本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及疾病診斷領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及，用于診斷受試者是否患有活動(dòng)性結(jié)核的方法，用于判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果的方法，以及用于篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物的方法。本發(fā)明還涉及含有特異性刺激原和檢測il-6水平的試劑的試劑盒。

背景技術(shù)：

結(jié)核病(tuberculosis,tb)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，是一種非常嚴(yán)重的全球性健康問題，全球每年新增結(jié)核病人約有900萬，因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達(dá)170萬。此外，據(jù)估計(jì)全球約有1/3人口為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者，這類人群為潛在的活動(dòng)性結(jié)核病人來源。

控制結(jié)核病，首要是發(fā)現(xiàn)并治愈傳染性結(jié)核病病人。x射線應(yīng)用于臨床檢測后，為發(fā)現(xiàn)結(jié)核病病人提供了一種簡便、易行、快速、敏感性高的方法；然而，x射線檢測設(shè)備要求高，特異性低，過診、漏診、誤診率較高；此外x射線檢測只能發(fā)現(xiàn)肺部可疑陰影，達(dá)不到檢測出傳染性病人的目的，因此1974年who第9次結(jié)核病專家委員會報(bào)告明確指出采取團(tuán)體胸部x射線主動(dòng)發(fā)現(xiàn)病人的方法，不僅在發(fā)達(dá)國家，在發(fā)展中國家都是不可取的，必須廢止。

痰涂片檢測可以檢出傳染性肺結(jié)核病病人，特異性高，設(shè)備要求簡單，費(fèi)用低，技術(shù)要求不高。但也存在取痰不易的問題，不少患者干咳無痰，或微量排菌不易檢出。廣泛應(yīng)用的痰涂片檢測靈敏度在34–80％之間，雖然痰培養(yǎng)檢測靈敏度高于痰涂片，但是耗時(shí)長，對診斷實(shí)驗(yàn)室的要求高，在很多高結(jié)核負(fù)擔(dān)國家無法滿足該方法對實(shí)驗(yàn)室條件的要求。免疫檢測技術(shù)在結(jié)核診斷上可能有很大的應(yīng)用價(jià)值，尤其在實(shí)現(xiàn)快速診斷和床邊診斷以后。

ifn-γ釋放實(shí)驗(yàn)(igras)是一種廣泛應(yīng)用的tb免疫診斷方法，在結(jié)核分支桿菌感染檢測上已經(jīng)被證明具有應(yīng)用價(jià)值，檢測效果比tst(tuberculinskintest)有顯著的優(yōu)勢。但是，igras和tst方法均不能區(qū)分結(jié)核潛伏性感染(ltbi)和活動(dòng)性結(jié)核；在高結(jié)核負(fù)擔(dān)國家因有很高比例潛伏感染人群，igras的應(yīng)用價(jià)值受到限制，其仍然只能作為一種輔助診斷手段。目前臨床普遍采用的結(jié)核診斷仍然主要依賴臨床癥狀、影像學(xué)診斷和病原學(xué)診斷。如果能夠在結(jié)核發(fā)病早期準(zhǔn)確快速確診并進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕?，對減輕結(jié)核病人的危害及結(jié)核傳染的控制將有重要價(jià)值。

因此，本領(lǐng)域需要簡單、方便、快速且具有高準(zhǔn)確性和特異性的活動(dòng)性結(jié)核診斷方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、生物化學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。

如本文中所使用的，術(shù)語“rv0183”或“rv0183蛋白”是指，天然存在于結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)中的一種蛋白，屬于單酰基甘油脂肪酶(monoacylglycerollipase，magl)或溶血磷脂酶(lysophospholipase)。rv0183蛋白的序列是本領(lǐng)域公知的，并且可參見各種公共數(shù)據(jù)庫(例如ncbi數(shù)據(jù)庫登錄號cp009480.1,air12906.1,ccp42909.1,np_214697.2，或wp_003401112.1)。

在本發(fā)明中，當(dāng)提及rv0183的氨基酸序列時(shí)，參照seqidno：1所示的序列來進(jìn)行描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，結(jié)核分枝桿菌既包括標(biāo)準(zhǔn)株h37rv，也可包括多種分離株，并且各種分離株的rv0183蛋白的氨基酸序列之間可能存在著差異。進(jìn)一步，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，盡管可能存在著序列差異，但是結(jié)核分枝桿菌的不同分離株的rv0183蛋白在氨基酸序列上具有極高的同一性，并且具有實(shí)質(zhì)上相同的生物學(xué)功能。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在rv0183蛋白的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“rv0183”不僅包括seqidno:1所示的蛋白，而且應(yīng)包括各種結(jié)核分枝桿菌分離株的rv0183蛋白(例如bal64025.1,aoe34503.1,ege52872.1，或cdm08372.1所示的rv0183蛋白)，以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述rv0183蛋白的序列片段時(shí)，其不僅包括seqidno：1的序列片段，還包括各種結(jié)核分枝桿菌分離株的rv0183蛋白中的相應(yīng)序列片段，以及seqidno：1的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。因此，表述“rv0183蛋白的第1-20位氨基酸殘基”包括，seqidno：1的第1-20位氨基酸殘基，以及各種結(jié)核分枝桿菌分離株的rv0183蛋白中的相應(yīng)片段，以及rv0183蛋白的變體(天然或人工)中的相應(yīng)片段。在本發(fā)明中，表述“相應(yīng)片段”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時(shí)，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。

在本發(fā)明中，術(shù)語“rv0183”或“rv0183蛋白”不受任何特定的合成蛋白的方法限制，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，例如dna重組技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)。

如本文中所使用的，術(shù)語“plcd”或“plcd蛋白”是指，天然存在于結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)中的一種蛋白，屬于磷脂酶c(phospholipasec)家族。plcd蛋白的序列是本領(lǐng)域公知的，參見例如andersenst,etal.，nature,1998.393(6685):537-44(其通過引用并入本文)，以及ncbi數(shù)據(jù)庫登錄號ccp44521.1。

在本發(fā)明中，當(dāng)提及plcd的氨基酸序列時(shí)，參照seqidno：3所示的序列來進(jìn)行描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，結(jié)核分枝桿菌既包括標(biāo)準(zhǔn)株h37rv，也可包括多種分離株，并且各種分離株的plcd蛋白的氨基酸序列之間可能存在著差異。進(jìn)一步，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，盡管可能存在著序列差異，但是結(jié)核分枝桿菌的不同分離株的plcd蛋白在氨基酸序列上具有極高的同一性，并且具有實(shí)質(zhì)上相同的生物學(xué)功能。同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在plcd蛋白的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包括但不限于，置換，缺失和/或添加)，而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“plcd”不僅包括seqidno:3所示的蛋白，而且應(yīng)包括各種結(jié)核分枝桿菌分離株的plcd蛋白，以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述plcd蛋白的序列片段時(shí)，其不僅包括seqidno：3的序列片段，還包括各種結(jié)核分枝桿菌分離株的plcd蛋白中的相應(yīng)序列片段，以及seqidno：3的天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。在本發(fā)明中，表述“相應(yīng)序列片段”是指，當(dāng)對序列進(jìn)行最優(yōu)比對時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比對以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時(shí)，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。

在本發(fā)明中，術(shù)語“plcd”或“plcd蛋白”不受任何特定的合成蛋白的方法限制，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，例如dna重組技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)。

如本文中所使用的，表述“rv0183或plcd的抗原性片段”是指，rv0183或plcd蛋白經(jīng)過截短后得到的氨基酸序列片段(即，多肽)，該片段具有與相應(yīng)的全長蛋白相同的生物學(xué)活性，即，可刺激活動(dòng)性結(jié)核患者的外周血產(chǎn)生il-6，從而區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者)。例如本發(fā)明中seqidno:5-25所示的氨基酸序列片段即為rv0183的抗原性片段。在本發(fā)明中，該抗原性片段不受任何特定的合成多肽的方法限制，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生，例如dna重組技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)。

在本發(fā)明中，rv0183、plcd或其抗原性片段(即，多肽)可以通過dna重組技術(shù)獲得，例如通過使用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)從編碼這些蛋白或多肽的多核苷酸獲得(無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括例如基于網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的表達(dá)系統(tǒng)、基于麥胚提取物的表達(dá)系統(tǒng)以及基于大腸桿菌提取物的表達(dá)系統(tǒng))；或通過使用體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)(例如，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母真核表達(dá)系統(tǒng))從編碼這些蛋白或多肽的多核苷酸獲得。作為另外一種選擇，rv0183、plcd或其抗原性片段(即，多肽)可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生。蛋白或多肽化學(xué)全合成的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的(參見，例如，raibautl,etal.,topcurrchem.2015；363:103-54；thapap,etal.molecules.2014；19(9):14461-83；dawsonpe,etal.,science,1994；266(5186):776-9；和wangp,etal.,tetrahedronlett,1998,39(47):88711-14；其通過引用并入本文)，并且包括但不限于：固相肽合成技術(shù)(solidphasepeptidesynthesis，spps)或液相分段合成技術(shù)(例如，天然化學(xué)連接法(nativechemicalligation，ncl)、疊氮法(azidemethod)、轉(zhuǎn)移活化酯法(transferactiveestercondensation，taec))。

如本文中所使用的，表述“分別具有如seqidno:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段”是指，具有seqidno:13所示的氨基酸序列的抗原性片段、具有seqidno:14所示的氨基酸序列的抗原性片段、和具有seqidno:19所示的氨基酸序列的抗原性片段的組合。其他類似的表述具有類似的含義。

如本文中所使用的，術(shù)語“能夠檢測il-6的試劑”是指，能夠和il-6特異性結(jié)合的物質(zhì)。這類物質(zhì)是本領(lǐng)域所公知的，或者可以利用本領(lǐng)域公知的方法制備得到，例如為抗體、靶向多肽或核酸適體等。通常而言，特別優(yōu)選的是，此類試劑能夠通過免疫學(xué)檢測來確定樣品中il-6的水平。免疫學(xué)檢測的使用是特別有利的，因?yàn)槠淅昧丝乖?抗體之間的特異性相互作用/結(jié)合親和力。因此，只要試劑保留了與il-6特異性結(jié)合的反應(yīng)性，那么該試劑即可以通過免疫學(xué)檢測來確定樣品中il-6的水平(也即，該試劑即可用作能夠檢測il-6的試劑)。保留與il-6特異性結(jié)合的反應(yīng)性的各種試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到并且可容易獲得的，其包括但不限于，抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段，例如抗il-6的多克隆抗體或單克隆抗體，例如igg抗體或igm抗體。作為另一種選擇，所述能夠檢測il-6的試劑也可以為結(jié)合il-6的核酸適體，其包括但不限于描述于pct國際申請wo2014159669中以及“guptas,etal.,jbiolchem.2014；289(12):8706-19”中的核酸適體，其全部通過引用并入本文。

