唾液外泌體中與血清中生長素檢測相關(guān)性的情況，相關(guān)系數(shù)為0.88(p<0.0001)，說明矮小癥兒童唾液外泌體與血清的生長激素水平有顯著相關(guān)性。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。