本發(fā)明屬于海洋動物細胞成分定量檢測技術領域，特別涉及一種刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光檢測方法。

背景技術：

鈣離子作為一個主要的細胞內(nèi)信使，參與并調(diào)控許多細胞和組織的生理活動，包括新陳代謝、肌肉收縮、分泌以及細胞分裂。在細胞凋亡的分子機制中，鈣信號在許多細胞凋亡的分子機制中對生理和細胞活動都起到了重要作用，許多研究證據(jù)都表明鈣信號參與細胞凋亡的調(diào)控。細胞經(jīng)過嚴格的控制系統(tǒng)維持鈣離子的平衡，一是依賴于細胞質(zhì)膜的鈣泵及鈣通道，二是胞內(nèi)鈣庫，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，能使細胞內(nèi)鈣例子維持精確與穩(wěn)定。胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)在細胞生理過程中占有極其重要的地位，許多細胞是以鈣離子作為第二信使傳遞胞內(nèi)信息，誘發(fā)一系列的細胞形態(tài)、生理和分子生物學事件的發(fā)生。與細胞的其他生物學現(xiàn)象(如增殖、分化)一樣，激發(fā)自主死亡程序是通過誘導凋亡的細胞外信號經(jīng)過細胞內(nèi)信號的傳導。

鈣離子作為胞內(nèi)信號傳導重要因子，其穩(wěn)態(tài)失調(diào)是細胞凋亡中的一個普遍現(xiàn)象，在細胞凋亡的研究中，kaiser和edelman較早發(fā)現(xiàn)，當糖皮質(zhì)激素誘導的胸腺細胞凋亡時，會有鈣離子內(nèi)流增強的現(xiàn)象。lennon等觀察到在凋亡晚期時細胞內(nèi)鈣離子濃度的會升高。此外，胞外鈣離子螯合劑及細胞內(nèi)鈣離子緩沖劑能抑制許多因素誘發(fā)的凋亡，間接證明了鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)在啟動細胞凋亡中具有重要作用。

然而，在動物或植物細胞中，鈣離子以三種形式存在：1.與細胞結構成分或大分子結合，即結合鈣；2.貯存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡、線粒體等胞內(nèi)鈣庫中，即貯存鈣；3.以離子形式存在于細胞中，即游離鈣。細胞中的貯存鈣和游離鈣是可以相互轉(zhuǎn)換的。在靜止狀態(tài)下，細胞中游離鈣的鈣離子以一個非常低的濃度存在，大約維持在10^-8～10^-7mol/l。當受到外界刺激時，細胞質(zhì)中的游離鈣會迅速發(fā)生變化，使細胞中鈣離子的濃度達到10^-5mol/l，這個變化通常發(fā)生在毫秒甚至亞毫秒級水平。

刺參體腔內(nèi)充滿了體腔細胞，這些體腔細胞發(fā)揮氣體交換，營養(yǎng)物質(zhì)運輸及貯存，排泄和免疫防御等作用。研究表明，海洋無脊椎動物體腔細胞作為一種環(huán)境脅迫的細胞生物傳感器，可以用來評估水生生態(tài)系統(tǒng)健康，也可以用來評價水產(chǎn)動物的鮮活程度。文獻報道，作為重要的第二信使，刺參體腔細胞內(nèi)ca²⁺濃度變化參與調(diào)控刺參細胞的增殖、分化、礦化、自噬和凋亡等過程，從而影響刺參的生理免疫狀況。迄今為止，對刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子進行標記的有效方法和技術還未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于激光掃描共聚焦顯微鏡的測定刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供了一種刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測方法，包括以下步驟：

(1)同時提取隨機分組的刺參體腔液，每組刺參數(shù)量大于等于5只，所述體腔液中含有體腔細胞；

優(yōu)選方式下，步驟(1)所述提取刺參體腔液的方法為：剖開刺參腹部，提取出體腔液，采用300目濾布過濾除雜，經(jīng)過過濾后的刺參體腔液分裝于10mlep管中；

(2)將步驟(1)提取出的同一組的刺參體腔液等體積混合，吸取1000μl混合后的刺參體腔液于1.5mlep管中，輕輕吹打混勻使體腔細胞均勻懸浮在體腔液中，吸取10μl刺參體腔液注入到25格x16格的血球計數(shù)板中，通過光學顯微鏡鏡下計數(shù)，得到刺參體腔細胞起始濃度；依據(jù)獲得的濃度對刺參體腔液進行稀釋制得細胞懸液，使其工作濃度約為10⁶～10⁷cells/ml，將所述細胞懸液置于18℃恒溫生長培養(yǎng)箱中待用；