如本文中所使用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指，兩分子(即結(jié)合分子與靶分子)之間的非隨機(jī)的結(jié)合反應(yīng)，如抗體和其所針對的抗原之間的反應(yīng)。兩分子之間的結(jié)合親和力可用kd值描述。kd值是指由kd(特定的結(jié)合分子-靶分子相互作用的解離速率；亦稱為koff)與ka(特定結(jié)合分子-靶分子相互作用的締合速率；亦稱為kon)之比得到的解離常數(shù)，或者指表示為摩爾濃度(m)的kd/ka。kd值越小，兩分子結(jié)合越緊密，親和力越高。在某些實(shí)施方式中，特異性結(jié)合某抗原的抗體(或?qū)δ晨乖哂刑禺愋缘目贵w)是指，抗體以小于大約10^-5m，例如小于大約10^-6m、10^-7m、10^-8m、10^-9m或10^-10m或更小的親和力(kd)結(jié)合該抗原。kd值可通過本領(lǐng)域熟知的方法確定，例如使用表面等離子體共振術(shù)(spr)在biacore儀中測定。

如本文中所使用的，術(shù)語“免疫學(xué)檢測”是指，利用抗原-抗體之間的特異性相互作用/結(jié)合親和力來進(jìn)行的測定，其一般可用于檢測特定抗原或者抗體在樣品中的存在或水平。此類免疫學(xué)測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于，elisa檢測，elispot檢測，western印跡，表面等離子共振法等。關(guān)于免疫學(xué)測定的詳細(xì)描述，可參見例如，fundamentalimmunology,ch.7paul,w.,ed.，第2版，ravenpress,n.y.(1989)。

如本文中所使用的，術(shù)語“抗體”是指，通常由兩對多肽鏈(每對具有一條“輕”(l)鏈和一條“重”(h)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈還包含大約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“d”區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(vl)和輕鏈恒定區(qū)(cl)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)的結(jié)合。vh和vl區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的區(qū)域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)cdr和4個(gè)fr組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(qū)(vh和vl)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991))，或chothia&lesk(1987)j.mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:878-883的定義。術(shù)語“抗體”不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亞型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗體。

如本文中所使用的，抗體的“抗原結(jié)合片段”是指，全長抗體的一個(gè)或多個(gè)部分，所述部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原(例如，il-6)的能力，與完整抗體競爭對抗原的特異性結(jié)合。通常參見，fundamentalimmunology,ch.7paul,w.,ed.，第2版，ravenpress,n.y.(1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的?？赏ㄟ^重組dna技術(shù)或通過完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合片段。在一些情況下，抗原結(jié)合片段包括fab、fab'、f(ab')2、fd、fv、dab和互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)片段、單鏈抗體(例如，scfv)、嵌合抗體、雙抗體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性結(jié)合抗原能力的抗體的至少一部分。

如本文中所使用的，術(shù)語“核酸適體(aptamer)”是指，能夠高親和性和高特異性地結(jié)合目的靶蛋白或其它生物靶分子的單鏈寡核苷酸，其可折疊形成例如莖環(huán)(stem-loop)、發(fā)夾(hairpin)、假結(jié)(pseudoknot)或g-四聚體(g-tetramer)的熱力學(xué)穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，通過例如結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、堿基堆積力、范德華力、氫鍵或靜電作用與目的靶蛋白或其它生物靶分子特異性結(jié)合。核酸適體可以為dna或rna，也可以包含核酸類似物(例如鎖核酸(lna)、肽核酸(pna)、二醇核酸(gna)或蘇糖核酸(tna))。獲得結(jié)合特定靶蛋白的核酸適體的方法是本領(lǐng)域公知的，例如selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)篩選技術(shù)。

如本文中所使用的，術(shù)語“靶向多肽”是指，可以特異性結(jié)合目的靶蛋白的多肽分子。在本發(fā)明中，該靶向多肽可包含天然氨基酸、合成的氨基酸或采用與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸模擬物(mimetics)。天然存在的氨基酸為通過遺傳密碼來編碼的那些以及后來修飾的那些氨基酸，例如，羥基脯氨酸、γ-羥基谷氨酸鹽、o-磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸或磷酸酪氨酸。在本發(fā)明中，可基于親和力來確定靶向多肽與其目的靶蛋白之間的“特異性”，該親和力可用靶向多肽與其所結(jié)合的目的靶蛋白的解離平衡常數(shù)(即，kd值)進(jìn)行描述。kd值越低，靶向多肽與其所結(jié)合的目的靶蛋白之間的結(jié)合強(qiáng)度越強(qiáng)。在本領(lǐng)域中通常已知，大于約10^-3m的kd值通常被認(rèn)為表示非結(jié)合或非特異性結(jié)合。取決于具體的目的靶蛋白，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法獲得特異性結(jié)合該靶蛋白的靶向多肽，例如通過噬菌體展示技術(shù)或蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)進(jìn)行篩選。

如本文中所使用的，術(shù)語“可檢測的標(biāo)記”是指，可通過熒光、光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、電學(xué)、光學(xué)或化學(xué)手段檢測的任何組合物。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的是，此類標(biāo)記能夠適用于免疫學(xué)檢測(例如，酶聯(lián)免疫測定法、放射免疫測定法、熒光免疫測定法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法等)。這類標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，³h、¹²⁵i、³⁵s、¹⁴c或³²p)、熒光染料(例如，異硫氰酸熒光素(fitc)、熒光素、異硫氰酸四甲基羅丹明(tritc)、藻紅蛋白(pe)、德克薩斯紅、羅丹明、量子點(diǎn)或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、吖啶酯類化合物、磁珠(例如，)、測熱標(biāo)記物例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等)珠、以及用于結(jié)合上述標(biāo)記物修飾的親和素(例如，鏈霉親和素)的生物素。教導(dǎo)該標(biāo)記物的使用的專利包括，但不限于，美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241(全部通過引用并入本文)。本發(fā)明中涵蓋的標(biāo)記物可通過本領(lǐng)域已知的方法檢測。例如，放射性標(biāo)記可使用攝影膠片或閃爍計(jì)算器檢測，熒光標(biāo)記物可使用光檢測器檢測，以檢測發(fā)射的光。酶標(biāo)記物一般通過給酶提供底物及檢測通過酶對底物的作用產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物來檢測，及測熱標(biāo)記物通過簡單可視化著色標(biāo)記物來檢測。

如本文中所使用的，術(shù)語“特異性刺激原”是指，能夠僅刺激活動(dòng)性結(jié)核患者的pbmc產(chǎn)生il-6，而不能刺激非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者(igra檢測陰性))的pbmc產(chǎn)生il-6的物質(zhì)；或者是指這樣的物質(zhì)，其刺激活動(dòng)性結(jié)核患者的pbmc產(chǎn)生的il-6分泌量顯著高于非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者(igra檢測陰性))。本發(fā)明的特異性刺激原包括rv0183、plcd或其抗原性片段。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述特異性刺激原不含有或幾乎不含有內(nèi)毒素。去除上述特異性刺激原中的內(nèi)毒素的方法為本領(lǐng)域所公知，例如離子交換層析法、親和層析法或萃取法。

如本文中所使用的，術(shù)語“非特異性刺激源”是指，能夠激活多數(shù)或全部淋巴細(xì)胞，而不受tcr或bcr特異性限制的物質(zhì)。淋巴細(xì)胞活化后，可大量分泌細(xì)胞因子(例如，il-6)?？捎米鞣翘禺愋源碳ぴ吹奈镔|(zhì)是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于有絲分裂原，植物血凝素(pha)、刀豆蛋白a(cona)、商陸絲裂原(pwm)、脂多糖(lps)或葡萄球菌蛋白a(spa)。在某些實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原可包含在培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基和dmem培養(yǎng)基)中。

如本文中所使用的，術(shù)語“統(tǒng)計(jì)分析值”是指，對通過各種檢測方法得到的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后得到的值。各種統(tǒng)計(jì)分析方法是本領(lǐng)域公知的(參見，例如pct國際申請wo2009064901)，并且包括但不限于檢測結(jié)果的線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。通常而言，特別優(yōu)選的是，所述統(tǒng)計(jì)分析值為通過logistic回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到的值。logistic回歸模型具體描述于例如“胡春艷.四種腫瘤標(biāo)志物在卵巢癌血清中的聯(lián)合檢測[d].廣州：中山大學(xué),2008：1-39”。

如本文中所使用的，術(shù)語“參考值”(也稱為最佳診斷界值)是指能夠反映非活動(dòng)性結(jié)核人群的狀況的值。在本發(fā)明中，參考值包括例如，根據(jù)特異性刺激原刺激前后非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者(igra檢測陰性)樣品中的il-6水平的差值，所確定的一個(gè)正常數(shù)值或數(shù)值范圍；以及，對從非活動(dòng)性結(jié)核人群的樣品獲得的檢測值(例如，前文所述的il-6水平的差值)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析而得到的值(統(tǒng)計(jì)分析值)。確定最佳診斷界值的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于受試者工作特征曲線分析(receiveroperatingcharacteristic(roc)curveanalysis)，其詳細(xì)描述于例如“habibzadehf,etal.,biochemmed(zagreb).2016；26(3):297-307”和“陳衛(wèi)中等.roc曲線中最佳工作點(diǎn)的選擇[j].中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì),2006,23:157-158”。

如本文中所使用的，術(shù)語“外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)”是指，外周血中具有單個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞的總稱，包括但不限于淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞、b細(xì)胞、nk細(xì)胞)、單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞。從外周血中獲得pbmc的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于ficoll分層液法或percoll分層液法。

如本文中所使用的，術(shù)語“外周血白膜層”是指，外周抗凝血經(jīng)過自然沉降、離心或密度梯度離心后形成的一個(gè)組分，主要由白細(xì)胞(包括外周血單個(gè)核細(xì)胞)和血小板組成?？鼓?jīng)過離心以后會形成上層的血漿、下層的紅細(xì)胞以及二者之間薄薄的一層白色膜狀物，約占血液總體積的1％，被稱為白膜層。

如本文中所使用的，術(shù)語“受試者”包括但不限于各種動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人。

如本文中所使用的，術(shù)語“抗凝劑”是指，能夠阻止血液凝固的試劑或物質(zhì)，這類物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于肝素、edta、草酸鹽(例如，草酸鈉、草酸鉀、草酸銨)、枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)。

在本發(fā)明中，術(shù)語“稀釋液”優(yōu)選為能夠維持細(xì)胞滲透壓的電解質(zhì)溶液，必要時(shí)該溶液也具備保持生理ph值的作用。這類溶液是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于阿氏液(alsever'ssolution)、earle's平衡鹽溶液(ebss)、gey's平衡鹽溶液(gbss)、hanks'平衡鹽溶液(hbss)、磷酸鹽緩沖液(pbs)、杜氏磷酸鹽緩沖液(dpbs)、puck's平衡鹽溶液、ringer's平衡鹽溶液(rbss)、simm's平衡鹽溶液(sbss)、tris緩沖液(tbs)、tyrode's平衡鹽溶液(tbss)、生理鹽水或林格氏液(ringer'ssolution)。

如本文中所使用的，術(shù)語“培養(yǎng)液”或“培養(yǎng)基”是指，能夠維持細(xì)胞活性的養(yǎng)料。通常所述養(yǎng)料含有氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽等。這類養(yǎng)料是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，在來自所述受試者的樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基的目的是為了在刺激原刺激的過程中維持樣品中的細(xì)胞特別是pbmc的活性。維持血液成分中細(xì)胞的活性的方法為本領(lǐng)域所公知，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)樣品為全血時(shí)，可以加入培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液例如為在磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中添加適量的葡萄糖、氯化鈉和氯化鉀等；在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)液為在磷酸鹽緩沖液中添加適量的葡萄糖和氯化鉀。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)樣品為外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、外周血白膜層或其它含有pbmc的血液成分時(shí)，可以加入培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如適合維持血細(xì)胞特別是pbmc活性的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基。

