本發(fā)明涉及一種微生物限度檢查方法，尤其是一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，屬于化學檢測技術領域。

背景技術：

壯腰健腎丸具有壯腰健腎、養(yǎng)血、祛風濕的作用，用于治療腎虧腰痛、膝軟無力、小便頻數、風濕骨痛、神經衰弱。藥品中的成分含有狗脊、黑老虎、千斤拔、桑寄生(蒸)、女貞子(蒸)、雞血藤、金櫻子、牛大力、菟絲子(鹽水制)等。根據其用藥途徑和制法，應進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定，及控制菌——大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門氏菌的檢查。

技術實現要素：

針對上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單，檢測結果準確可靠的壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法。

為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是這樣的：

一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，依次包括下述步驟：

1)菌液制備

2)供試液制備

3)方法建立及回收率試驗

常規(guī)法：

試驗組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；

菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；

供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，計算其回收率。

4)控制菌檢驗方法的建立及驗證

4.1)菌懸液制備

取含菌量為1000～10000cfu/ml的銅綠假單胞菌懸液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數為10～100cfu/ml的菌懸液，備用。

取經33℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數為10～100cfu/ml的菌懸液，備用；

4.2)供制備試液

4.3)試驗方法：

取供試品組樣品做大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門氏菌檢查；

取供試品組樣品，加入相應的陽性菌菌液1ml進行培養(yǎng)，作大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門氏菌檢查；

取稀釋液10ml做大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門氏菌檢查，作為陰性對照。

優(yōu)選的，上述的一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，所述的菌液制備的制備方法為：取經33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；取經25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用。

優(yōu)選的，上述的一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，所述的供試液的制備方法為：取本品10g，加入預熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖30min，混勻，作為1:10供試液。

優(yōu)選的，上述的一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，所述的大腸埃希菌的制備方法為：取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物1.0ml，接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，44℃培養(yǎng)24h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

優(yōu)選的，上述的一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，所述的耐膽鹽革蘭陰性菌的制備方法為：取10ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管1支，加入1:10的供試液1ml，，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

優(yōu)選的，上述的一種壯腰健腎丸微中生物限度的檢查方法，所述的沙門氏菌的檢查方法為：取本品10g，加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物0.1ml，接種至10mlrv沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h，取rv沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

本發(fā)明與現有技術相比，具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明提供的方法，微生物計數法、1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法、1107非無菌藥品微生物限度標準有關規(guī)定，進行微生物限度檢查方法適用性試驗，以確保檢查方法的準確、可靠。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明的權利要求書做進一步說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制，任何對本發(fā)明做有限次修改可得的技術方案仍然屬于本發(fā)明所要保護的范圍。

實施例1

1、實驗用品

1.l儀器設備

生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、全自動壓力滅菌器、電熱恒溫干燥箱、電冰箱、微波爐、恒溫水浴箱、電子天平(感量0.1g)、thermoscientificmaximixii渦旋振蕩器、氣浴恒溫振蕩器、勻漿儀。

1.2玻璃器皿

錐形瓶、平皿、燒杯、分度吸管、試管及硅膠塞，均于180℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌15min。

1.3用具

無菌衣、帽、口罩、手套、皮乳頭、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球及碘伏棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、滅菌過濾筒、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、實驗記錄紙等。

1.4試液及培養(yǎng)基

l.4.1消毒液

0.1％苯扎溴銨溶液(供洗手、擦拭操作臺面用)，5％苯酚溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內供消毒帶菌吸管用)、75％乙醇溶液、碘伏溶液。

1.4.2稀釋劑

0.9％無菌氯化鈉溶液(稀釋菌液用)、含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(稀釋供試品用)。

1.4.3培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、rv沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基。

1.5樣品

壯腰健腎丸，批號：1816006、1816005、1816004，生產廠家：廣西靈峰藥業(yè)有限公司

2、需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗的建立及驗證

2.1菌種

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)[cmcc(b)10104]

金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)[cmcc(b)26003]

枯草芽孢桿菌(.bacillussulticis)[cmcc(b)63501]

白色念珠菌(candidaalbicans)[cmcc(f)98001]

黑曲霉(aspeigillusniger)[cmcc(f)98003]

中國食品藥品檢定研究院提供

2.2菌液制備

取經33℃培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液及25℃培養(yǎng)24h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數為1000～10000cfu/ml的菌懸液，備用；取經25℃培養(yǎng)7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面，加入5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用帶有棉花的球形吸管吸出孢子懸液，用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液制成含孢子數為1000～10000cfu/ml的孢子懸液，備用。

2.3供試液制備

取本品10g，加入預熱至45℃的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，45℃氣浴振搖30min，混勻，作為1:10供試液。

2.4方法建立及回收率試驗

2.4.1常規(guī)法：

試驗組：吸取1:10供試液9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；

菌液對照組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9ml，共5份，每份中加入0.1ml的試驗菌懸液，搖勻，分別從試驗菌試管中吸取1ml至平皿中，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另從真菌試管中分別吸取1ml至平皿中，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；每株試驗菌平行制備2個平皿；

供試品組：吸取1:10供試液1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；

稀釋劑組：吸取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1ml至平皿，平行制備4個平皿，其中2個傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外2個傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

