本發(fā)明屬于食品分析及安全領域，具體涉及一種魚肉及其制品中生物胺的檢測方法。

背景技術：

生物胺是一類含氮的堿性有機化合物的總稱，分子量低，在人體及動植物的組織中都含有少量的生物胺，是生物有機體內的正常活性成分，在機體內起著重要的生理作用。腐胺，精胺，亞精胺和尸胺等在調節(jié)核酸和蛋白質的合成及生物膜穩(wěn)定性方面起著重要作用，是生物活性細胞必不可少的部分。同時多種食品和一些發(fā)酵產品中也普遍存在著生物胺，一般認為，食品中的生物胺大多是在食品中的微生物所產生的氨基酸脫羧酶的作用下，脫去氨基酸的羧基而生成的，故含有蛋白質和氨基酸的食品，在一定條件下經過發(fā)酵或生化反應便可產生生物胺，目前已發(fā)現(xiàn)水產品、肉制品、乳制品、葡萄酒等食品中均含有多種生物胺。

然而，過量的生物胺會對人體造成嚴重的毒害作用，可造成人體神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的損傷，引起頭痛、平滑肌痙攣、胃酸分泌過多、過敏、血壓過高或過低等癥狀。此外，生物胺還有潛在的致癌性，組胺和多胺可與H2受體作用或促進血管生成而直接導致細胞轉化和腫瘤。而且，生物胺與亞硝酸鹽等食品防腐劑可互相反應生成具有明顯誘變性和潛在致癌性的亞硝胺而間接致癌。生物胺往往發(fā)生于食品腐爛或發(fā)酵過程中，食物中毒的發(fā)作和某些毒理學特性和組胺及酪胺有密切聯(lián)系。因此，對生物胺的研究和認識可以提高、改善食品的質量及安全性。

目前，用于同時測定魚肉食品中的多種生物胺的技術主要為離子色譜(IC)、毛細管電泳(CE)、生物傳感器或薄層電泳(TLC)等。然而，這些方法普遍存在精確度低、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性差等問題。因此，尋找一種精確度高、重現(xiàn)性好的用于檢測魚肉食品中生物胺的方法，是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種精確度高、重現(xiàn)性好的魚肉及其制品中生物胺的檢測方法。

本發(fā)明的具體實施方案如下：

本發(fā)明提供了一種魚肉及其制品中生物胺的檢測方法，包括：

a)將生物胺標準品溶液和內標混合，衍生處理后采用RP-HPLC進行分析檢測，得到所述生物胺標準品溶液的高效液相色譜圖；

b)將魚肉制品提取液進行衍生化處理后采用RP-HPLC進行分析檢測，得到所述魚肉制品提取液的高效液相色譜圖；

c)根據步驟a)和步驟b)得到的高效液相色譜圖，確定所述魚肉制品提取液中的生物胺種類及其含量。

優(yōu)選的，所述RP-HPLC采用乙酸銨-乙腈作為流動相進行梯度洗脫；

所述乙酸銨的濃度為0.1mol/L，所述乙腈為色譜純。

優(yōu)選的，所述乙酸銨作為流動相A，所述乙腈作為流動相B；

所述梯度洗脫的程序設置為：0-5min為40％流動相A，5-15min為40％流動相A到30％流動相A，15-20min為30％流動相A到20％流動相A，20-24min為20％流動相A到10％流動相A，24-28min為10％流動相A到40％流動相A，28-35min為40％流動相A。

優(yōu)選的，所述魚肉制品提取液的制備包括：將魚肉制品、三氯乙酸溶液和內標混合，震蕩提取。

優(yōu)選的，所述三氯乙酸溶液的質量百分比濃度為5％；

每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.5g所述魚肉制品。

優(yōu)選的，所述魚肉制品為木魚花。

優(yōu)選的，所述RP-HPLC的流速為1.0mL/min；紫外檢測波長為254nm；柱溫為40℃。

優(yōu)選的，所述衍生處理采用丹磺酰氯柱前衍生法。

優(yōu)選的，所述生物胺標準品溶液中包含：色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。

優(yōu)選的，所述內標為1,7-二氨基庚烷。

本發(fā)明提供了一種魚肉及其制品中生物胺的檢測方法，結合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法構建了適用于魚肉及其制品中生物胺檢測的色譜條件以及梯度洗脫程序，實現(xiàn)了多種生物胺的最佳化分離；整個實驗過程無需對樣品進行凈化處理，衍生過程簡單，可減少有效成分的損失，使測量限達到μg/L級別，而且耗時短，可以實現(xiàn)大批量的樣品的檢測。

本發(fā)明選擇了乙酸銨和純乙腈作為RP-HPLC的洗脫系統(tǒng)，其中乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185-205nm處檢測的要求；乙酸銨緩沖鹽用于調節(jié)檢測溶液的pH值大小，有效抑制了組分離解，增強保留。兩者共同使用，增強了檢測樣品中各種生物胺的分離效果。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為實施例1中生物胺標準品溶液的RP-HPLC色譜圖；