如本文中所使用的，術(shù)語“活動(dòng)性結(jié)核”是指，結(jié)核病灶處于活動(dòng)期，例如痰涂片陽性，或者同時(shí)伴有相關(guān)癥狀，如低熱、咳嗽、消瘦、乏力、食欲差等。在本發(fā)明中，結(jié)核包括肺結(jié)核和肺外結(jié)核，所述肺外結(jié)核例如包括淋巴結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎、結(jié)核性腹膜炎、腸結(jié)核、腎結(jié)核、附睪結(jié)核、女性生殖系統(tǒng)結(jié)核(包括輸卵管、子宮內(nèi)膜、卵巢結(jié)核)和骨關(guān)節(jié)結(jié)核等。

本申請的發(fā)明人篩選了大量結(jié)核分枝桿菌rd區(qū)抗原，出人意料地發(fā)現(xiàn)，rv0183、plcd或其抗原性片段可刺激活動(dòng)性結(jié)核患者的外周血產(chǎn)生大量il-6，從而區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者)。而在本申請之前，本領(lǐng)域中常用的igras和tst方法均不能區(qū)分潛伏性結(jié)核感染(ltbi)和活動(dòng)性結(jié)核?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人開發(fā)了新的診斷活動(dòng)性結(jié)核的方法。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包括rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種，和能夠檢測il-6的試劑。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含rv0183和/或plcd。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含一種或多種rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含分別具有如seqidno:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任選地，所述試劑盒還包括下列抗原性片段的組合：

1)分別具有如seqidno:5、11、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:7-8、11-12所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，或

4)分別具有如seqidno:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述能夠檢測il-6的試劑為能夠和il-6特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如抗體、靶向多肽或核酸適體。

任選地，所述試劑還帶有可檢測的標(biāo)記。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包括抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過elisa來測定il-6的水平。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含一種或多種選自1)-5)的裝置或試劑：

1)采血裝置，例如無熱原真空采血管；

2)抗凝劑，例如肝素；

3)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；

4)非特異性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白a；

5)稀釋液，例如磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒用于診斷活動(dòng)性結(jié)核、判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果或篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性刺激原在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于診斷活動(dòng)性結(jié)核；其中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其組合。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自一種或多種rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任選地，所述特異性刺激原還包括下列抗原性片段的組合：

1)分別具有如seqidno:5、11、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:7-8、11-12所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，或

4)分別具有如seqidno:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括能夠檢測il-6的試劑，例如能夠和il-6特異性結(jié)合的抗體、靶向多肽或核酸適體。

任選地，所述試劑還帶有可檢測的標(biāo)記。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包括抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過elisa來測定il-6的水平。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含一種或多種選自1)-5)的裝置或試劑：

1)采血裝置，例如無熱原真空采血管；

2)抗凝劑，例如肝素；

3)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；

4)非特異性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白a；

5)稀釋液，例如磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒通過包括下述步驟的方法來診斷所述受試者是否患有活動(dòng)性結(jié)核：

(1)使用特異性刺激原刺激來自所述受試者的至少一份樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述受試者的未經(jīng)刺激的樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(2)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(1)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值；和

(3)將所述差值與參考值進(jìn)行比較，或?qū)λ霾钪颠M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得統(tǒng)計(jì)分析值，并將該統(tǒng)計(jì)分析值與參考值進(jìn)行比較，并判斷所述受試者是否患有活動(dòng)性結(jié)核；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)該差值或由該差值得到的統(tǒng)計(jì)分析值大于參考值時(shí)，表明提供該樣品的受試者患有活動(dòng)性結(jié)核；當(dāng)該差值或由該差值得到的統(tǒng)計(jì)分析值不大于參考值時(shí)，表明提供該樣品的受試者未患有活動(dòng)性結(jié)核。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，使用logistic回歸模型對所述差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，使用至少兩種特異性刺激原共同或分別刺激一份或多份來自所述受試者的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，使用rv0183和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品?；颍谀承﹥?yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，使用一種或多種rv0183的抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(1)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)之前，所述方法還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)使用采血裝置從所述受試者獲得樣品；(b)使用抗凝劑處理采血裝置或來自所述受試者的樣品；(c)使用培養(yǎng)液或培養(yǎng)基處理來自所述受試者的樣品；和，(d)使用稀釋液稀釋來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，用刺激原刺激來自所述受試者的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性刺激原在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果；其中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其組合。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自一種或多種rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任選地，所述特異性刺激原還包括下列抗原性片段的組合：

1)分別具有如seqidno:5、11、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:7-8、11-12所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，或

4)分別具有如seqidno:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括能夠檢測il-6的試劑，例如能夠和il-6特異性結(jié)合的抗體、靶向多肽或核酸適體。

任選地，所述試劑還帶有可檢測的標(biāo)記。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包括抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過elisa來測定il-6的水平。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含一種或多種選自1)-5)的裝置或試劑：

1)采血裝置，例如無熱原真空采血管；

2)抗凝劑，例如肝素；

3)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；

4)非特異性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白a；

5)稀釋液，例如磷酸鹽緩沖液或生理鹽水；

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒通過包括下述步驟的方法來判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果：

(1)在對受試者進(jìn)行所述療法之前，獲得來自所述受試者的至少兩份樣品，作為治療前樣品；

(2)使用特異性刺激原刺激來自所述受試者的至少一份治療前樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述受試者的未經(jīng)刺激的至少一份治療前樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(3)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(2)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第一差值；

(4)對所述受試者進(jìn)行所述療法；

(5)在對所述受試者進(jìn)行所述療法之后，獲得來自所述受試者的至少兩份樣品，作為治療后樣品；

(6)使用特異性刺激原刺激來自所述受試者的至少一份治療后樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述受試者的未經(jīng)刺激的至少一份治療后樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(7)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(6)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第二差值；和

(8)將所述第二差值與第一差值進(jìn)行比較，或?qū)λ龅谝徊钪岛偷诙钪捣謩e進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值和第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值，并將所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值與所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值進(jìn)行比較，并判斷所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療是否有效；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述第二差值大于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值大于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療無效；當(dāng)所述第二差值小于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值小于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療有效。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，使用logistic回歸模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，對治療前樣品和治療后樣品進(jìn)行相同的處理(例如，在相同的條件下，使用相同的特異性刺激原進(jìn)行處理)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用至少兩種特異性刺激原共同或分別刺激一份或多份來自所述受試者的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用rv0183、和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品。或，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用一種或多種rv0183的抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如人。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述療法包括對受試者施用抗結(jié)核藥物，例如異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)和(6)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，使用采血裝置獲得來自所述受試者的治療前樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(5)中，使用采血裝置獲得來自所述受試者的治療后樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(1)之前，所述方法還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)使用抗凝劑處理采血裝置或來自所述受試者的樣品；(b)使用培養(yǎng)液或培養(yǎng)基處理來自所述受試者的樣品；和，(c)使用稀釋液稀釋來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(5)之前，所述方法還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)使用抗凝劑處理采血裝置或來自所述受試者的樣品；(b)使用培養(yǎng)液或培養(yǎng)基處理來自所述受試者的樣品；和，(c)使用稀釋液稀釋來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用刺激原刺激來自所述受試者的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了特異性刺激原在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物；其中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或多種。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其組合。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原選自一種或多種rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:13、14和19所示的氨基酸序列的抗原性片段。

任選地，所述特異性刺激原還包括下列抗原性片段的組合:

1)分別具有如seqidno:5、11、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:7-8、11-12所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，或

4)分別具有如seqidno:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述特異性刺激原包含分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括能夠檢測il-6的試劑，例如能夠和il-6特異性結(jié)合的抗體、靶向多肽或核酸適體。

任選地，所述試劑還帶有可檢測的標(biāo)記。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑包括抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑通過elisa來測定il-6的水平。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含一種或多種選自1)-5)的裝置或試劑：

1)采血裝置，例如無熱原真空采血管；

2)抗凝劑，例如肝素；

3)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；

4)非特異性刺激原，例如植物凝集素或刀豆球蛋白a；

5)稀釋液，例如磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒通過包括下述步驟的方法來篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物：

(1)在給模型動(dòng)物施用候選藥物之前，獲得來自所述動(dòng)物的至少兩份樣品，作為治療前樣品；

(2)使用特異性刺激原刺激來自所述動(dòng)物的至少一份治療前樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述動(dòng)物的未經(jīng)刺激的至少一份治療前樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(3)使用檢測il-6的試劑測定步驟(2)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第一差值；

(4)給所述動(dòng)物施用候選藥物；

(5)在給所述動(dòng)物施用所述候選藥物之后，獲得來自所述動(dòng)物的至少兩份樣品，作為治療后樣品；

(6)使用特異性刺激原刺激來自所述動(dòng)物的至少一份治療后樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述動(dòng)物的未經(jīng)刺激的至少一份治療后樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(7)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(6)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第二差值；和

(8)將所述第二差值與第一差值進(jìn)行比較，或?qū)λ龅谝徊钪岛偷诙钪捣謩e進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值和第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值，并將所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值與所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值進(jìn)行比較，并判斷所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療是否有效；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述第二差值大于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值大于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明被篩選的藥物對治療活動(dòng)性結(jié)核無效；當(dāng)所述第二差值小于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值小于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明被篩選的藥物對活動(dòng)性結(jié)核的治療有效。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，使用logistic回歸模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，對治療前樣品和治療后樣品進(jìn)行相同的處理(例如，在相同的條件下，使用相同的特異性刺激原進(jìn)行處理)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用至少兩種特異性刺激原分別或共同刺激一份或多份來自所述動(dòng)物的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用rv0183、和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品?；?，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用一種或多種rv0183的抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述模型動(dòng)物是非人哺乳動(dòng)物，例如小鼠、豚鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物(例如食蟹猴或獼猴)。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如人。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述動(dòng)物的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)和(6)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述動(dòng)物的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，使用采血裝置獲得來自所述動(dòng)物的治療前樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(5)中，使用采血裝置獲得來自所述動(dòng)物的治療后樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(1)之前，所述方法還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)使用抗凝劑處理采血裝置或來自所述動(dòng)物的樣品；(b)使用培養(yǎng)液或培養(yǎng)基處理來自所述動(dòng)物的樣品；和，(c)使用稀釋液稀釋來自所述動(dòng)物的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在進(jìn)行步驟(5)之前，所述方法還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)使用抗凝劑處理采血裝置或來自所述動(dòng)物的樣品；(b)使用培養(yǎng)液或培養(yǎng)基處理來自所述動(dòng)物的樣品；和，(c)使用稀釋液稀釋來自所述動(dòng)物的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述動(dòng)物的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用刺激原刺激來自所述動(dòng)物的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于診斷受試者是否患有活動(dòng)性結(jié)核的方法，其包括下述步驟：

(1)提供來自所述受試者的至少兩份樣品；

(2)使用特異性刺激原刺激至少一份樣品作為待測樣品，并將未經(jīng)刺激的樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或多種；