所述稀釋采用經(jīng)高溫高壓(121℃，30min)殺菌后放置于4℃保存的、不含體腔細胞的刺參體腔液；

本發(fā)明使用的是25格x16格的血球計數(shù)板，計數(shù)公式為：體腔細胞個數(shù)/1ml＝80個小方格細胞總數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)，上述公式根據(jù)參考周柬明發(fā)表的文章《血球計數(shù)板的使用及相關計算》。

本發(fā)明對提取的體腔液進行兩次分裝，充分消除刺參個體差異；體腔液中含有體腔細胞，若體腔液放置一段時間，體腔細胞會發(fā)生沉降現(xiàn)象，本發(fā)明檢測過程中輕輕吹打混勻可以使體腔細胞均勻懸浮在體腔液中。

(3)將已知濃度的細胞懸液與胞內(nèi)鈣離子熒光探針fluo-3am進行熒光探針裝載、低溫孵育，得到染色體腔細胞液；

優(yōu)選方式下，向步驟(2)制得的細胞懸液中，加入鈣離子熒光探針fluo-3am(上海碧云天生物技術有限公司，s1056)，18～25℃避光暗反應30min～60min，得到染色體腔細胞液；

每500μl所述細胞懸液加入0.5～1.5μl所述鈣離子熒光探針，至細胞懸液中鈣離子熒光探針的終濃度為0.5～5μm；

本發(fā)明所述加入鈣離子熒光探針fluo-3am的工作濃度為0.5～5μm，采用的鈣離子熒光探針fluo-3am進入細胞后可以被細胞內(nèi)的酯酶剪切形成fluo-3，被滯留在細胞內(nèi)，fluo-3可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產(chǎn)生較強的熒光，對鈣離子濃度變化的檢測更加準確和靈敏。

(4)用激光共聚焦掃描顯微鏡測定步驟(4)得到的所述孵育后的體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度。

優(yōu)選方式下，步驟(4)中，向步驟(3)制得的染色體腔細胞液中再加入鈣離子探針助染劑pluronicf-127(sigma，p2443)，混合均勻，18～25℃避光暗反應15min～30min，激光共聚焦掃描顯微鏡測定刺參體腔細胞中鈣離子濃度；

每500μl所述染色體腔細胞液加入0.5～1.5μl所述鈣離子探針助染劑，所述鈣離子探針助染劑pluronicf-127的終濃度為0.05～0.15％(g/ml)。

優(yōu)選方式下，步驟(4)所述激光共聚焦掃描顯微鏡的參數(shù)設置為：物鏡objective為40或者63倍油鏡，激光管為氬離子激光器，激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長范圍為525nm～530nm，光電倍增管增益gain為500～600，激光掃描強度scanstr為2％～5％，采用xyt掃描程序?qū)毎M行無損傷連續(xù)掃描拍照，在室溫、暗黑條件下掃描30min，時間間隔為20s。

步驟(4)中，本發(fā)明所述加入的鈣離子探針助染劑pluronicf-127先用dmso配制成50％(g/ml)的溶液，使用時加入到上述染色體腔細胞液中至達到工作濃度為0.05～0.15％(g/ml)，采用的鈣離子探針助染劑pluronicf-127對細胞相對無毒性，不會改變細胞膜特性，常與染料am酯一起使用，增強染料的水溶性，提高其細胞滲透性。

相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1、本發(fā)明采用激光光源，提高信號的穩(wěn)定性和特異性；

2、結合共聚焦探測系統(tǒng)，通過步驟(4)專門的光路設計使照明針孔與探測針孔在光路上相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像；與普通顯微鏡相比，克服了成像模糊的問題；同時，也有效的防止了免疫熒光偽彩的出現(xiàn)，保證了實驗結果的可靠性；提高了縱向分辨率，使得“光學切片”成為可能。

3、本發(fā)明充分計算機圖像分析系統(tǒng)，將信號數(shù)字化，便于信號的處理與分析。

綜上，本發(fā)明方法探索了用18℃低溫孵育裝載的方法將熒光探針fluo-3am導入刺參體腔細胞中，保證了有足夠數(shù)量的fluo-3am進入細胞內(nèi)，以便更準確地反映刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子的變化。