圖2為實施例1中待測木魚花溶液的RP-HPLC色譜圖；

圖3為對比例1中生物胺標準品溶液的RP-HPLC色譜圖；

圖4為對比例2中生物胺標準品待測溶液的RP-HPLC色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種魚肉及其制品中生物胺的檢測方法，結合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法構建了適用于魚肉及其制品中生物胺檢測的色譜條件以及梯度洗脫程序。本發(fā)明方法具體包括以下步驟：

a)將生物胺標準品溶液和內標混合，衍生處理后采用RP-HPLC進行分析檢測，得到所述生物胺標準品溶液的高效液相色譜圖；

b)將魚肉制品提取液進行衍生化處理后采用RP-HPLC進行分析檢測，得到所述魚肉制品提取液的高效液相色譜圖；

c)根據步驟a)和步驟b)得到的高效液相色譜圖，確定所述魚肉制品提取液中的生物胺種類及其含量。

在一些實施例中，所述RP-HPLC分析檢測采用乙酸銨-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。

優(yōu)選的，所述乙酸銨的濃度為0.1mol/L，所述乙腈為色譜純。

更優(yōu)選的，所述乙酸銨作為流動相A，所述乙腈作為流動相B；

所述梯度洗脫的程序設置為：0-5min為40％流動相A，5-15min為40％流動相A到30％流動相A，15-20min為30％流動相A到20％流動相A，20-24min為20％流動相A到10％流動相A，24-28min為10％流動相A到40％流動相A，28-35min為40％流動相A。

本發(fā)明選擇了乙酸銨和純乙腈作為RP-HPLC的洗脫系統(tǒng)，其中乙腈的溶劑強度較高且粘度較小，并可滿足在紫外185-205nm處檢測的要求；乙酸銨緩沖鹽用于調節(jié)檢測溶液的pH值大小，有效抑制了組分離解，增強保留。兩者共同使用，增強了檢測樣品中各種生物胺的分離效果。

在一些實施例中，所述魚肉制品提取液的制備包括：將魚肉制品、三氯乙酸溶液和內標混合，震蕩提取。

優(yōu)選的，所述三氯乙酸溶液的質量百分比濃度為5％；

每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.5g所述魚肉制品。

優(yōu)選的，所述魚肉制品為木魚花。

在一些實施例中，所述RP-HPLC的流速為1.0mL/min；紫外檢測波長為254nm；柱溫為40℃。

由于生物胺無紫外吸收，也無熒光效應，一般需對其進行衍生化處理,衍生分為柱前衍生法和柱后衍生法，柱后衍生法是待測樣品經過色譜柱分離后進入特殊的衍生設備進行衍生，然后通過檢測器進行檢測。相對于柱前衍生法，兩者均適用于大批量樣品的檢測，耗時少，重復性好，檢測過程都可以通過程序的設定完成，比較便利，但柱后衍生法的儀器設備更昂貴，故多數研究者會選擇柱前衍生法。優(yōu)選的，所述衍生處理采用丹磺酰氯柱前衍生法。

在一些實施例中，所述生物胺標準品溶液中包含：色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺。優(yōu)選的，所述生物胺標準品中各生物胺的終濃度為100mg/L。

在一些實施例中，所述內標為1,7-二氨基庚烷。優(yōu)選的，1,7-二氨基庚烷的終濃度為100mg/L。

本發(fā)明提供了一種魚肉及其制品中生物胺的檢測方法，結合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法構建了適用于魚肉及其制品中生物胺檢測的色譜條件以及梯度洗脫程序，實現(xiàn)了多種生物胺的最佳化分離；整個實驗過程無需對樣品進行凈化處理，衍生過程簡單，可減少有效成分的損失，使測量限達到μg/L級別，而且耗時短，可以實現(xiàn)大批量的樣品的檢測。

下面將結合本發(fā)明具體實施例對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發(fā)明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神，均應涵蓋在本發(fā)明保護的范圍中。

實施例1

1、生物胺標準品溶液的配制

精確稱取色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺等7種生物胺標準品適量，分別置于7個10mL規(guī)格的容量瓶中，然后加入0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，配制成濃度均為1000mg/L的單一生物胺標準品。然后分別吸取1.00mL的單一生物胺標準品，置于同一個容量瓶中，加入0.1mol/L的鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制終濃度為10mg/L的生物胺標準品溶液。

取0.5mL生物胺標準品，加入20μL的1,7-二氨基庚烷作為內標，混勻，使得內標的終濃度為100mg/L；然后加入1.5mL的飽和碳酸氫鈉溶液調節(jié)pH值至弱堿性，再加入1.0mL 10mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，振蕩使其混合均勻，并置于40℃培養(yǎng)箱中避光衍生化反應45min，中間振蕩兩次；待反應完全后取出，加入0.1mL 25％氨水暗處靜置30min，再60℃水浴15min以除去丙酮，冷卻至室溫后用乙腈定容至5mL，振蕩混勻，再用0.22μm有機膜過濾后采用RP-HPLC進行檢測。