(3)測定步驟(2)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值；和

(4)將所述差值與參考值進(jìn)行比較，或?qū)λ霾钪颠M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得統(tǒng)計(jì)分析值，并將該統(tǒng)計(jì)分析值與參考值進(jìn)行比較，并判斷所述受試者是否患有活動(dòng)性結(jié)核；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)該差值或由該差值得到的統(tǒng)計(jì)分析值大于參考值時(shí)，表明提供該樣品的受試者患有活動(dòng)性結(jié)核；當(dāng)該差值或由該差值得到的統(tǒng)計(jì)分析值不大于參考值時(shí)，表明提供該樣品的受試者未患有活動(dòng)性結(jié)核。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中，使用logistic回歸模型對所述差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段為rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如人。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，使用至少兩種特異性刺激原共同或分別刺激一份或多份來自所述受試者的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，使用rv0183、和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品。或，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，使用一種或多種抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，使用下列抗原性片段的組合共同刺激至少一份樣品作為待測樣品：

1)分別具有如seqidno:13、14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:5、11、13-14、19、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:7-8、11-14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

4)分別具有如seqidno:5-7、11-14、19、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，

5)分別具有如seqidno:5、8-10、12-15、19、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；或

6)分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，使用抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段來檢測il-6的水平，例如通過elisa來進(jìn)行測定。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)之前，還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)從所述受試者獲得樣品；(b)向樣品中加入抗凝劑，例如肝素；(c)從樣品中獲取pbmc或含有pbmc的血液成分(例如，外周血白膜層)；(d)向樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；(e)稀釋樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，用刺激原刺激來自所述受試者的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果的方法，其包括下述步驟：

(1)在對受試者進(jìn)行所述療法之前，獲得來自所述受試者的至少兩份樣品，作為治療前樣品；

(2)使用特異性刺激原刺激來自所述受試者的至少一份治療前樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述受試者的未經(jīng)刺激的至少一份治療前樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(3)測定步驟(2)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第一差值；

(4)對所述受試者進(jìn)行所述療法；

(5)在對所述受試者進(jìn)行所述療法之后，獲得來自所述受試者的至少兩份樣品，作為治療后樣品；

(6)使用特異性刺激原刺激來自所述受試者的至少一份治療后樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述受試者的未經(jīng)刺激的至少一份治療后樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(7)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(6)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第二差值；和

(8)將所述第二差值與第一差值進(jìn)行比較，或?qū)λ龅谝徊钪岛偷诙钪捣謩e進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值和第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值，并將所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值與所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值進(jìn)行比較，并判斷所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療是否有效；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述第二差值大于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值大于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療無效；當(dāng)所述第二差值小于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值小于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療有效。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，使用logistic回歸模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段為rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如人。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述療法包括對受試者施用抗結(jié)核藥物，例如異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇或其任何組合。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，對治療前樣品和治療后樣品進(jìn)行相同的處理(例如，在相同的條件下，使用相同的特異性刺激原進(jìn)行處理)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用至少兩種特異性刺激原共同或分別刺激一份或多份來自所述受試者的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用rv0183、和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品。或，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用一種或多種抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用下列抗原性片段的組合共同刺激至少一份樣品作為待測樣品：

1)分別具有如seqidno:13、14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:5、11、13-14、19、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:7-8、11-14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

4)分別具有如seqidno:5-7、11-14、19、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，

5)分別具有如seqidno:5、8-10、12-15、19、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；或

6)分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述受試者的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，使用抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段來檢測il-6的水平，例如通過elisa來進(jìn)行測定。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)和(6)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)之前，還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)向治療前樣品中加入抗凝劑，例如肝素；(b)從治療前樣品中獲取pbmc或含有pbmc的血液成分(例如，外周血白膜層)；(c)向治療前樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；和，(d)稀釋治療前樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(5)之前，還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)向治療后樣品中加入抗凝劑，例如肝素；(b)從治療后樣品中獲取pbmc或含有pbmc的血液成分(例如，外周血白膜層)；(c)向治療后樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；和，(d)稀釋治療后樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述受試者的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用刺激原刺激來自所述受試者的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物的方法，其包括下述步驟：

(1)在給模型動(dòng)物施用候選藥物之前，獲得來自所述動(dòng)物的至少兩份樣品，作為治療前樣品；

(2)使用特異性刺激原刺激來自所述動(dòng)物的至少一份治療前樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述動(dòng)物的未經(jīng)刺激的至少一份治療前樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(3)測定步驟(2)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第一差值；

(4)給所述動(dòng)物施用候選藥物；

(5)在給所述動(dòng)物施用所述候選藥物之后，獲得來自所述動(dòng)物的至少兩份樣品，作為治療后樣品；

(6)使用特異性刺激原刺激來自所述動(dòng)物的至少一份治療后樣品作為待測樣品，同時(shí)將來自所述動(dòng)物的未經(jīng)刺激的至少一份治療后樣品作為陰性對照樣品，其中所述特異性刺激原選自rv0183、plcd或其抗原性片段中的一種或數(shù)種；

(7)使用能夠檢測il-6的試劑測定步驟(6)中各個(gè)樣品的il-6水平，并計(jì)算所述待測樣品與陰性對照樣品的il-6水平的差值，作為第二差值；和

(8)將所述第二差值與第一差值進(jìn)行比較，或?qū)λ龅谝徊钪岛偷诙钪捣謩e進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以獲得第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值和第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值，并將所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值與所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值進(jìn)行比較，并判斷所述療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療是否有效；

其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)所述第二差值大于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值大于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明被篩選的藥物對治療活動(dòng)性結(jié)核無效；當(dāng)所述第二差值小于所述第一差值時(shí)，或當(dāng)所述第二差值的統(tǒng)計(jì)分析值小于所述第一差值的統(tǒng)計(jì)分析值時(shí)，表明被篩選的藥物對活動(dòng)性結(jié)核的治療有效。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，利用選自下列的統(tǒng)計(jì)模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：線性組合、線性回歸模型、logistic回歸模型、線性判別分析(lda)模型、最近鄰模型或微陣列預(yù)測分析(pam)。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(8)中，使用logistic回歸模型對所述第一差值和第二差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述rv0183具有如seqidno:1所示的氨基酸序列；和/或，所述plcd具有如seqidno:3所示的氨基酸序列。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段為rv0183的抗原性片段。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原性片段具有選自下列的氨基酸序列：seqidno:5-25。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述模型動(dòng)物是非人哺乳動(dòng)物，例如小鼠、豚鼠、兔或非人靈長類動(dòng)物(例如食蟹猴或獼猴)。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如人。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，對治療前樣品和治療后樣品進(jìn)行相同的處理(例如，在相同的條件下，使用相同的特異性刺激原進(jìn)行處理)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用至少兩種特異性刺激原共同或分別刺激一份或多份來自所述動(dòng)物的樣品作為待測樣品，其中所述特異性刺激原各自獨(dú)立地選自rv0183、plcd或其抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用rv0183、和plcd分別刺激至少兩份樣品作為待測樣品?；?，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用一種或多種抗原性片段共同刺激至少一份樣品作為待測樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，使用下列抗原性片段的組合共同刺激至少一份樣品作為待測樣品：

1)分別具有如seqidno:13、14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

2)分別具有如seqidno:5、11、13-14、19、22所示的氨基酸序列的抗原性片段，

3)分別具有如seqidno:7-8、11-14、19所示的氨基酸序列的抗原性片段，

4)分別具有如seqidno:5-7、11-14、19、22、24所示的氨基酸序列的抗原性片段，

5)分別具有如seqidno:5、8-10、12-15、19、22-25所示的氨基酸序列的抗原性片段；或

6)分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，將所述特異性刺激原置于培養(yǎng)基，例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基，然后用于刺激來自所述動(dòng)物的樣品，以產(chǎn)生待測樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用不含有所述特異性刺激原和非特異性刺激原的培養(yǎng)基(例如細(xì)胞培養(yǎng)基，例如rpmi-1640培養(yǎng)基或dmem培養(yǎng)基)溫育或稀釋來自所述動(dòng)物的樣品，以產(chǎn)生陰性對照樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，通過免疫學(xué)檢測來測定所述樣品中il-6的水平。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫學(xué)檢測選自elisa檢測、elispot檢測、western印跡或表面等離子共振法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，使用抗il-6的抗體或其抗原結(jié)合片段來檢測il-6的水平，例如通過elisa來進(jìn)行測定。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗il-6的抗體為igg抗體或igm抗體。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(2)和(6)還包括使用非特異性刺激原刺激至少一份樣品作為陽性對照樣品。進(jìn)一步，在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非特異性刺激原包括植物凝集素或刀豆球蛋白a。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)之前，還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)向治療前樣品中加入抗凝劑，例如肝素；(b)從治療前樣品中獲取pbmc或含有pbmc的血液成分(例如，外周血白膜層)；(c)向治療前樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；和，(d)稀釋治療前樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(5)之前，還包括下列步驟中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：(a)向治療后樣品中加入抗凝劑，例如肝素；(b)從治療后樣品中獲取pbmc或含有pbmc的血液成分(例如，外周血白膜層)；(c)向治療后樣品中加入培養(yǎng)液或培養(yǎng)基；和，(d)稀釋治療后樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，在細(xì)胞(例如，pbmc)活性較高的溫度下(例如在36-38℃，例如在37℃左右)使用刺激原刺激來自所述動(dòng)物的樣品。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)和(6)中，用刺激原刺激來自所述動(dòng)物的樣品不少于12h，例如15-24h，例如20-24h。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種多肽庫，其包括：

第一肽，其具有如seqidno:13所示的氨基酸序列；

第二肽，其具有如seqidno:14所示的氨基酸序列；和

第三肽，其具有如seqidno:19所示的氨基酸序列。

任選地，所述多肽庫還包括下列多肽的組合：

1)分別具有如seqidno:5、11、22所示的氨基酸序列的多肽，

2)分別具有如seqidno:7-8、11-12所示的氨基酸序列的多肽，

3)分別具有如seqidno:5-7、11-12、22、24所示的氨基酸序列的多肽，或

4)分別具有如seqidno:5、8-10、12、15、22-25所示的氨基酸序列的多肽。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽庫包含分別具有如seqidno:5-25所示的氨基酸序列的抗原性片段。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽庫能夠誘導(dǎo)樣品產(chǎn)生il-6；其中，所述樣品包含外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)，例如全血(例如抗凝全血)、外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)、或外周血白膜層，并且可任選地包含其他組分，例如抗凝劑、稀釋液等。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽庫用于診斷活動(dòng)性結(jié)核、判斷一種療法對活動(dòng)性結(jié)核的治療效果或篩選能夠治療活動(dòng)性結(jié)核的候選藥物。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)和反復(fù)摸索發(fā)現(xiàn)了特異性刺激原(rv0183、plcd或其抗原性片段)可刺激活動(dòng)性結(jié)核患者的外周血產(chǎn)生大量il-6，從而區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和非活動(dòng)性結(jié)核人群(例如，潛伏性結(jié)核感染者、陳舊性結(jié)核患者或非結(jié)核感染者)，由此建立了一種簡單、方便、快速且具有高準(zhǔn)確性和特異性的活動(dòng)性結(jié)核診斷方法。