各平皿傾注規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，分別置規(guī)定溫度培養(yǎng)3－5d，測定需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數，計算其回收率，見表1。

表1回收率試驗結果：常規(guī)法

結果顯示，需氧菌總數的各株試驗菌回收率均在50％－200％，表明壯腰健腎丸對細菌有無抑制作用，采用常規(guī)法進行需氧菌總數測定可行。

霉菌和酵母菌總數的各株試驗菌回收率均在50％－200％，表明壯腰健腎丸對真菌無抑制作用，采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數測定可行。

2.5方法驗證

取1批供試品，批號為：1816006，按常規(guī)法進行需氧菌總數、常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數的計數方法驗證，結果見2至表5：

表2第一次試驗結果

表3第二次試驗結果

表4第三次試驗結果

3次驗證試驗總結：

表4壯腰健腎丸----需氧菌總數計數方法適用性試驗回收率

表5壯腰健腎丸----霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗回收率

3次驗證試驗結果表明，以常規(guī)法進行壯腰健腎丸需氧菌總數、以常規(guī)法進行霉菌和酵母菌總數測定，五株試驗菌的回收率均在50％－200％，符合《中國藥典》2015年版四部1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法的規(guī)定，方法可行。

確定采用常規(guī)法進行壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中需氧菌總數檢查，采用常規(guī)法進行壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中霉菌和酵母菌總數檢查。

3、控制菌檢驗方法的建立及驗證

3.1菌種

大腸埃希菌(escherichiacoli)[cmcc(b)44102]

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)[cmcc(b)10104]

乙型副傷寒沙門氏菌(salmonellaparatyphi)[cmcc(b)50094]

中國食品藥品檢定研究院提供

3.1.1菌懸液制備同2.2

取2.2下含菌量為1000～10000cfu/ml的銅綠假單胞菌懸液，用0.9％無菌氯化鈉溶液稀釋制成含菌數為10～100cfu/ml的菌懸液，備用。

取經33℃培養(yǎng)24h的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)液，用0.9％無菌氯化鈉溶液制成含菌數為10～100cfu/ml的菌懸液，備用；

3.2供試液的制備同2.3

3.3試驗方法：

供試品組取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”操作做控制菌檢查法檢查。

陽性對照試驗取規(guī)定量的樣品照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”操作，并加入相應的陽性菌菌液1ml進行培養(yǎng)，作相應控制菌檢查法檢查。

陰性對照試驗取稀釋液10ml代替供試液照“3.3.1”、“3.3.2”、“3.3.3”做控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。

3.3.1大腸埃希菌：

取1：10供試液10ml接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物1.0ml，接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，44℃培養(yǎng)24h，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.3.2耐膽鹽革蘭陰性菌：

取10ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基管1支，加入1:10的供試液1ml，，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.3.3沙門氏菌：

取本品10g，加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)物0.1ml，接種至10mlrv沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)24h，取rv沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板，33℃培養(yǎng)24h，觀察其菌落形態(tài)。

3.4試驗結果

3.3.1大腸埃希菌：

供試品組：在麥康凱瓊脂平板中無菌落生長；

陽性對照組：在麥康凱瓊脂平板中有典型大腸埃希菌菌落生長；革蘭氏染色鏡檢為g^-桿菌，生化鑒定結果為典型大腸埃希氏菌生化反應，結果見表6。

表6大腸埃希菌實驗結果

陰性對照組：在麥康凱瓊脂平板中無菌落生長；

表明壯腰健腎丸可采用常規(guī)法進行大腸埃希菌檢驗，方法可行。

3.3.2耐膽鹽革蘭陰性菌：

供試品組：在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板中無菌落生長；

陽性對照組：

大腸埃希菌陽性對照組：在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板中有菌落生長；

銅綠假單胞菌陽性對照組：在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板中有菌落生長；

陰性對照組：在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板中無菌落生長；

表明壯腰健腎丸可采用常規(guī)法進行耐膽鹽革蘭陰性菌檢驗，方法可行。

3.3.3耐膽鹽革蘭陰性菌：

供試品組：在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板中無菌落生長；

陽性對照組：在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板中有典型沙門氏菌菌落生長；革蘭氏染色鏡檢為g^-桿菌，初步生化鑒定結果為典型沙門氏菌屬生化反應。

表7耐膽鹽革蘭陰性菌實驗結果

陰性對照組：在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板中無菌落生長；

表明壯腰健腎丸可采用常規(guī)法進行沙門氏菌檢驗，方法可行。

3.5確定壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中控制菌檢查方法為常規(guī)法。

4結論

經過驗證：確定采用常規(guī)法進行壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中需氧菌總數檢查，采用常規(guī)法進行壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中霉菌和酵母菌總數檢查。

采用常規(guī)法進行壯腰健腎丸的非無菌產品微生物限度檢查中大腸埃希菌檢查、耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門氏菌。

5三批壯腰健腎丸的微生物限度檢查

按所建立的壯腰健腎丸非無菌產品微生物限度檢查法，對三批樣品進行檢驗，結果見表8。

表8三批壯腰健腎丸的微生物限度檢查

需要說明的是，本發(fā)明未詳細涉及的技術參數，均按照本領域常規(guī)技術手段或者中國藥典規(guī)定的參數進行。