本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法。

背景技術(shù)：

溶劑效應(yīng)可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)是由于溶劑的物理性質(zhì)所引起，是所有溶劑對熒光物質(zhì)共同作用的結(jié)果，與溶劑折射率和介電常數(shù)等物理量有關(guān)，隨著以上性質(zhì)的改變，弛豫效應(yīng)的影響，熒光發(fā)射峰出現(xiàn)紅移或藍(lán)移現(xiàn)象；而特殊的溶劑效應(yīng)是物質(zhì)與溶劑分子之間的化學(xué)作用所產(chǎn)生的，一般而言取決于溶劑和熒光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。例如，黃保軍課題組在羅丹明b熒光光譜機理的研究中報道，羅丹明b的熒光強度受特殊溶劑效應(yīng)的影響。

碘是機體所必需的微量元素之一,它是合成甲狀腺激素必不可少的基本成份，對人體的正常生長發(fā)育和新陳代謝有至關(guān)重要的作用。機體碘攝入不足，導(dǎo)致甲狀腺激素合成不足是碘營養(yǎng)缺乏病的主要發(fā)病機理。研究還發(fā)現(xiàn)，若胚胎期或生后早期發(fā)生碘缺乏，將影響大腦的發(fā)育,導(dǎo)致智力下降。長期碘攝入量過高或一次性攝入相當(dāng)高劑量的碘也會對機體帶來損傷，造成碘過多病，甚至導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生。因此，碘的攝入量過高或過低，都對人體健康造成很大的影響。碘在機體每天都在進(jìn)行代謝，人體吸收的碘一部分輸送到甲狀腺，一部分輸送到腎臟。腎臟是碘的主要排泄器官，機體每天攝入的碘約85%到90%隨尿液排出。機體碘狀況可用尿碘來衡量。尿碘主要是源于血漿中的無機碘，尿碘的主要成分是碘離子。在人體碘平衡的情況下，尿碘排泄量可反映碘攝入量與人體碘平衡情況。因此，尿碘是評估人群碘營養(yǎng)水平的主要指標(biāo)。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，對于個體而言，尿碘排泄量每天甚至每時都在變化；然而，對于群體而言，這些變化會相互抵消而趨于平穩(wěn)，只要樣本量足夠，晨尿或任何一次隨機尿樣的碘含量足以用于評估人群的碘營養(yǎng)狀況。

目前，傳統(tǒng)的檢測方法主要有：原子吸收光譜法、離子選擇性電極法、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法、氣相色譜法、離子色譜法和毛細(xì)管電泳法等等，但是這些方法大都操作較為復(fù)雜、成本高、費時或者需要復(fù)雜樣品的預(yù)處理過程等。例如，氣相色譜法雖然操作簡單，適用于大批樣品測定，但儀器龐大、昂貴，測定耗時，且環(huán)境要求高。近年來，檢測離子的熒光探針相繼報道，熒光探針檢測法靈敏度較高，檢測限較低等優(yōu)點，具有很好的發(fā)展前景。因此，建立一種簡便、快速、特異和靈敏的碘離子速測方法，實現(xiàn)對尿液中碘離子速測具有十分重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺點，提供了一種醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法。本發(fā)明方法是一種基于醇溶劑來誘導(dǎo)改變銀納米簇對碘離子的特異性識別與響應(yīng)的檢測技術(shù),并應(yīng)用于實現(xiàn)對尿液樣品中碘離子的熒光速測分析；檢測方法具有簡便、快速、靈敏、特異、可視化等優(yōu)點。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法，包括以下步驟：

1）制備銀納米簇（agncs）材料：

a）室溫下，將濃度為20mm的硝酸銀（agno3）水溶液與濃度為50mm谷胱甘肽(gsh)水溶液按體積比5:4～8混合，然后加入16～20倍體積的超純水，攪拌混合均勻，采用1.0mnaoh水溶液調(diào)節(jié)ph為9～10，得溶液a；

b）將α-硫辛酸（la）與硼氫化鈉（nabh4）按摩爾比4:1混合于超純水中，攪拌至α-硫辛酸完全溶解，得溶液b，按體積比1:5～9將溶液b和溶液a混合，攪拌20min后，于室溫下靜置反應(yīng)1.5h，然后，分離純化，制得紅色熒光銀納米簇（agncs）材料，于4℃避光儲存，備用；

2）制備醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇（agncs）探針：

室溫下，將步驟1）制備的銀納米簇材料與醇溶劑混合均勻，攪拌5min，得到醇誘導(dǎo)的熒光增強銀納米簇探針，置于4℃儲存，備用；

3）尿液中碘離子的測定：

將步驟2）制備的醇誘導(dǎo)的熒光增強銀納米簇探針，依次等量地加入到100μl等體積的含有濃度梯度i^-的尿液中，調(diào)節(jié)ph為6～8后，反應(yīng)5min，在波長365nm的紫外投射儀下觀察溶液的顏色變化，并采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測定其熒光光譜與強度，繪制校準(zhǔn)曲線；按上述方法，測定探針加入待測尿樣前后的熒光強度變化，計算得待測樣品中碘離子的含量。