在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過采集全血，并添加特異性刺激原，然后在適當(dāng)條件下培養(yǎng)，即可完成對來自所述受試者樣品的刺激；對實(shí)驗(yàn)條件、人員的技術(shù)能力、設(shè)備和環(huán)境的要求不高；與傳統(tǒng)的結(jié)核診斷手段(如菌培、痰涂、x光檢測等)相比，對活動(dòng)性結(jié)核病人的檢出具有較高的靈敏度和特異性，而且大大縮短了診斷所需的時(shí)間；成本不高，使用范圍較廣。

下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得顯然。

附圖說明

圖1顯示了sds-page分析的結(jié)果，其顯示大腸桿菌(e.coil)er2566中高效表達(dá)后經(jīng)ni-nta和deae柱兩步純化的重組抗原rv0183。其中，泳道1代表蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2代表經(jīng)兩步純化后的蛋白rv0183。

圖2顯示了sds-page分析的結(jié)果，其顯示大腸桿菌(e.coil)er2566中高效表達(dá)后經(jīng)ni-nta純化和包涵體復(fù)性后的重組抗原plcd。其中，泳道m(xù)代表蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1代表變性后包涵體，泳道2代表經(jīng)親和柱層析后的蛋白plcd，泳道4代表透析復(fù)性后的蛋白plcd。

圖3顯示了使用重組抗原rv0183刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。1μg重組抗原rv0183刺激500μl全血20±2h后，血漿標(biāo)本2倍稀釋。結(jié)果顯示活動(dòng)性結(jié)核病人il-6分泌水平顯著高于潛伏感染人群。(注：***表示p<0.001)

圖4顯示了使用重組抗原rv0183刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。2μg重組抗原rv0183刺激1ml全血20±2h后，血漿標(biāo)本5倍稀釋。結(jié)果顯示，活動(dòng)性結(jié)核病人(atb)的il-6分泌水平顯著高于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群(ltbi(igra+體檢))和非感染人群(igra-體檢)。(注：***表示p<0.001)

圖5顯示了使用重組抗原rv0183刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。2μg重組抗原rv0183刺激1ml全血20±2h后，血漿標(biāo)本5倍稀釋。結(jié)果顯示，臨床活動(dòng)性結(jié)核病人il-6分泌水平顯著高于非結(jié)核分枝桿菌感染者。(注：***表示p<0.001)

圖6顯示了使用rv0183的抗原性片段刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。結(jié)果顯示，rv0183的21條抗原性片段，均能在體外刺激活動(dòng)性結(jié)核病人全血中il-6分泌水平的升高，而在健康對照中，基本無il-6應(yīng)答，綠色到紅色表示反應(yīng)強(qiáng)度增加。

圖7a-7b分別顯示了使用重組抗原rv0183和重組抗原plcd分別刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。2μg重組抗原rv0183和2μg重組抗原plcd分別刺激1ml全血20±2h后，血漿標(biāo)本5倍稀釋。結(jié)果顯示，重組抗原rv0183和重組抗原plcd分別刺激后活動(dòng)性結(jié)核病人il-6分泌水平均顯著高于潛伏感染人群和非感染人群，其中atb代表活動(dòng)性結(jié)核，hc代表健康對照。

圖8顯示了重組抗原rv0183和重組抗原plcd聯(lián)合檢測的roc分析結(jié)果。結(jié)果顯示，重組抗原rv0183和重組抗原plcd的聯(lián)合檢測能夠提高檢測活動(dòng)性結(jié)核患者的靈敏度和特異性。

圖9顯示了使用rv0183多肽庫刺激受試者全血的il-6水平分析結(jié)果。21條rv0183的抗原性片段組成的多肽庫共同體外刺激臨床結(jié)核病人、陳舊性結(jié)核個(gè)體、非結(jié)核肺病病例的全血標(biāo)本。結(jié)果顯示，在活動(dòng)性結(jié)核病人中，il-6分泌水平顯著高于非活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)本。(注：**表示p<0.01，***表示p<0.001)

序列信息

本發(fā)明涉及的序列信息提供于下面的表1中。

表1：序列信息

重組蛋白rv0183的氨基酸序列(seqidno：1)

mtttrternfagigdvrivydvwtpdtapqavvvlahglgeharrydhvaqrlgaaglvtyaldhrghgrsggkrvlvrdiseytadfdtlvgiatreypgckrivlghsmgggivfaygverpdnydlmvlsapavaaqdlvspvvavaakllgvvvpglpvqeldftaisrdpevvqayntdplvhhgrvpagigrallqvgetmprrapaltapllvlhgtddrlipiegsrrlvecvgsadvqlkeypglyhevfnepernqvlddvvawlterl

重組蛋白rv0183的核苷酸序列(seqidno：2)

ggatccatgactaccacccggactgaacggaatttcgcgggcatcggcgatgtgcgcatcgtctacgacgtctggacgccggacaccgcgccgcaagcggtggtcgtgctggcccatggtctgggcgagcatgcccgccgctacgaccatgtcgcgcagcggctcggcgcggccggcctggtcacctatgcgcttgaccaccgcgggcatggccgctcgggtggcaaacgggtgctagtgagagacatctccgagtacaccgctgacttcgacaccctcgttgggatcgccacccgggaatatcccgggtgcaagcgcatcgtgctcgggcacagcatgggcggcggcattgtgttcgcttacggtgtcgaacgtccagacaactacgacctgatggtgctttcggcgccggcggtggcggcacaggacctggtgagcccggtagtggcggttgccgccaagcttctgggcgtcgtggtgcccggcctgccggtgcaggaactggattttactgccatctctcgcgaccctgaggtggtccaggcttacaacaccgacccactcgtgcaccacggacgggttccggccgggattggccgcgcgctgctgcaggtgggcgagaccatgccgcggcgagcaccggcattgaccgcgccgctgctagtgctgcacggcaccgatgaccggctgatccccatcgagggcagccgtcgcctggtcgaatgtgtgggatcggccgacgtgcagctgaaggagtatcccgggctgtaccacgaggtgttcaacgagccggagcgcaaccaggtgctcgacgatgtggtcgcctggctcaccgagcggttgtaagaattc

重組蛋白plcd的氨基酸序列(seqidno：3)

dagvswkvyrnktlgpissvltygslvtsfkqsadprsdlvrfgvapsypasfaadvlanrlprvswvipnvlesehpavpaaagafaivnilrillanpavwektalivsydenggffdhvvpatapagtpgeyvtvpdidqvpgsggirgpiglgfrvpcfvispysrgpqmvhdtfdhtsqlrlletrfgvpvpnltawrrsvtgdmtstfnfavppnsswpnldypglhalstvpqcvpnaalgtinrgipyrvpdpqimptqettptrgipsgpc

重組蛋白plcd的核苷酸序列(seqidno：4)

gatgccggcgtcagctggaaggtgtatcgcaacaagacactcgggcccatctcctcggttcttacttacggctcgcttgtgacgtctttcaaacagtcagccgatcccaggtcagatcttgtccgctttggcgtggcaccaagctatcccgcgagcttcgcggccgacgtcttagccaatagactgccgcgggtctcctgggtgattcccaatgttctcgaatccgaacatcctgcggttccagccgcggccggggctttcgcaatcgtcaacatcttaagaatattgcttgccaatcctgcggtgtgggaaaagacggcgctgatcgtcagctacgacgaaaacggcggctttttcgaccacgttgttcctgctaccgcgccggccgggactcccggcgaatatgtcacggtgcctgacatcgatcaggtgccgggctccggcggaatacgcgggccgatcggtttgggctttcgcgttccctgcttcgtcatttcgccgtacagccgtggcccgcagatggttcacgacacgtttgaccacacctcacagctgagattgctcgaaactcggttcggggtgccagttcccaacctcacggcttggcggcgcagtgtgaccggcgacatgacgtcaacgttcaacttcgctgtcccgcccaactcatcatggcccaacctggattatcccgggctgcacgcgctatcaacggtgccgcagtgcgtgcccaacgcggcgctgggcacgataaaccgtggaatcccgtatcgggttcctgatccacagatcatgcccacgcaggaaaccacgcctacccgtggtattccgagcggtccgtgctaa

rv0183多肽庫肽段序列(p1-p21)(seqidno：5～25)

rv0183-p1:mtttrternfagigdvrivy(seqidno：5)

rv0183-p2:gdvrivydvwtpdtapqavv(seqidno：6)

rv0183-p3:tapqavvvlahglgeharry(seqidno：7)

rv0183-p4:geharrydhvaqrlgaaglv(seqidno：8)

rv0183-p5:lgaaglvtyaldhrghgrsg(seqidno：9)

rv0183-p6:rghgrsggkrvlvrdiseyt(seqidno：10)

rv0183-p7:rdiseytadfdtlvgiatre(seqidno：11)

rv0183-p8:vgiatreypgckrivlghsm(seqidno：12)

rv0183-p9:ivlghsmgggivfaygverp(seqidno：13)

rv0183-p10:aygverpdnydlmvlsapav(seqidno：14)

rv0183-p11:vlsapavaaqdlvspvvava(seqidno：15)

rv0183-p12:spvvavaakllgvvvpglpv(seqidno：16)

rv0183-p13:vvpglpvqeldftaisrdpe(seqidno：17)

rv0183-p14:aisrdpevvqayntdplvhh(seqidno：18)

rv0183-p15:tdplvhhgrvpagigrallq(seqidno：19)

rv0183-p16:igrallqvgetmprrapalt(seqidno：20)

rv0183-p17:rrapaltapllvlhgtddrl(seqidno：21)

rv0183-p18:hgtddrlipiegsrrlvecv(seqidno：22)

rv0183-p19:rrlvecvgsadvqlkeypgl(seqidno：23)

rv0183-p20:lkeypglyhevfnepernqv(seqidno：24)

rv0183-p21:epernqvlddvvawlterl(seqidno：25)

引物(5’-3’)(seqidno：26～29)

plcd-1-f:ttcaaccatcgccgcctctacca(seqidno：26)

plcd-1-r:ccatcgccgcctctaccagt(seqidno：27)

plcd-2-f:ggatccatggatgccggcgtcag(seqidno：28)

plcd-2-r:aagcttttagcacggaccgctcg(seqidno：29)

具體實(shí)施方式

現(xiàn)參照下列意在舉例說明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來描述本發(fā)明

除非特別指明，否則基本上按照本領(lǐng)域內(nèi)熟知的以及在各種參考文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方法進(jìn)行實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)和方法(例如，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測法)。參見，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989)；和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociates(1992),其全部通過引用合并入本文。按照制造商的說明書進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)，如在本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的或如本文描述的。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。本文中提及的全部公開案和其他參考資料以其全文通過引用合并入本文。

實(shí)施例1.重組蛋白rv0183的克隆、表達(dá)和去內(nèi)毒素純化

1.包含重組蛋白rv0183的編碼序列的表達(dá)載體的構(gòu)建

1.1.1目的基因片段的獲得

目的基因片段為人工合成，為了能夠方便的引入表達(dá)載體，目的基因片段合成時(shí)5’端添加bamhi酶切位點(diǎn)，3’端添加ecori酶切位點(diǎn)，載體為pmd18t，得到兩端含有酶切位點(diǎn)的rv0183質(zhì)粒。

酶切：使用bamhi/ecori雙酶切人工構(gòu)建的rv0183質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物。

