本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，涉及電化學(xué)傳感器，具體涉及一種分子印跡電化學(xué)傳感器，尤其是一種3-硝基酪氨酸的功能化納米材料分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氧化還原系統(tǒng)在失衡條件下產(chǎn)生了大量的自由基，3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine,3-nt)是由自由基中的過(guò)氧化亞硝酸陰離子(onoo^-)與游離的酪氨酸或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的酪氨酸相互作用發(fā)生了硝基化而生成的。3-硝基酪氨酸能使得蛋白質(zhì)結(jié)果及功能發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。例如，胰腺中的3-硝基酪氨酸不僅能導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，還可以導(dǎo)致胰島素空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使得胰島素與受體結(jié)合能力下降。

近年來(lái)，國(guó)外已有研究發(fā)現(xiàn)在許多疾病如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、2型糖尿病等病變的相應(yīng)組織蛋白中都可以檢測(cè)到3-硝基酪氨酸的存在。與3-硝基酪氨酸相關(guān)的疾病多由氧化應(yīng)激所導(dǎo)致，且3-硝基酪氨酸作為在機(jī)體內(nèi)殘留氧化產(chǎn)物之一，所以目前有研究認(rèn)為3-硝基酪氨酸也許可以作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)疾病診斷的生物標(biāo)記物。

目前，分析3-硝基酪氨酸有hplc、液質(zhì)、氣質(zhì)串聯(lián)液質(zhì)等多種方法，但分析的樣品前處理步驟繁瑣且需要昂貴的大型分析儀器，分析成本較高。因此，研制簡(jiǎn)單靈敏、選擇性高、耗樣量少、成本低的新方法用于血液和尿液中3-硝基酪氨酸的分析測(cè)定，對(duì)相關(guān)疾病的早期診斷具有重大意義。

分子印跡技術(shù)是以目標(biāo)分子為模板，以合適的物質(zhì)作為單體，模板和單體通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)分子間力進(jìn)行預(yù)組裝，通過(guò)單體的聚合，模板分子被嵌入聚合物網(wǎng)絡(luò)中，將模板從聚合物中洗脫后，聚合物中留下與模板分子空間相匹配的具有多重作用點(diǎn)的印跡孔穴。分子印跡技術(shù)具有預(yù)定性、特異識(shí)別性和廣泛實(shí)用性等顯著特點(diǎn)，其能夠很好應(yīng)用于色譜分離、固相萃取、仿生傳感器、膜分離等諸多領(lǐng)域。這項(xiàng)技術(shù)目前受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

分子印跡電化學(xué)傳感器具有選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生等特點(diǎn)，在應(yīng)用于藥物分析、生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測(cè)下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明通過(guò)將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法及應(yīng)用，提供的方法首先在玻碳電極表面上通過(guò)滴涂多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶的修飾，提高了傳感器的靈敏度，接著采用電聚合方法以吡咯為功能單體、3-硝基酪氨酸為模板分子，在電聚合過(guò)程中同時(shí)電沉積摻雜納米金來(lái)制備3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器；運(yùn)用本發(fā)明制備的傳感器檢測(cè)血樣、尿液中的3-硝基酪氨酸分子，檢測(cè)度靈敏可靠。

為解決上述問(wèn)題，一方面，本發(fā)明在于提供一種3-硝基酪氨酸的分子印跡電化學(xué)傳感器的制備方法，具體步驟如下：

1)多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶懸濁液滴在玻碳電極表面沉積后電活化得到多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶修飾電極；

2)多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶修飾電極在摻雜納米金-分子印跡聚合物溶液中表面聚合分子印跡聚合物和沉積摻雜納米金，形成一層分子印跡聚合膜；所述分子印跡聚合物以吡咯為功能單體、以3-硝基酪氨酸為模板分子；

3)將步驟2)制備的傳感器中的3-硝基酪氨酸模板分子去除，制得所述3-硝基酪氨酸的分子印跡電化學(xué)傳感器。

進(jìn)一步地，在步驟1)中，所述玻碳電極需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，所述預(yù)處理過(guò)程如下：將玻碳電極拋光沖洗后，再進(jìn)行超聲清洗，然后于鐵氰化鉀中掃描，直到得到可逆的循環(huán)伏安峰為止。