步驟1）中，硝酸銀、谷胱甘肽、naoh的摩爾比最優(yōu)選3：1：8。

步驟1）中，制得的銀納米簇材料，為淡黃色透亮液體，其中的銀納米簇粒徑為3.0～5.0nm。

步驟2）中，所述的醇溶劑為澄清、無色，并可與水互溶的醇液體，優(yōu)選具有支鏈結(jié)構(gòu)和空間位阻的異丙醇。

步驟2）中，所述的銀納米簇材料與醇溶劑混合體積比優(yōu)選1:1。

步驟3）中，所述的待測樣品為尿液，所述的尿液為成人或兒童的任一次尿樣，尤其適用于晨尿中碘離子的測定。

步驟3）中，所述的醇誘導(dǎo)的熒光增強銀納米簇探針，優(yōu)選加入到尿液中的濃度為1.05mm。

步驟3）中，所述的濃度梯度i^-，濃度范圍為0.10～10.0μm，配制方法：準(zhǔn)確稱取0.0166g碘化鉀標(biāo)準(zhǔn)品固體試劑，加入10ml超純水，然后混勻，得碘化鉀貯備液，然后將上述碘化鉀貯備液依次稀釋不同濃度得i^-的標(biāo)準(zhǔn)水溶液，避光待用。

步驟3）中，調(diào)節(jié)ph時，采用hcl水溶液或naoh水溶液，濃度1.0m。

上述基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法，其檢測i^-的相關(guān)性系數(shù)為0.9928。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)勢和有益效果在于：

（1）本發(fā)明方法制備的醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針，利用醇類溶劑，誘導(dǎo)改變了納米簇對陰離子的選擇性識別功能，借以實現(xiàn)了對碘離子的特異性響應(yīng)；

（2）本發(fā)明檢測方法，利用的醇溶劑，可顯著增強銀納米簇的熒光強度，借以放大了目標(biāo)離子的響應(yīng)信號，提高了其檢測靈敏度，獲得的檢測結(jié)果與經(jīng)典精密儀器法（離子色譜法）的定量結(jié)果基本一致，具有操作簡便、特異、響應(yīng)快、靈敏度高、可視化等優(yōu)點，適于尿液樣品中碘含量的快速、特異、高靈敏、可視化速測，具有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針檢測尿液中碘離子的檢測曲線；

圖2為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇?zé)晒鈾z測與ic方法檢測碘離子的差異性曲線；

圖3為不同溶劑對銀納米簇?zé)晒鈴姸鹊挠绊懀?/p>

圖4為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針對碘離子的特異性響應(yīng)；

圖5為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針對不同干擾離子的熒光強度響應(yīng)變化；

圖6為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針的最佳用量的優(yōu)化；

圖7為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針與碘離子作用的最佳ph區(qū)間優(yōu)化；

圖8為異丙醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針與碘離子作用響應(yīng)時間考察。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段做出的各種替換或變更，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實施例1

制備醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇（agncs）探針，步驟為：

1）制備銀納米簇（agncs）材料：

a）室溫下，將125μl濃度為20mm的硝酸銀（agno3）水溶液與150μl濃度為50mm谷胱甘肽(gsh)混合，然后加入5.0ml超純水，攪拌混合均勻，采用1.0mnaoh水溶液調(diào)節(jié)ph為9～10，得溶液a；

b）將4.2mgα-硫辛酸（la）與1.9mg硼氫化鈉（nabh4）與1ml超純水中混合，攪拌至la完全溶解，得溶液b，取700μl溶液b逐滴加入到溶液a中，攪拌20min后，于室溫下靜置反應(yīng)1.5h，然后經(jīng)離心分離純化，制得銀納米簇（agncs）材料，于4℃避光儲存，備用；

2）醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇（agncs）探針的制備：

室溫下，將步驟1）制備的銀納米簇材料與異丙醇按體積比1:1混合均勻，攪拌5min，得到醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針，置于4℃儲存，備用；制得的銀納米簇材料，為淡黃色透亮液體，其中的銀納米簇粒徑為3.0～5.0nm。

實施例2

基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法，采用實施例1制備的醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針測定尿液（孩童晨尿）中碘離子，步驟包括：

將醇誘導(dǎo)的熒光增強銀納米簇探針，依次等量加入到等體積（100μl）的含有濃度梯度（0.050、0.10、0.25、0.50、0.75、1.0、2.5、5.0、7.5和10μm）的i^-的尿液中，探針加入濃度均為1.05mm，采用濃度1.0m的hcl水溶液或naoh水溶液，調(diào)節(jié)ph為6～8后，反應(yīng)5min，在波長365nm的紫外投射儀下觀察溶液的顏色變化，并采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測定其熒光光譜與強度，繪制校準(zhǔn)曲線；按上述方法，測定探針加入待測尿樣前后的熒光強度變化，計算得待測樣品中碘離子的含量，結(jié)果如表1。