1.1.2目的基因片段的融合和表達(dá)載體的構(gòu)建

使用bamhi/ecori雙酶切的pto-t7載體(載體信息參見羅文新，張軍，楊海杰等，一種帶增強(qiáng)子的原核高效表達(dá)載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用，生物工程學(xué)報(bào)，2000，16(5)：578-581)和編碼rv0183的酶切產(chǎn)物連接，獲得含有rv0183基因片段的表達(dá)載體pto-t7-rv0183。

2.重組蛋白rv0183的表達(dá)與去內(nèi)毒素純化

將構(gòu)建好的pto-t7-rv0183表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌er2566(實(shí)驗(yàn)室保存)，將其涂布于含卡那霉素(kan，終濃度100μg/ml)的固體lb培養(yǎng)基(lb培養(yǎng)基成分：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l氯化鈉，下同)上，并在37℃下靜置培養(yǎng)至單菌落清晰可辨。挑取單菌落至液體lb培養(yǎng)基(含100μg/ml卡那霉素)中，在37℃，180rpm下震蕩培養(yǎng)8小時(shí)。然后將菌液轉(zhuǎn)接至500ml液體lb培養(yǎng)基(含100ug/ml卡那霉素)的培養(yǎng)瓶中，在37℃，180rpm下震蕩培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)瓶中液體的od600達(dá)0.6-0.8時(shí)，加入iptg至0.2mm/l的終濃度并在37℃，180rpm下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。然后5000rpm離心培養(yǎng)物10min，收集菌體。

由于重組蛋白rv0183用于刺激全血，因此需要去除蛋白產(chǎn)物中的內(nèi)毒素。從菌體蛋白中純化重組蛋白病去除內(nèi)毒素的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本實(shí)施例中，使用下列示例性方法。

將收集的菌體用50mmtb8.0的緩沖液懸浮，置于冰浴中并通過超聲波進(jìn)行破碎，然后以12000rpm離心10min，收集包涵體。

ni-nta柱純化：目的蛋白上清表達(dá)，利用自組裝的ni-nta柱(介質(zhì)廠家：qiagen)進(jìn)行純化。簡言之，將樣品加載至ni-nta柱，用0.2％脫氧膽酸鈉，50mmtb8.0洗滌，以去除部分內(nèi)毒素，然后用200ml50mmtb8.0洗滌，以去除脫氧膽酸鈉；最后用洗脫液100ml(150mm咪唑，50mmtb8.0)洗脫目的蛋白。

deae柱純化：上述洗脫蛋白，繼續(xù)使用deae柱純化。上柱緩沖液為50mmtb8.0，洗脫液為400mmnacl，50mmtb8.0。洗脫蛋白透析至50mmtb8.0保存。

在上述蛋白純化過程中，所使用的緩沖液均由注射用水配制，所用實(shí)驗(yàn)容器均經(jīng)200℃高溫干烤2小時(shí)以上。

利用sds-page檢測經(jīng)兩步純化的重組蛋白rv0183，結(jié)果示于圖1中。結(jié)果顯示，重組蛋白rv0183分子量約為30kd，并且經(jīng)過上述兩步純化后，重組蛋白rv0183的純度達(dá)到95％以上。

使用鱟試劑檢測經(jīng)純化的重組蛋白rv0183中的內(nèi)毒素。結(jié)果顯示，經(jīng)上述兩步純化，重組蛋白rv0183的內(nèi)毒素含量低于100eu/mg。

實(shí)施例2.重組蛋白plcd的克隆、表達(dá)和去內(nèi)毒素純化

2.1包含重組蛋白plcd的編碼序列的表達(dá)載體的構(gòu)建

pcr擴(kuò)增獲得目的基因片段

由于結(jié)核分枝桿菌基因組片段長，gc堿基含量高，直接擴(kuò)增目的片段比較困難，因此采用巢式pcr方法，通過兩輪pcr，以結(jié)核分枝桿菌h37rv基因組dna為模板擴(kuò)增獲得目的片段。

2.1.1pcr引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)ncbi中記錄的結(jié)核分枝桿菌h37rv菌種的plcd蛋白對應(yīng)的基因序列，使用軟件對引物進(jìn)行評估和篩選，并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)結(jié)果如下：

表2:引物序列(seqidno:26-29)

2.1.2第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)

按下表在0.5mlependorf管中混勻各個(gè)成分，建立20μl體積pcr反應(yīng)體系。

plcd蛋白編碼基因第一輪pcr反應(yīng)體系

擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min，熱啟動(dòng)后轉(zhuǎn)入95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。

2.1.3第二輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)

將第一輪pcr產(chǎn)物作為模板，按下表在0.5mlependorf管中混勻各成分，組成50μlpcr反應(yīng)體系。

plcd蛋白編碼基因第二輪pcr反應(yīng)體系

擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10min，95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。

2.1.4克隆載體的構(gòu)建

在0.5mlependorf管中加入如下成分混合，16℃條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得連接有目的基因片段的pmd18-t克隆載體。

2.1.5克隆載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取40μl感受態(tài)dh5α細(xì)胞和10μl克隆載體連接產(chǎn)物混合，冰浴吸附15min。42℃熱休克90s，迅速冰浴終止反應(yīng)。加入200μl無抗生素的lb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取200μl培養(yǎng)液涂含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12h。

2.1.6克隆載體質(zhì)?；厥?/p>

挑取單克隆菌落接種于5ml加有氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5ml菌液于1.5mleppendorf管中，12000g離心1min，棄上清。加入250μl溶液i，振蕩使沉淀完全懸浮。加入250μl溶液ii，輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解。加入350μl溶液ⅲ，充分混勻，置冰浴15min。12000rpm離心10min。吸上清轉(zhuǎn)移到平衡好的質(zhì)?；厥瘴街?，室溫靜置5min，后續(xù)回收操作同膠回收步驟。

回收產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳鑒定，確認(rèn)回收成功。對得到含目的基因片段的pmd18-t載體進(jìn)行酶切，回收克隆后的目的片段，并取部分克隆載體送測序。

2.1.7plcd表達(dá)克隆構(gòu)建

pmd-18t酶切的目的基因片段與酶切處理的pto-t7載體連接，連接體系為pto-t7載體1μl，目的基因片段6μl，10×t4dnaligasebuffer1μl，t4dna連接酶1μl，反應(yīng)總體積10μl。連接時(shí)間為2h。

2.2表達(dá)克隆質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與蛋白表達(dá)純化

2.2.1表達(dá)載體連接物轉(zhuǎn)化

步驟同上述連接步驟，使用er2566感受態(tài)細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化對象，轉(zhuǎn)化后將er2566涂布在含卡那霉素的lb抗性培養(yǎng)基上。

2.2.2plcd蛋白表達(dá)及純化

目的蛋白的提取

活化在小量表達(dá)鑒定有正確目標(biāo)蛋白表達(dá)的菌株。37℃條件培養(yǎng)4h后加入1mmol/liptg，保持37℃誘導(dǎo)4h,以9000g離心6min收集菌體。菌體吹洗后重新離心收集沉淀，按每200ml菌液加入5ml的比例加入tb8.0緩沖液重懸。重懸菌液進(jìn)行超聲破碎處理，處理時(shí)間按每500ml菌液3min計(jì)算。超聲后樣品以12000g離心10min收集破碎后的沉淀。破碎產(chǎn)物沉淀用tb8.0溶液反復(fù)吹洗3次，每次重懸后在37℃溫箱中震蕩15min。沉淀用15ml含6m尿素的tb8.0溶液重懸后充分吹打，將大部分沉淀吹起后12000g離心10min收集上清進(jìn)入下一步純化階段。

鎳離子柱親和層析

ni-nta柱純化：目的蛋白上清表達(dá)，利用自組裝的ni-nta柱(介質(zhì)廠家：qiagen)進(jìn)行純化。將樣品加載至ni-nta柱，用0.2％脫氧膽酸鈉，50mmtb8.0+6m尿素洗滌，以去除部分內(nèi)毒素，然后用200ml50mmtb8.0+6m尿素洗滌，以去除脫氧膽酸鈉；最后用洗脫液100ml(150mm咪唑，50mmtb8.0,6m尿素)洗脫目的蛋白。

蛋白質(zhì)的復(fù)性

由于plcd蛋白屬于包涵體表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)使用6m尿素使包涵體變性溶解，親和層析純化后采用梯度透析的方法逐步去除變性劑，透析過程中加入二硫蘇糖醇(dtt)防止形成錯(cuò)誤二硫鍵，幫助蛋白形成正確折疊，保持可溶狀態(tài)。透析步驟見下表，結(jié)果示于圖2。

plcd蛋白質(zhì)透析復(fù)性操作步驟

內(nèi)毒素的去除和檢測

根據(jù)shiguiliu等人的方法(liusg,tobiasr.removalofendotoxinfromrecombinantproteinpreparations[j].clinicalbiochem,1997,30:455-463)，本實(shí)驗(yàn)采用非離子型去垢劑tritonx-114萃取對重組蛋白進(jìn)行內(nèi)毒素去除。

向蛋白溶液中加入終濃度為1％(w/v)的tritonx-114，在4℃條件下混勻兩相，震蕩15min。將含tritonx-114的蛋白溶液置于37℃水浴10min，可見體系渾濁，溶液中有油滴出現(xiàn)。25℃12000g離心10min，小心移出水相。反復(fù)以上步驟一次，收集水相。處理過后的蛋白溶液采用鱟試劑凝膠法檢測內(nèi)毒素含量。

實(shí)施例3.rv0183特異性t細(xì)胞反應(yīng)標(biāo)志物的篩選

3.1刺激樣品的收集和處理

3.1.1體外刺激樣品收集

用肝素抗凝管采集4例igras檢測陽性的住院活動(dòng)性結(jié)核病人外周血5ml，采集4例igras檢測陽性的無臨床癥狀潛伏感染者外周血5ml。

3.1.2樣品刺激處理和收集

樣品分裝至9個(gè)無內(nèi)毒素2mlep管中，每個(gè)ep管中500μl外周血；ep管已分別添加15μl培養(yǎng)液(培養(yǎng)液配方：30μlpbs中添加133.33mg/ml的d-葡萄糖和166.67mm的kcl；其中pbs配方為：na2hpo4·12h2o2.9g，kh2po40.24g，nacl8g，kcl0.2g，補(bǔ)超純水至1l。)，編號分別為n、ta、p。其中n管不含刺激抗原，ta中含1μg刺激抗原rv0183，p管中含pha20ug。

外周血加入ep管后，顛倒混勻，至于37℃恒溫箱培養(yǎng)20-24h；5000rpm收集血漿樣品，檢測血漿中細(xì)胞因子含量。

3.2血漿中細(xì)胞因子含量檢測

收集的血漿樣品使用商品化的milliplex試劑盒(merckmillipore,st.charles,missouri,usa)(貨號：hcytmag-60k-px38,hcp2mag-62k-px23,hcp3mag-63k-px11)進(jìn)行細(xì)胞因子定量檢測，檢測指標(biāo)包括egf等69種(見表2)，檢測平臺為luminex200(以下步驟中的洗液、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、磁珠均來自試劑盒中)。