更進(jìn)一步地，所述玻碳電極預(yù)處理過(guò)程中，所述玻碳電極拋光是通過(guò)將玻碳電極依次用0.5μm、0.05μm的al2o3粉在麂皮上拋光。

更進(jìn)一步地，所述玻碳電極預(yù)處理過(guò)程中，所述玻碳電極超聲清洗是指在拋光后用超純水沖洗，再在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的硝酸溶液、乙醇和水中分別超聲清洗5min。

進(jìn)一步地，在步驟1)中，所述多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶懸濁液的制備過(guò)程如下：取多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶于容器中，超聲，得到分散均勻的多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶懸濁液。

更進(jìn)一步地，所述多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶的制備過(guò)程如下：將多壁碳納米管(mwcnt)分散于h2so4/h3po4(摩爾比為9:1)溶液中，室溫?cái)嚢韬笙蛉芤褐芯徛尤雓mno4氧化；加入含有30％h2o2的冰水終止反應(yīng)，得到多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶。

更進(jìn)一步地，所述多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶懸濁液的濃度為0.4mg/ml。

更進(jìn)一步地，所述多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶懸濁液的制備中：超聲時(shí)間為0.5～1h。

進(jìn)一步地，步驟1)中，所述電活化的過(guò)程如下：將沉積的電極浸于磷酸緩沖液中，采用0.6v～-1.8v電壓，以0.1～0.5v/s的掃描速率循環(huán)掃描10～15圈進(jìn)行電活化。

更進(jìn)一步地，所述磷酸緩沖液為ph＝7.0的磷酸緩沖液。

進(jìn)一步地，步驟2)中，形成分子印跡聚合膜的方法為電化學(xué)聚合法，反應(yīng)條件為：在掃描速度為0.05～0.1v/s、電位范圍為-1.0～1.0v循環(huán)掃描8～10圈。

進(jìn)一步地，步驟2)中，所述摻雜納米金-分子印跡聚合物溶液的制備方法：配制0.1mol/lkno3溶液，加入3-硝基酪氨酸、吡咯和氯金酸溶液，超聲形成均一溶液即可。

更進(jìn)一步地，步驟2)中，所述吡咯、3-硝基酪氨酸和氯金酸的摩爾比為1:1:1。

進(jìn)一步地，步驟3)中，所述3-硝基酪氨酸模板分子去除的過(guò)程如下：將步驟2)制備的傳感器浸入ph＝7.0的磷酸緩沖液中6～8min即可。

一方面，本發(fā)明提供一種運(yùn)用本發(fā)明方法制備的3-硝基酪氨酸的分子印跡電化學(xué)傳感器。

另一方面，本發(fā)明提供一種本發(fā)明制備的3-硝基酪氨酸的分子印跡電化學(xué)傳感器在定性或定量檢測(cè)3-硝基酪氨酸分子的應(yīng)用?？捎糜跈z測(cè)體液，尤其是血液、尿液中的3-硝基酪氨酸分子。

進(jìn)一步地，所述應(yīng)用的檢測(cè)步驟如下：

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對(duì)電極，分子印跡電化學(xué)傳感器為工作電極，連接到電化學(xué)工作站，在待測(cè)樣品溶液中，掃描電位為1.02v，檢測(cè)電化學(xué)傳感器洗脫和吸附模板分子前后的電信號(hào)變化，按照電流-濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算樣品中3-硝基酪氨酸的濃度。

進(jìn)一步地，所述電流-濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制過(guò)程如下：

以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對(duì)電極，分子印跡電化學(xué)傳感器為工作電極，連接到電化學(xué)工作站，在2.0×10^-7～5.0×10^-5mol/l濃度的3-硝基酪氨酸中，掃描電位為1.02v，檢測(cè)電化學(xué)傳感器洗脫和吸附模板分子前后的電信號(hào)變化與3-硝基酪氨酸濃度的關(guān)系，繪制電流-濃度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

碳納米管具有獨(dú)特的力學(xué)、電學(xué)和熱力學(xué)等性質(zhì)，通過(guò)化學(xué)手段對(duì)碳納米管通過(guò)表面修飾來(lái)改善碳納米管的溶解度性和分散性，增強(qiáng)多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶導(dǎo)電性強(qiáng)，成為構(gòu)建電化學(xué)傳感器的優(yōu)良材料；本發(fā)明采用多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶修飾電極能夠在電極表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從而加速電子傳遞同時(shí)提供更多結(jié)合位點(diǎn)。因此基于多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶構(gòu)造的電化學(xué)生物傳感器能夠提高電化學(xué)信號(hào)的靈敏度。