2、木魚花提取液的制備及其生物胺柱前衍生化

準確稱取已絞碎的木魚花5.00g，加入10mL 5％三氯乙酸溶液和1.0mL濃度為100mg/L的1,7-二氨基庚烷作為內標，混勻，振蕩提取60min，轉移至25mL離心管中，3600r/min，取上清液。沉淀繼續(xù)置于25mL容量瓶中，如此連續(xù)提取兩次，合并上清液，然后用5％三氯乙酸稀釋至刻度，得到木魚花提取液。

將木魚花提取液采用0.45μm有機膜進行過濾，然后取0.5mL濾液，加入50μL 2mol/L的氫氧化鈉溶液中和濾液中的三氯乙酸，再依次加入1.5mL飽和碳酸氫鈉溶液、1.0mL 10mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，振蕩混合均勻，并置40℃培養(yǎng)箱中避光反應45min，中間振蕩兩次；待反應完全后取出，加入0.1mL25％氨水暗處靜置30min，再60℃水浴15min以除去丙酮，冷卻至室溫后用乙腈定容至5mL，振蕩混勻，再用0.22μm有機膜過濾后采用RP-HPLC進行檢測。

3、RP-HPLC分析檢測條件

色譜柱選擇C18柱(15mm×4.6mm，內徑5um)，紫外檢測波長設為254nm，進樣量10μL，柱溫40℃，流速1.0mL/min，流動相為0.1mol/L乙酸銨-乙腈；其中，0.1mol/L的乙酸銨水溶液作為流動相A，乙腈作為流動相B；梯度洗脫條件設置如表1。

表1

圖1為生物胺標準品溶液的RP-HPLC色譜圖；圖2為待測木魚花溶液的RP-HPLC色譜圖。通過對比圖1和圖2的各色譜峰的保留時間，對圖2出現(xiàn)的各色譜峰進行指認，發(fā)現(xiàn)圖3中保留時間為13-20min之間出現(xiàn)了4個色譜峰，分別對應圖2中的腐胺、尸胺、組胺和1,7-二氨基庚烷(內標)，說明待測木魚花溶液中存在腐胺、尸胺和組胺等3個生物胺；而且，這3個生物胺的色譜峰均實現(xiàn)了基線分離，說明本發(fā)明方法所提供的色譜條件以及梯度洗脫程序，可實現(xiàn)多種生物胺的最佳化分離，適用于魚肉及其制品中生物胺檢測，靈敏度較高。進一步的，通過內標法對這3種生物胺進行定量，得到腐胺、尸胺和組胺的含量依次為11.5785mg/kg、3.8112mg/kg、0.3378mg/kg，這3種生物堿的含量均超過(或低于)FDA限量標準50mg/kg，說明該木魚花產品是用新鮮的魚肉制成，可以放心食用。

對比例1

按照實施例1中步驟(1)配制內標濃度為5mg/L的生物胺標準品，采用以下RP-HPLC分析檢測條件進行檢測：

流動相A：0.1mol/L乙酸銨水溶液；

流動相B：純乙腈；

梯度洗脫程序設置如表2。

表2

圖3為采用本對比例所設置的梯度洗脫程序所得到的生物胺標準品溶液的RP-HPLC色譜圖，如圖3所示，該生物胺標準品中的7種生物胺基本上實現(xiàn)了基線分離，并在15-35min內均已出峰，溶劑峰與有效峰互不干擾，干擾峰少。然而，將其與圖1進行對比，保留時間接近的幾種生物胺仍無法實現(xiàn)基線分離，其分離效果不如圖1。說明采用實施例1中所設置的梯度洗脫程序能有效檢測魚肉制品中存在的各種生物胺。

對比例2

配制終濃度為10mg/L的生物胺標準品溶液

分別稱取色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺等7種生物胺，加入0.1mol/L的鹽酸溶液，混勻，得到濃度為100mg/L的生物胺標準品待測溶液。然后，按照國標GB/T 5009.208-2008所示步驟將該待測溶液凈化，按照實施例1所述方法采用丹磺酰氯柱前衍生法進行衍生處理后，采用RP-HPLC進行檢測。圖4為該生物胺標準品待測溶液的RP-HPLC液相色譜圖，如圖4所示，各生物胺的色譜峰峰形都不是很好，而且雜峰多，其中腐胺和尸胺這兩個色譜峰還沒有完全分開。同時，在萃取以及衍生過程一共要經過三次吹氮過程，實際操作中很容易將有效成分帶出，操作繁復，耗時較長，有機溶劑的消耗多。