實施例3

基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法，采用實施例1制備的醇誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇探針測定待測尿液（孕婦晨尿）中碘離子，步驟同實施例2，結(jié)果如表1。

實施例4

基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法，采用實施例1制備的醇誘導(dǎo)的紅色熒光銀納米簇探針測定待測尿液（成人晨尿）中碘離子，步驟同實施例2，結(jié)果如表1。

表1待測樣品中i^-含量的測定結(jié)果

一、本發(fā)明基于醇溶劑誘導(dǎo)銀納米簇?zé)晒庠鰪姷哪蛞褐械怆x子檢測方法可行性驗證：

1、將本發(fā)明實施例1步驟1）制備的具有銀納米簇（agncs）材料用于實施例3檢測，該銀納米簇對陰離子無直接選擇性響應(yīng)，對i^-也無直接選擇性響應(yīng)。

有實施例3可見該銀納米簇（agncs）材料在醇類溶劑的誘導(dǎo)后，對碘離子的識別能力發(fā)生改變，將此醇誘導(dǎo)后的銀納米簇作為探針，實現(xiàn)了對碘離子的選擇性識別與響應(yīng)，詳見圖4。

2、本發(fā)明基于醇誘導(dǎo)熒光增強的銀納米簇探針檢測方法與經(jīng)典精密儀器法的檢測結(jié)果對照：以檢測尿液中不同濃度的i^-離子為例。

本發(fā)明方法采用實施例1制備的醇誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇探針，通過實施例2檢測步驟進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)不同濃度i^-可不同程度地猝滅探針的熒光，即隨著i^-濃度的增大，使得探針的熒光猝滅程度增大，計算得到的熒光猝滅效率對i^-濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線（即校準(zhǔn)曲線），結(jié)果如圖1所示，測得其檢測i^-的濃度范圍為0.10～10.0μm，相關(guān)性系數(shù)為0.9825。

將熒光的檢測結(jié)果與經(jīng)典的離子色譜檢測方檢測方法得到的結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法并沒有明顯的差異性。

結(jié)果比較表明，本發(fā)明速測方法與采用經(jīng)典離子色譜法測定的結(jié)果相一致。

二、本發(fā)明技術(shù)方案優(yōu)化試驗：

1、誘導(dǎo)溶劑選擇性

將甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、乙二醇、水、二甲基亞砜、丙酮、四氫呋喃、n,n-二甲基甲酰胺10種溶劑與具有銀納米簇（agncs）按體積比1:1混合均勻得到溶劑誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇探針，然后采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測定熒光光譜與強度如圖3所示，從上到下a→j依次為異丙醇、正丙醇、乙二醇、乙醇、甲醇、水、丙酮、n，n-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、四氫呋喃）。從圖3中可以看出，醇溶劑可以增強銀納米簇的熒光強度，其中異丙醇效果最好。同時，將異丙醇誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇作為探針檢測碘離子，發(fā)現(xiàn)該探針對碘離子作用效果最好，熒光猝滅效率最高。因此，本發(fā)明中優(yōu)選采用異丙醇作為誘導(dǎo)劑，實現(xiàn)了對陰離子中碘離子的特異性識別。

2、干擾離子選擇性

本發(fā)明考察了醇誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇探針對其它干擾離子的響應(yīng)，干擾離子包括cl^-、hpo4^2-、h2po4^-、so4^2-、ac^-、c2o4^2-、i^-、co3^2-、hco3^2-、br^-、io3^-、no3^-和s^2-，結(jié)果表明（如圖5所示），該探針對i^-響應(yīng)最好，對其它離子的響應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對i^-。因此，該探針對i^-具有較高的特異性的響應(yīng)，其它常見離子干擾較小。

3、探針濃度的優(yōu)化

將醇誘導(dǎo)熒光增強銀納米簇探針稀釋至不同的濃度，與等量的相同濃度的碘離子作用一定時間后，采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測得熒光光譜與強度。同時，對照組不與碘離子作用，采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測得熒光光譜與強度，計算出相應(yīng)的熒光猝滅效率并繪圖（如圖6所示），探針濃度為1.05mm時，熒光猝滅效率最大，因此，最佳探針濃度為1.05mm。

4、ph的優(yōu)化

采用1.0m的hcl和naoh水溶液，調(diào)節(jié)待測樣品的ph分別至4、6、7、8、10和12，一定時間后，采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測得熒光光譜與強度，計算猝滅效率，結(jié)果表明（如圖7所示）最佳響應(yīng)ph范圍為6～8。

5、響應(yīng)時間的考察

在最優(yōu)的探針用量、最優(yōu)的ph和離子強度的條件下，探針和i^-作用不同時間后，采用熒光光譜儀，在最大激發(fā)波長425nm處測得熒光光譜與強度，結(jié)果表明（如圖8所示），在5min前，兩者反應(yīng)較為迅速，在反應(yīng)5min及5min后熒光強度趨于穩(wěn)定。因此，選擇最佳反應(yīng)時間為5min。