金納米粒子特有的催化功能和高的有效面積等優(yōu)勢(shì)，對(duì)生物活性物質(zhì)顯示出突出的電導(dǎo)性能和優(yōu)秀的生物相容性。另外，由于分子印跡傳感器表面上的有效結(jié)合位點(diǎn)決定著傳感器的靈敏度，因此為了進(jìn)一步提高分子印跡傳感器的導(dǎo)電性，本發(fā)明采用同時(shí)沉積納米金和分子印跡膜來(lái)構(gòu)造導(dǎo)電分子印跡聚合膜，從而使得分子印跡膜擁有高導(dǎo)電性、大的表面積和優(yōu)秀的生物相容性等優(yōu)勢(shì)，也提高了檢測(cè)的靈敏度和對(duì)目標(biāo)分子的選擇性。

本發(fā)明制備的傳感器靈敏度高，檢測(cè)速度快，只需要幾分鐘就可以完成一個(gè)基本的檢測(cè)過(guò)程；本發(fā)明檢測(cè)3-硝基酪氨酸的方法，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏，便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

本發(fā)明通過(guò)研制功能化納米材料分子印跡電化學(xué)傳感器，采用復(fù)合納米金-分子印跡聚合物對(duì)電極進(jìn)行修飾，獲得的電化學(xué)傳感器兼?zhèn)溥x擇性響應(yīng)能力強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，可望實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的微型化和現(xiàn)場(chǎng)操作化，能簡(jiǎn)化操作、快速響應(yīng)、高檢測(cè)精度及較強(qiáng)抗干擾性，這對(duì)3-硝基酪氨酸的快速、靈敏的分析檢測(cè)和相關(guān)疾病的早期診斷具有重要意義。

本發(fā)明公開(kāi)的分子印跡電化學(xué)傳感器，為生物標(biāo)記物3-硝基酪氨酸的功能化納米材料分子印跡電化學(xué)傳感器，其制備是首先將多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶滴涂于玻碳電極上，得到功能化納米材料電極，再把該功能化納米材料電極同時(shí)沉積納米金和分子印跡膜，最終得到功能化納米材料分子印跡電化學(xué)傳感器。

本發(fā)明公開(kāi)的傳感器還具有如下優(yōu)勢(shì)：選擇性好；對(duì)3-硝基酪氨酸靈敏度高；具有制作簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定，能重復(fù)使用；且制備價(jià)格低廉，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，設(shè)備便攜適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為電流-濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

圖2為3-硝基酪氨酸的分子印跡電化學(xué)傳感器的制備流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例1電極的制備

1)玻碳電極的預(yù)處理:將玻碳電極依次用0.5μm、0.05μm的al2o3粉在麂皮上拋光，用超純水沖洗后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的硝酸溶液、乙醇和水中分別超聲清洗5min，然后將電極于5mmol/l鐵氰化鉀中掃描，直到得到可逆的循環(huán)伏安峰為止；

2)多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶納米材料的制備：120mgmwcnt分散于40mlh2so4/h3po4(摩爾比為9:1)溶液中，室溫?cái)嚢?h。然后向上述溶液中緩慢加入600mgkmno4后，65℃條件下，水浴加熱2h。最后加入400ml冰水(包含有5ml30％h2o2)終止反應(yīng)。用聚四氟乙烯膜過(guò)濾，水洗，乙醇洗，最后60℃真空干燥過(guò)夜，得到mwcnt@gonrs納米材料；將所得mwcnt@gonrs納米材料溶解于去離子水溶液中，超聲1h，得到均一溶液；

3)活化多壁碳耦合氧化石墨烯納米材料修飾玻碳電極的制備：取10μl的多壁碳耦合氧化石墨烯納米帶溶液滴在步驟1)處理好的玻碳電極表面，紅外燈下烘干；將修飾mwcnt@gonrs的玻碳電極浸于ph7.0磷酸緩沖液中，采用電壓范圍為0.6v～-1.8v，掃描速率0.1v/s來(lái)制備活化的mwcnt@gonrs膜；

