本發(fā)明屬于畜產品質量檢測
技術領域：
，具體涉及一種牛奶中蛋白和尿素的檢測方法。
背景技術：
：奶牛日糧能量和蛋白質平衡一直是反芻動物營養(yǎng)研究的熱點問題。若日糧配制不當，會造成日糧能氮不平衡的問題，而過量的營養(yǎng)不但增加了奶牛的代謝負擔和飼養(yǎng)成本，而且最終排放到環(huán)境中導致污染。根據我國的蛋白質新體系，馮仰廉提出“瘤胃能氮平衡”原理，來指導奶牛日糧的配制。通過檢測牛乳中的乳蛋白和乳尿素(MUN)，可以評價奶牛日糧是否滿足能氮平衡，其判斷標準見表1。表1利用不同乳蛋白和MUN水平評價日糧中蛋白質和能量水平奶牛生產上，及時、經常檢測乳蛋白和乳尿素含量，是推廣奶牛能氮平衡理論指導改進奶牛日糧配方的必要條件之一。牛乳中蛋白質的檢測方法有：考馬斯亮藍方法、凱氏定氮方法、乳成分快速檢測儀分析法等；牛乳中的尿素檢測方法有：紫外一可見分光光度計法、近紅外光譜法、乳成分快速檢測儀分析法等，均需要精密分析儀器和相應的技術人員。目前牛場即沒有相關儀器，也缺乏相應的技術人員。因此，需要研究一種簡便、易行、成本低廉的乳蛋白和乳尿素含量的檢測方法，對牛場工作人員進行簡單的培訓即可準確分析出乳中蛋白和尿素的含量。中國專利CN201510172395.8公開了一種牛奶蛋白的檢測方法，建立對比值(沉淀質量：牛奶體積)法檢測牛奶蛋白含量的方法，發(fā)現(xiàn)影響牛奶蛋白含量的測定方法包括牛奶的靜置時間、離心時間、離心轉速、冰乙酸濃度等因素，獲得了沉淀牛奶蛋白的最佳參數，即靜置9min、離心7min、離心12000r/min、冰乙酸濃度為0.3mol/L。對牛奶蛋白含量與比值的相關性數據進行偏最小二乘法分析，獲得牛奶蛋白含量X與比值Y的回歸線性方程：Y＝0.0645X+0.0581，R2＝0.9896，在2.0-4.0g/100mL范圍內時，牛奶蛋白含量X與比值Y之間存在較強的線性相關。但該專利存在以下缺點：(1)該方法測定鮮奶的乳蛋白含量時誤差偏大，原因是鮮奶是未經加工過的原料乳，鮮奶乳脂肪球的直徑比均質后的牛奶的乳脂肪直徑大得多，鮮奶乳脂肪球易浮于離心液上部，導致沉淀質量減小，從而導致測定結果偏低。(2)該方法不能同時測定乳尿素含量。(3)該方法需要使用離心機，天平等設備，不便牛場推廣。中國專利201410830036.2公開了一種尿素快速檢測試劑盒，其包括試劑I、試劑II、試劑III和試劑IV，其中：試劑I包括EDTA二鈉和海藻糖；試劑II為脲酶；試劑III包括無水檸檬酸、水楊酸鈉和硝普鈉；試劑IV包括氫氧化鋰、二氯異氰尿酸鈉和無水硫酸鈉。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法能夠有效屏蔽游泳池水中的銅離子和余氯對檢測結果的干擾，量程為0.5-8.0mg/L，測試時間約20min，試劑在室溫下保質期長，準確率高、特異性強、穩(wěn)定性好，方便快捷，適用于游泳池的現(xiàn)場快速檢測，測試結果與國標檢測方法相近，因此該試劑盒具有良好的應用前景。但該專利存在以下缺點：(1)該方法不能測定蛋白質含量。(2)該方法用于游泳池水樣本檢測，需要掩蔽銅離子和余氯，牛奶樣本中尿素檢測需要掩蔽的主要離子為鈣離子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種乳蛋白和乳尿素含量的檢測方法，該方法設備簡單便宜，檢測方便，特別適合在牛場推廣。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：(1)乳蛋白的測定：取濃縮瓶，精密量取乳汁0.6-1.0毫升，加入3-5mL沉淀劑1，混勻搖勻，然后加入3-5mL沉淀劑2，蓋上蓋子，上下混勻。靜止12-24小時，觀察沉淀體積，沉淀體積與乳蛋白含量成正比。沉淀體積與沉淀劑用量相關。(2)建立線性方程：取濃縮瓶5個，分別精密量取蛋白濃度為2.6，2.8，3.0，3.2，3.4g/100mL標準乳樣0.6-1.0毫升，加入3-5mL沉淀劑1，搖勻，然后加入3-5mL沉淀劑2，蓋上蓋子，上下混勻，靜止12-24小時，讀取沉淀體積，以沉淀體積為縱坐標(mL)，以蛋白濃度為橫坐標(g/100mL)，得線性標準曲線，其方程可以表示為：y＝ax+b，其中x為蛋白質濃度，以g/100mL計，其中y為沉淀體積，以mL計，其中a，b為常數，跟沉淀劑濃度有關。