檢測步驟包括：1)在96孔檢測板上每孔加200μl洗液，室溫震蕩10min，移除洗液；2)在相應(yīng)的孔中添加25μl標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，雙孔重復(fù)；3)添加25μlassaybuffer到樣品孔；4)在標(biāo)準(zhǔn)品孔、質(zhì)控品孔和空白對照孔中，每孔加25μl血漿基質(zhì)(基質(zhì)指試劑盒中一種樣品稀釋液)；5)每孔加25μl血漿樣品；6)每孔加25μl磁珠2-8℃過夜；7)移除孔內(nèi)液體，200μl/孔洗液，洗兩遍；8)每孔加檢測抗體25μl，室溫孵育1h；9)每孔加25μlsteptavidin-phycoerythrin，室溫反應(yīng)30min；10)移除孔內(nèi)液體，洗板兩次；11)每孔加150μl鞘液，震蕩混勻；11)在luminex200平臺上讀板；12)將每個(gè)樣品ta管的實(shí)際檢測值減去n管的實(shí)際檢測值而得到的差值作為最終結(jié)果(即，細(xì)胞因子實(shí)際增加值，以ta-n表示)。(方法為雙抗體夾心法)

檢測結(jié)果見表3。分析細(xì)胞因子在活動(dòng)性結(jié)核病人和潛伏感染人群中應(yīng)答情況的不同，篩選出il-6能夠有效區(qū)分結(jié)核感染者是處于活動(dòng)性結(jié)核(atb)狀態(tài)還是潛伏感染(ltbi)狀態(tài)(有臨床癥狀的住院結(jié)核病人為活動(dòng)性結(jié)核病人，igra檢測陽性無臨床癥狀的標(biāo)本為潛伏感染者)。

表3

實(shí)施例4.在結(jié)核感染人群中利用rv0183篩選活動(dòng)性結(jié)核病人

4.1隊(duì)列標(biāo)本信息

4.1.1活動(dòng)性結(jié)核病人：均為臨床確診活動(dòng)性結(jié)核病人，79例；2)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群和健康人群：共37例醫(yī)護(hù)工作者參與到對列中來，其中14例醫(yī)護(hù)結(jié)核igras實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性但是無臨床結(jié)核癥狀且無結(jié)核病史，判定為潛伏感染者；另外23例igras檢測結(jié)果陰性的醫(yī)護(hù)工作者判定為無結(jié)核分枝桿菌感染的健康者。

4.2樣本刺激培養(yǎng)體系

4.2.1全血樣本分裝到三個(gè)2mlep管中，每管分裝500μl，3個(gè)ep管分別標(biāo)記為n、ta、p；n管中為15μl培養(yǎng)液(配方同實(shí)施例4)，不含抗原，ta管中的15μl培養(yǎng)液含1μg上述重組抗原rv0183，p管中的15μl培養(yǎng)液含20μgpha。

4.2.2全血分裝后輕輕顛倒混勻，至于37℃恒溫箱中溫育20±2h。

4.2.3培養(yǎng)完成后，5000rpm離心10min收集血漿，檢測il-6水平。

4.3血漿il-6水平檢測

il-6elisa檢測試劑盒(廈門萬泰滄海生物)用來檢測血漿中il-6水平。

1)血漿標(biāo)本處理，用20％新生牛血清(nbs)2倍稀釋；2)加樣溫育：96孔il-6檢測板上，每孔加處理后的血漿100μl，37℃反應(yīng)40min，洗板五次，甩干檢測板；3)加酶溫育：每孔加酶標(biāo)二抗100μl，37℃恒溫箱反應(yīng)40min，洗板5次，甩干檢測板；4)顯色：加顯色液反應(yīng)10min，50μl終止液終止反應(yīng)；5)測定：酶標(biāo)儀波長與450nm處檢測吸光值；6)將每個(gè)樣品ta管的實(shí)際檢測值減去n管的實(shí)際檢測值而得到的差值作為最終結(jié)果(即，細(xì)胞因子實(shí)際增加值，以ta-n表示)。

檢測結(jié)果見圖3，1μg重組抗原刺激500μl外周血細(xì)胞，在結(jié)核分枝桿菌潛伏人群和活動(dòng)性結(jié)核病人中il-6的分泌水平有顯著的差別。

實(shí)施例5.利用rv0183在普通人群中篩選活動(dòng)性結(jié)核病人

5.1隊(duì)列標(biāo)本信息

5.1.1活動(dòng)性結(jié)核病人：臨床確診活動(dòng)性結(jié)核病人207例；

5.1.2門診體檢者及醫(yī)護(hù)人員：綜合科門診體檢者標(biāo)本65例，其中結(jié)核igras陽性標(biāo)本且無臨床癥狀者為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者；其中結(jié)核igras陰性標(biāo)本為非結(jié)核分枝桿菌感染者。醫(yī)護(hù)人員82例，其中結(jié)核igras陽性標(biāo)本且無臨床癥狀者為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者；其中結(jié)核igras陰性標(biāo)本為非結(jié)核分枝桿菌感染者。

5.2樣本采集和樣本刺激培養(yǎng)體系

5.2.1每位受檢者采集3ml外周血，全血分裝到3個(gè)2mlep管中，每個(gè)ep管中分裝1ml；3個(gè)ep管分別標(biāo)為n、ta、p，每個(gè)ep管中添加30μl培養(yǎng)液(配方同實(shí)施例4)；其中n管中添加的培養(yǎng)液不含抗原，ta管中添加的30μl培養(yǎng)液含2μg上述重組抗原rv0183，p管中添加的30μl培養(yǎng)液含40μgpha；

5.2.2全血分裝后，輕輕顛倒混勻，置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)20±2h；

5.2.3培養(yǎng)結(jié)束后，將ep管置于離心機(jī)，5000rpm離心10min，收集血漿標(biāo)本，進(jìn)行il-6分泌水平檢測；

5.3血漿中il-6分泌水平檢測

il-6elisa檢測試劑盒(廈門萬泰滄海生物)用來檢測血漿中il-6水平。

il-6檢測方法與實(shí)施例4中描述的方法相同。

檢測結(jié)果見圖4，rv0183刺激外周血細(xì)胞后，il-6的分泌水平在活動(dòng)性結(jié)核病人和結(jié)核分枝桿菌潛伏人群中有顯著的差別；同時(shí)在活動(dòng)性結(jié)核病人與非分枝結(jié)核桿菌感染者中il-6的水平同樣存在顯著差別，結(jié)果見圖5。上述結(jié)果表明，rv0183可用于活動(dòng)性結(jié)核病人的檢測。

實(shí)施例6.利用rv0183的抗原性片段篩選活動(dòng)性結(jié)核病人

6.1隊(duì)列標(biāo)本信息

同實(shí)施例5。

6.2樣本采集和樣本刺激培養(yǎng)體系

6.2.1收集臨床活動(dòng)性結(jié)核標(biāo)本，每例標(biāo)本采集全血15ml，將全血分裝至22個(gè)ep管中每管500μl全血，其中一個(gè)ep管為陰性對照管(n),另外21支ep管編號為p1、p2、p3…p21,在p1管中添加1μg肽段rv0183-p1，p2管中添加1μg肽段rv0183-p2，依次類推，在p21管中添加1μg肽段rv0183-p21。

6.2.2全血分裝后，輕輕顛倒混勻，置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)20±2h；

6.2.3培養(yǎng)結(jié)束后，將ep管置于離心機(jī)，5000rpm離心10min，收集血漿標(biāo)本，進(jìn)行il-6分泌水平檢測；

6.3血漿中il-6分泌水平檢測

il-6elisa檢測試劑盒(廈門萬泰滄海生物)用來檢測血漿中il-6水平。

il-6檢測方法與實(shí)施例4中描述的方法相同。

檢測結(jié)果見圖6，rv0183的抗原性片段(p1-p21)刺激的活動(dòng)性結(jié)核病人全血中il-6分泌水平出現(xiàn)不同程度的升高，而在健康對照中，基本無il-6應(yīng)答，結(jié)果說明上述抗原性片段可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核。

實(shí)施例7.利用rv0183和plcd聯(lián)合檢測篩選活動(dòng)性結(jié)核病人

7.1隊(duì)列標(biāo)本信息

atb(igra+)代表tb-igra檢測陽性的臨床確診活動(dòng)性結(jié)核病人，atb(igra-)代表tb-igra檢測陰性的臨床確診活動(dòng)性結(jié)核病人。hc(igra+)代表tb-igra檢測陽性的健康體檢者，hc(igra-)代表tb-igra檢測陰性的健康體檢者。其中atb(igra+)標(biāo)本55例，atb(igra-)標(biāo)本9例，hc(igra+)標(biāo)本13例，hc(igra-)標(biāo)本52例。

7.2樣本采集和樣本刺激培養(yǎng)體系

7.2.1每位受檢者采集4ml外周血，全血分裝到4個(gè)2mlep管中，每個(gè)ep管中分裝1ml；4個(gè)ep管分別標(biāo)為n、ta1、ta2、p，每個(gè)ep管中添加30μl培養(yǎng)液(配方同實(shí)施例4)；其中n管中添加的培養(yǎng)液不含抗原，ta1管中添加的30μl培養(yǎng)液含2μg上述重組抗原rv0183，ta2中添加的30μl培養(yǎng)液含2μg重組抗原plcd，p管中添加的30μl培養(yǎng)液含40μgpha；

7.2.2全血分裝后，輕輕顛倒混勻，置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)20±2h；

7.2.3培養(yǎng)結(jié)束后，將ep管置于離心機(jī)，5000rpm離心10min，收集血漿標(biāo)本，進(jìn)行il-6分泌水平檢測；

7.3血漿中il-6分泌水平檢測

il-6elisa檢測試劑盒(廈門萬泰滄海生物)用來檢測血漿中il-6水平。

il-6檢測方法與實(shí)施例4中描述的方法相同。

檢測結(jié)果見圖7a-7b，使用rv0183和plcd分別刺激受試者全血后得到的il-6實(shí)際變化水平在活動(dòng)性結(jié)核病人篩查中具有互補(bǔ)效果。進(jìn)一步用roc分析來檢驗(yàn)單獨(dú)使用rv0183或plcd以及兩者聯(lián)合檢測在活動(dòng)性結(jié)核診斷方面的性能。roc曲線顯示，rv0183和plcd聯(lián)合檢測可以提高檢測的靈敏度和特異性，結(jié)果見圖8。

由上述結(jié)果可知，rv0183和plcd刺激導(dǎo)致的il-6實(shí)際變化水平可以單獨(dú)或者聯(lián)合用于活動(dòng)性結(jié)核病人檢測，具有較高的靈敏度和特異性。

實(shí)施例8.結(jié)核分枝桿菌的其它抗原用于活動(dòng)性結(jié)核篩選診斷的價(jià)值探討

8.1隊(duì)列標(biāo)本信息

收集臨床診斷確診活動(dòng)性結(jié)核病人5例，無臨床癥狀的潛伏感染者5例采集全血標(biāo)本。

8.2樣本采集和樣本刺激培養(yǎng)體系

8.2.1采集全血標(biāo)本10ml，分裝至9只ep管中，每管1ml全血。其中1只ep管為陰性對照管(n)。其它8只ep管中分別添加2μg表3所列出的7種抗原中的一種；

8.2.2全血分裝后，輕輕顛倒混勻，置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)20±2h；

8.2.3培養(yǎng)結(jié)束后，將ep管置于離心機(jī)，5000rpm離心10min，收集血漿標(biāo)本，進(jìn)行il-6分泌水平檢測；