附圖說明

圖1為實施例未經(jīng)紫外線照射的刺參體腔細胞鈣離子熒光成像圖。

圖2為實施例未經(jīng)紫外線照射的刺參體腔細胞鈣離子熒光強度變化圖。

圖3為實施例經(jīng)紫外線(15w/m²)照射20min的刺參體腔細胞鈣離子熒光成像圖。

圖4為實施例經(jīng)紫外線(15w/m²)照射20min的刺參體腔細胞鈣離子熒光強度變化圖。

圖5為實施例經(jīng)紫外線(15w/m²)照射30min的刺參體腔細胞鈣離子熒光成像圖。

圖6為實施例經(jīng)紫外線(15w/m²)照射30min的刺參體腔細胞鈣離子熒光強度變化圖。

具體實施方式

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

fluo-3am的化學式為：c51h50cl2n2o23。

結構式為如下式ⅰ所示：

化學名稱為：

1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-n,n,n’,n’-tetraaceticacid,pentaacetoxymethylester。

實施例

(1)刺參體腔細胞的提?。?/p>

用剪刀沿刺參腹部剪開(斷尾)，提取出體腔液，經(jīng)300目濾布過濾用玻璃棒引流至100ml燒杯中，將體腔液分裝于10mlep管中；

(2)制備細胞濃度約為10⁶～10⁷cells/ml的細胞懸液：

提取出的刺參體腔液吸取1000μl于1.5mlep管中，輕輕吹打混勻使體腔細胞均勻懸浮在體腔液中，吸取10μl刺參體腔液注入到25格x16格的血球計數(shù)板中，使用光學顯微鏡進行鏡下計數(shù)，根據(jù)公式：體腔細胞個數(shù)/1ml＝80個小方格細胞總數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)，計算體腔細胞起始濃度，用刺參體腔液進行稀釋，使其工作濃度約為10⁶～10⁷cells/ml，置于18℃恒溫生長培養(yǎng)箱中待用；所述用于稀釋的刺參體腔液為經(jīng)高溫高壓(121℃，30min)殺菌的放置4℃保存的刺參體腔液；

(3)吸取500μl刺參體腔細胞懸液于1.5mlep管中，先加入0.5～1.5μl的鈣離子熒光探針fluo-3am，使其加入鈣離子熒光探針fluo-3am的工作濃度為0.5～5μm，室溫(18℃～25℃)避光暗反應30min～60min；再加入0.5～1.5μl的鈣離子探針助染劑pluronicf-127(sigma，p2443)，使其加入鈣離子探針助染劑pluronicf-127的工作濃度為0.05～0.15％(g/ml)，混合均勻，室溫(18℃～25℃)避光暗反應15min～30min，激光共聚焦掃描顯微鏡測定刺參體腔細胞中鈣離子濃度；

(4)激光共聚焦掃描顯微鏡的參數(shù)設置為：在低倍鏡下找到細胞，轉(zhuǎn)至40或者63倍油鏡(objective)下觀察，微調(diào)至視野內(nèi)成像清晰。根據(jù)所用染料fluo-3am，選擇氬離子激光器激發(fā)熒光信號，設置激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長范圍為525nm～530nm。先進行粗略掃描，依據(jù)掃描成像效果中熒光信號強弱，可調(diào)整光電倍增管增益(gain：500～600)、激光掃描強度(scanstr：2％～5％)。再采用xyt掃描程序?qū)毎M行無損傷連續(xù)掃描拍照，在室溫、暗黑條件下掃描30min(時間間隔為20s)，采集鈣離子熒光成像圖；利用相應的軟件對鈣離子熒光強度進行定量分析。鈣離子熒光強度的動態(tài)變化，即反應體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

(5)結果與意義

通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測在不同的紫外線誘導條件下刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化為：

(1)未經(jīng)紫外線照射的刺參體腔細胞內(nèi)鈣離子濃度沒有明顯的變化(圖1和圖2)，測得其鈣離子熒光值為385.77，如表1所示；

表1

(2)與未經(jīng)紫外線照射的刺參相比較，其體腔細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度呈現(xiàn)升高的趨勢。當照射時間為20min時，其鈣離子熒光強度的動態(tài)變化呈現(xiàn)出一系列的波動，表明刺參體腔細胞發(fā)生了鈣離子“瞬時超載”的現(xiàn)象(圖3和圖4)，測得其鈣離子熒光值大約是未經(jīng)紫外線照射組的1.3倍以上，結果如表2所示；

表2

(3)與未經(jīng)紫外線照射的刺參相比較，當照射時間為30min時，其鈣離子熒光強度顯著持續(xù)升高，表明刺參體腔細胞發(fā)生鈣離子“穩(wěn)態(tài)失調(diào)”的現(xiàn)象(圖5和圖6)，測得其鈣離子熒光值大約是未經(jīng)紫外線照射組的1.3倍以上，結果如表3所示；

表3

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。