其中步驟(1)中沉淀劑1的制備方法如下：稱取2.12g亞鐵氰化鉀，用超純水溶解并定容至100mL。其中步驟(1)中沉淀劑2的制備方法如下：稱取4.38g乙酸鋅，用超純水溶解并定容至100mL。(3)乳尿素含量的測定：繼續(xù)在步驟(1)的濃縮瓶中加入酶液體2-5mL，反應20-30min，然后加入5-10mL顯色劑1和1-2mL顯色劑2，混勻，反應20min，由無色變成藍色，與標準比色卡比較顏色深淺，讀出尿素濃度，以mg/100mL計。(4)標準比色卡的制備：用標準乳樣和尿素配制尿素濃度分別為10mg/100mL、11mg/100mL、12mg/100mL、13mg/100mL、14mg/100mL、15mg/100mL、16mg/100mL、17mg/100mL、18mg/100mL的尿素標準乳樣；分別取各濃度的標準溶液0.6mL至濃縮瓶中，加入3mL沉淀劑1，搖勻，然后加入3mL沉淀劑2，蓋上蓋子，上下混勻，垂直靜止24小時；加入酶液2mL，反應20min；然后加入5mL顯色劑1和1mL顯色劑2，反應20min；反應完畢，獲得各濃度的尿素標準乳樣顯色時所呈現(xiàn)的標準色，根據得到的各標準色所列潘通色值采用電腦調色和印制，得到標準比色卡，如圖1所示。其中步驟(3)中酶液體的制備方法如下：稱取尿酶1g，用緩沖溶液溶解并定容至250mL；其中緩沖溶液的制備方法如下：稱取2.6g草酸溶于100ml超純水中，用2mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值為6.5。其中步驟(3)中顯色劑1的制備方法如下：稱取2g水楊酸，亞硝基鐵氰化鈉0.1g，加入約10mL水，再加入2mol/L氫氧化鈉溶液5.5mL，攪拌使之完全溶解(若水楊酸未能全部溶解，可再加入數毫升2mol/L氫氧化鈉，直至完全溶解為止，并用2mol/L鹽酸調節(jié)溶液pH值在6.0-6.5之間)，再稱取2g酒石酸鉀鈉，溶于10ml水中，與上述溶液合并移入100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度；其中步驟(3)中顯色劑2的制備方法如下：量取含有效氯6％(重量百分比)的次氯酸鈉溶液5mL，置100mL容量瓶中，用0.5％氫氧化鈉溶液(重量百分比)稀釋至刻度。本發(fā)明優(yōu)選的技術方案為：(1)乳蛋白的測定：取25mL濃縮瓶，精密量取待測乳汁0.6mL，加入3mL沉淀劑1，搖勻，然后加入3mL沉淀劑2，蓋上蓋子，上下混勻，垂直靜止24小時，讀取沉淀體積。(2)建立線性方程：取25mL濃縮瓶5個，分別精密量取蛋白濃度為2.6，2.8，3.0，3.2，3.4g/100mL標準乳樣0.6mL，加入3mL沉淀劑1，搖勻，然后加入3mL沉淀劑2，迅速蓋上蓋子，上下混勻，靜止24小時，讀取沉淀體積，以沉淀體積為縱坐標(mL)，以蛋白濃度為橫坐標(g/100mL)，得線性標準曲線，y＝1.559x-1.391，R2＝0.997；其中x為蛋白質濃度，以g/100mL計，其中y為沉淀體積，以mL計。將(1)中沉淀體積代入上述方程中，計算出待測乳汁中蛋白質的含量。(3)乳尿素含量的測定：繼續(xù)在(1)的濃縮瓶中加入酶液體2mL，反應20min，然后加入5mL顯色劑1和1mL顯色劑2，反應20min，與標準顯色卡比較，讀出待測乳汁中尿素含量。本發(fā)明的有益效果如下：(1)使用尾管較長的濃縮瓶進行蛋白質沉淀，通過沉淀體積計算牛乳汁中蛋白質的含量，可解決牛乳汁中蛋白檢測繁瑣問題。(2)使用酶解-水楊酸法使上清液顯色，通過其顏色與標準比色卡比色測出牛乳汁中尿素含量，可以同時測得牛乳中尿素含量。(3)建立一種牛乳中蛋白和尿素的快速簡便經濟的檢測方法，方便在牛場使用，牛場使用本發(fā)明檢測牛乳中蛋白和尿素含量，能了解奶牛日糧是否符合瘤胃能氮平衡，并依據檢測結果，調整奶牛日糧配方及飼喂方式。(4)本發(fā)明檢測樣品用量少，沉淀劑用量大，相當于對鮮牛乳進行了稀釋，有效減少脂肪球對檢測結果的影響。附圖說明圖1為乳尿素標準比色卡。具體實施方式下面通過實施例本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定。