8.3血漿中il-6分泌水平檢測

il-6elisa檢測試劑盒(廈門萬泰滄海生物)用來檢測血漿中il-6水平。

il-6檢測方法與實(shí)施例4中描述的方法相同。

檢測結(jié)果見表4，esat-6、cfp-10、rv1009、rv1884c、rv2389c、rv2450c、rv3097c、rv3542這些抗原刺激后樣品中il-6水平在活動(dòng)性結(jié)核(atb)和潛伏感染(ltbi)中沒有顯著性變化，也即，上述抗原不能用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染。

表4

實(shí)施例9.利用rv0183多肽庫在不同類型肺病患者標(biāo)本中篩選活動(dòng)性結(jié)核患者

9.1隊(duì)列標(biāo)本信息

9.1.1活動(dòng)性結(jié)核病例：臨床確診活動(dòng)性結(jié)核患者101例；

9.1.2陳舊性結(jié)核病例：無臨床癥狀陳舊性結(jié)核患者19例；

9.1.3臨床非結(jié)核肺病病例：其中igra檢測陽性病例為結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染者；其中igra檢測陰性病例為非結(jié)核分枝桿菌感染者。

9.2樣本采集和樣本刺激培養(yǎng)體系

9.2.1樣本采集：樣本采集處理同實(shí)施例5。

9.2.2樣本刺激培養(yǎng)：使用含有21條rv0183抗原性片段(seqidno:5-25)的多肽庫作為刺激源標(biāo)記(ta),刺激全血。將多肽庫中的每種多肽配置成1μg/ml溶液，將各上述溶液等量混合后，取30μl進(jìn)行試驗(yàn)。其它操作同實(shí)施例5。

9.3il-6水平檢測

同實(shí)施例5。

檢測結(jié)果見圖9，rv0183多肽庫刺激全血標(biāo)本后，活動(dòng)性結(jié)核患者il-6水平顯著高于陳舊性肺結(jié)核和其它肺病患者，表明該多肽庫可用于篩選活動(dòng)性結(jié)核病人。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：根據(jù)已經(jīng)公布的所有教導(dǎo)，可以對細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和變動(dòng)，并且這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部分為由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>廈門大學(xué)

<120>用于診斷活動(dòng)性結(jié)核的方法和試劑盒

<130>idc160028

<150>cn201610034476.6

<151>2016-01-20

<160>29

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>279

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>1

metthrthrthrargthrgluargasnphealaglyileglyaspval

151015

argilevaltyraspvaltrpthrproaspthralaproglnalaval

202530

valvalleualahisglyleuglygluhisalaargargtyrasphis

354045

valalaglnargleuglyalaalaglyleuvalthrtyralaleuasp

505560

hisargglyhisglyargserglyglylysargvalleuvalargasp

65707580

ileserglutyrthralaasppheaspthrleuvalglyilealathr

859095

argglutyrproglycyslysargilevalleuglyhissermetgly

100105110

glyglyilevalphealatyrglyvalgluargproaspasntyrasp

115120125

leumetvalleuseralaproalavalalaalaglnaspleuvalser

130135140

provalvalalavalalaalalysleuleuglyvalvalvalprogly

145150155160

leuprovalglngluleuaspphethralaileserargaspproglu

165170175

valvalglnalatyrasnthraspproleuvalhishisglyargval

180185190

proalaglyileglyargalaleuleuglnvalglygluthrmetpro

195200205

argargalaproalaleuthralaproleuleuvalleuhisglythr

210215220

aspaspargleuileproilegluglyserargargleuvalglucys

225230235240

valglyseralaaspvalglnleulysglutyrproglyleutyrhis

245250255

gluvalpheasngluprogluargasnglnvalleuaspaspvalval

260265270

alatrpleuthrgluargleu

275

<210>2

<211>852

<212>dna

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>2

ggatccatgactaccacccggactgaacggaatttcgcgggcatcggcgatgtgcgcatc60

gtctacgacgtctggacgccggacaccgcgccgcaagcggtggtcgtgctggcccatggt120

ctgggcgagcatgcccgccgctacgaccatgtcgcgcagcggctcggcgcggccggcctg180

gtcacctatgcgcttgaccaccgcgggcatggccgctcgggtggcaaacgggtgctagtg240

agagacatctccgagtacaccgctgacttcgacaccctcgttgggatcgccacccgggaa300

tatcccgggtgcaagcgcatcgtgctcgggcacagcatgggcggcggcattgtgttcgct360

tacggtgtcgaacgtccagacaactacgacctgatggtgctttcggcgccggcggtggcg420

gcacaggacctggtgagcccggtagtggcggttgccgccaagcttctgggcgtcgtggtg480

cccggcctgccggtgcaggaactggattttactgccatctctcgcgaccctgaggtggtc540

caggcttacaacaccgacccactcgtgcaccacggacgggttccggccgggattggccgc600

gcgctgctgcaggtgggcgagaccatgccgcggcgagcaccggcattgaccgcgccgctg660

ctagtgctgcacggcaccgatgaccggctgatccccatcgagggcagccgtcgcctggtc720

gaatgtgtgggatcggccgacgtgcagctgaaggagtatcccgggctgtaccacgaggtg780

ttcaacgagccggagcgcaaccaggtgctcgacgatgtggtcgcctggctcaccgagcgg840

ttgtaagaattc852

<210>3

<211>280

<212>prt

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>3

aspalaglyvalsertrplysvaltyrargasnlysthrleuglypro

151015

ileserservalleuthrtyrglyserleuvalthrserphelysgln

202530

seralaaspproargseraspleuvalargpheglyvalalaproser

354045

tyrproalaserphealaalaaspvalleualaasnargleuproarg

505560

valsertrpvalileproasnvalleuglusergluhisproalaval

65707580

proalaalaalaglyalaphealailevalasnileleuargileleu

859095

leualaasnproalavaltrpglulysthralaleuilevalsertyr

100105110

aspgluasnglyglyphepheasphisvalvalproalathralapro

115120125

alaglythrproglyglutyrvalthrvalproaspileaspglnval

130135140

proglyserglyglyileargglyproileglyleuglypheargval

145150155160

procysphevalileserprotyrserargglyproglnmetvalhis

165170175

aspthrpheasphisthrserglnleuargleuleugluthrargphe

180185190

glyvalprovalproasnleuthralatrpargargservalthrgly

195200205

aspmetthrserthrpheasnphealavalproproasnsersertrp

210215220

proasnleuasptyrproglyleuhisalaleuserthrvalprogln

225230235240

cysvalproasnalaalaleuglythrileasnargglyileprotyr

245250255

argvalproaspproglnilemetprothrglngluthrthrprothr

260265270

argglyileproserglyprocys

275280

<210>4

<211>843

<212>dna

<213>結(jié)核分枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis）

<400>4

gatgccggcgtcagctggaaggtgtatcgcaacaagacactcgggcccatctcctcggtt60

cttacttacggctcgcttgtgacgtctttcaaacagtcagccgatcccaggtcagatctt120

gtccgctttggcgtggcaccaagctatcccgcgagcttcgcggccgacgtcttagccaat180

agactgccgcgggtctcctgggtgattcccaatgttctcgaatccgaacatcctgcggtt240

ccagccgcggccggggctttcgcaatcgtcaacatcttaagaatattgcttgccaatcct300

gcggtgtgggaaaagacggcgctgatcgtcagctacgacgaaaacggcggctttttcgac360

cacgttgttcctgctaccgcgccggccgggactcccggcgaatatgtcacggtgcctgac420

atcgatcaggtgccgggctccggcggaatacgcgggccgatcggtttgggctttcgcgtt480

ccctgcttcgtcatttcgccgtacagccgtggcccgcagatggttcacgacacgtttgac540

cacacctcacagctgagattgctcgaaactcggttcggggtgccagttcccaacctcacg600

gcttggcggcgcagtgtgaccggcgacatgacgtcaacgttcaacttcgctgtcccgccc660

aactcatcatggcccaacctggattatcccgggctgcacgcgctatcaacggtgccgcag720

tgcgtgcccaacgcggcgctgggcacgataaaccgtggaatcccgtatcgggttcctgat780

ccacagatcatgcccacgcaggaaaccacgcctacccgtggtattccgagcggtccgtgc840

taa843

<210>5

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p1

<400>5

metthrthrthrargthrgluargasnphealaglyileglyaspval

151015

argilevaltyr

20

<210>6

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p2

<400>6

glyaspvalargilevaltyraspvaltrpthrproaspthralapro

151015

glnalavalval

20

<210>7

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p3

<400>7

thralaproglnalavalvalvalleualahisglyleuglygluhis

151015

alaargargtyr

20

<210>8

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p4

<400>8

glygluhisalaargargtyrasphisvalalaglnargleuglyala

151015

alaglyleuval

20

<210>9

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p5

<400>9

leuglyalaalaglyleuvalthrtyralaleuasphisargglyhis

151015

glyargsergly

20

<210>10

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p6

<400>10

argglyhisglyargserglyglylysargvalleuvalargaspile

151015

serglutyrthr

20

<210>11

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p7

<400>11

argaspileserglutyrthralaasppheaspthrleuvalglyile

151015

alathrargglu

20

<210>12

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p8

<400>12

valglyilealathrargglutyrproglycyslysargilevalleu

151015

glyhissermet

20

<210>13

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p9

<400>13

ilevalleuglyhissermetglyglyglyilevalphealatyrgly

151015

valgluargpro

20

<210>14

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p10

<400>14

alatyrglyvalgluargproaspasntyraspleumetvalleuser

151015

alaproalaval

20

<210>15

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p11

<400>15

valleuseralaproalavalalaalaglnaspleuvalserproval

151015

valalavalala

20

<210>16

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p12

<400>16

serprovalvalalavalalaalalysleuleuglyvalvalvalpro

151015

glyleuproval

20

<210>17

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p13

<400>17

valvalproglyleuprovalglngluleuaspphethralaileser

151015

argaspproglu

20

<210>18

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p14

<400>18

alaileserargaspprogluvalvalglnalatyrasnthrasppro

151015

leuvalhishis

20

<210>19

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p15

<400>19

thraspproleuvalhishisglyargvalproalaglyileglyarg

151015

alaleuleugln

20

<210>20

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p16

<400>20

ileglyargalaleuleuglnvalglygluthrmetproargargala

151015

proalaleuthr

20

<210>21

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p17

<400>21

argargalaproalaleuthralaproleuleuvalleuhisglythr

151015

aspaspargleu

20

<210>22

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p18

<400>22

hisglythraspaspargleuileproilegluglyserargargleu

151015

valglucysval

20

<210>23

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p19

<400>23

argargleuvalglucysvalglyseralaaspvalglnleulysglu

151015

tyrproglyleu

20

<210>24

<211>20

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p20

<400>24

leulysglutyrproglyleutyrhisgluvalpheasngluproglu

151015

argasnglnval

20

<210>25

<211>19

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>rv0183-p21

<400>25

gluprogluargasnglnvalleuaspaspvalvalalatrpleuthr

151015

gluargleu

<210>26

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

ttcaaccatcgccgcctctacca23

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ccatcgccgcctctaccagt20

<210>28

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

ggatccatggatgccggcgtcag23

<210>29

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

aagcttttagcacggaccgctcg23