4)摻雜納米金-分子印跡聚合物溶液的配制：配制0.1mol/lkno3溶液，加入0.5mmol/l模板分子(3-硝基酪氨酸)，0.5mmol/l功能單體(吡咯)和0.5mmol/l氯金酸溶液，超聲10min，形成均一溶液，備用；

5)3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器的制備：將活化的mwcnt@gonrs電極置于步驟4)制備的摻雜納米金-分子印跡聚合物溶液中，采用電壓范圍為-1.0v～1.0v,掃描速率為0.05v/s，掃描圈數(shù)為10圈，進(jìn)行電聚合分子印跡膜，完成后用去離子水沖洗電極，然后在紅外燈下干燥晾干；將電極浸入ph＝7.0的磷酸緩沖液中6～8min，采用ph7.0磷酸緩沖溶液洗脫掉傳感器表面上的模板分子(3-硝基酪氨酸)，自然晾干，即得3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器。

實(shí)施例2工作曲線的繪制及檢測(cè)限的測(cè)定

用方波溶出伏安法進(jìn)行3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器響應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定線性范圍及檢測(cè)限。將3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器浸入不同3-硝基酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品中，然后進(jìn)行方波溶出伏安法測(cè)量。以ag/agcl為參比電極，以pt電極為對(duì)電極，分子印跡電化學(xué)傳感器為工作電極，連接到電化學(xué)工作站，在不同濃度的3-硝基酪氨酸中，掃描電位為1.02v，檢測(cè)電化學(xué)傳感器洗脫和吸附模板分子前后的電信號(hào)變化與3-硝基酪氨酸濃度的關(guān)系，繪制工作曲線，如圖1所示。

3-硝基酪氨酸溶液濃度在2.0×10^-7～5.0×10^-5mol/l范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；線性方程為ip(μa)＝0.3934c+5.778×10^-7。該方法所得的檢出限為5.0×10^-8mol/l。

因此，該3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器具有極高的靈敏度。

實(shí)施例3修飾電極的再生、重現(xiàn)性及干擾實(shí)驗(yàn)

在實(shí)施例1所述的條件下制備5支3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器，采用同一支3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)5.0×10^-5mol/l3-硝基酪氨酸進(jìn)行連續(xù)5次測(cè)量，在每一次測(cè)量后，電極都要用去離子水對(duì)電極表面進(jìn)行清洗。計(jì)算電流響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2％(n＝5)，說(shuō)明該分子印跡電極具有較好的重現(xiàn)性。模板分子與印跡膜上的“孔穴”的結(jié)合為可逆過(guò)程，3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器可重復(fù)使用。此外，采用貯存避光條件下三個(gè)月的修飾電極對(duì)相同濃度的3-硝基酪氨酸進(jìn)行測(cè)定，氧化峰電流還保持為原來(lái)的94.5％，說(shuō)明該3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器有良好的穩(wěn)定性。

將3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器置于常見(jiàn)共存離子和其他氨基酸溶液中，考察常見(jiàn)共存離子和其他氨基酸對(duì)3-硝基酪氨酸測(cè)定的影響。結(jié)果表明，在誤差5％的范圍內(nèi)，100倍濃度的k⁺、ca²⁺、co3^2-、cl^-、so4^2-、葡萄糖、蔗糖、淀粉、酪氨酸、半胱氨酸、抗壞血酸、色氨酸、組氨酸、尿酸和苯胺對(duì)3-硝基酪氨酸的測(cè)定均不產(chǎn)生干擾，說(shuō)明了本發(fā)明制備的3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)一般干擾物質(zhì)有一定抗干擾性。

實(shí)施例4正常人血清樣品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的檢測(cè)效果，隨機(jī)選擇6份正常人血清樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。血清樣品通過(guò)用2倍體積的甲醇沉淀蛋白后，上清液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)鼜?fù)溶后，吸取500μl體積樣品于10ml容量瓶中，用0.1mol/l磷酸鹽緩沖液定容后，采用本發(fā)明的3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器來(lái)進(jìn)行電化學(xué)分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)下表1。

從表1中數(shù)據(jù)可知，該方法的平均回收率在97.0％-101.6％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.4％-2.3％之間，說(shuō)明本發(fā)明制備的3-硝基酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器檢測(cè)效果良好。

表1血清樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以上所述僅為發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。