儀器：移液槍(1ml、5ml)；特制濃縮瓶：總體積25ml，尾管4ml，尾管最小刻度0.05ml；試劑：沉淀劑1：稱取2.12g亞鐵氰化鉀，用超純水溶解并定容至100mL；沉淀劑2：稱取4.38g乙酸鋅，用超純水溶解并定容至100mL；緩沖溶液：稱取2.6g草酸溶于100ml超純水中，用氫氧化鈉調節(jié)pH值為6.5；酶液：稱取尿酶1g，用上述緩沖溶液溶解并定容至250mL；顯色劑1：稱取2g水楊酸，亞硝基鐵氰化鈉0.1g，加入約10mL水，再加入2mol/L氫氧化鈉溶液5.5mL，攪拌使之完全溶解(若水楊酸未能全部溶解，可再加入數毫升2mol/L氫氧化鈉，直至完全溶解為止，并用2mol/L鹽酸調節(jié)溶液pH值在6.0-6.5之間)，再稱取2g酒石酸鉀鈉，溶于10ml水中，與上述溶液合并移入100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度；顯色劑2：量取含有效氯6％的次氯酸鈉溶液5mL，置100ml容量瓶中，用0.5％氫氧化鈉溶液稀釋至刻度；實施例1實驗方法：(1)乳蛋白的測定取25mL濃縮瓶，精密量取待測乳汁0.6mL，加入3mL沉淀劑1，搖勻，然后加入3mL沉淀劑2，蓋上蓋子，上下混勻，垂直靜止24小時，讀取沉淀體積(y)。代入方程y＝1.559x-1.391，R2＝0.997，計算出乳蛋白濃度(x)。其中x為蛋白質濃度，以g/100mL計，其中y為沉淀體積，以mL計為常數(2)乳尿素含量的測定：繼續(xù)在(1)的濃縮瓶中加入酶液2mL，反應20min，然后加入5mL顯色劑1和1mL顯色劑2，反應20min，與標準顯色卡比較，讀出尿素含量。本發(fā)明對5頭牛的乳汁，采用以上方法進行了測定，結果見表1，表2。表1實施例牛奶乳蛋白含量的測定樣品產品標準本發(fā)明方法凱氏定氮方法A≥2.6％3.263.17B≥2.6％3.473.51C≥2.6％2.492.51D≥2.6％3.042.99E≥2.6％3.243.30從表1可以看出，本發(fā)明方法測得的牛奶乳蛋白含量與凱氏定氮方法測得乳蛋白含量，按照“成對樣本t檢驗”方法進行統(tǒng)計分析，差異不顯著(p＝0.2588)。表2乳尿素含量的測定從表2可以看出，本發(fā)明方法測得的牛奶乳尿素含量與乳成分快速檢測儀分析法測得的乳尿素含量，按照“成對樣本t檢驗”方法進行統(tǒng)計分析，差異不顯著(p＝0.1522)。實施例2沉淀劑用量與線性方程方程取25mL濃縮瓶5個，分別精密量取蛋白濃度為2.6，2.8，3.0，3.2，3.4g/100mL標準乳樣0.6mL，加入4mL沉淀劑1，搖勻，然后加入4mL沉淀劑2，迅速蓋上蓋子，上下混勻，靜止24小時，讀取沉淀體積，以沉淀體積為縱坐標(mL)，以蛋白濃度為橫坐標(g/100mL)，得線性標準曲線，y＝1.236x一1.472，R2＝0.991；其中x為蛋白質濃度，以g/100mL計，其中y為沉淀體積，以mL計。實施例2方法測得的牛奶乳蛋白含量與凱氏定氮方法測得乳蛋白含量，按照“成對樣本t檢驗”方法進行統(tǒng)計分析，差異不顯著(p＝0.2580)。測得的牛奶乳尿素含量與乳成分快速檢測儀分析法測得的乳尿素含量，按照“成對樣本t檢驗”方法進行統(tǒng)計分析，差異不顯著(p＝0.1523)。對比例1將本發(fā)明的沉淀劑換做其他蛋白質沉淀劑，如：三氯乙酸，醋酸，鎢酸鈉等，不能形成穩(wěn)定的絮狀沉淀，不同乳蛋白濃度乳樣本沉淀體積差別極小，難于測量，不能按實施例方法建立檢測方程。且添加的沉淀試劑，對后續(xù)顯色反應有一定干擾作用，不能檢測乳尿素含量。雖然已經參照具體地實施方式詳細說明了本發(fā)明及其優(yōu)點，但是應當理解在不超出由所附的權利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進行各種改變、替代和變換。本領域內的普通技術人員從本發(fā)明的公開內容將容易理解，根據本發(fā)明可以使用執(zhí)行與在此所述的相應實施例基本相同的功能或者獲得與其基本相同的結果的、現(xiàn)有和將來要被開發(fā)的方法和步驟。因此，所附的權利要求旨在它們的范圍內包括這樣方法和步驟。當前第1頁1 2 3