本申請是申請?zhí)枮?01280017773.x，申請日為2012年2月10日，發(fā)明名稱為“檢測治療性外來體的方法”的中國專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及醫(yī)學、細胞生物學、分子生物學和遺傳學領域。本發(fā)明涉及醫(yī)學領域。
背景技術：
：：外來體一度被認為是細胞的“垃圾袋”，用來丟棄不需要的蛋白質1。然而，外來體越來越多地被認為具有重要的生理功能，尤其是在細胞通訊中。外來體是許多細胞類型都有分泌的50-100ηm的雙脂質膜泡2。它們屬于一類叫做微粒的分泌的細胞產物，其廣泛囊括了所有分泌的膜泡。除了外來體，微粒還包括微泡(100-1000ηm)、核外粒體(50-200ηm)、膜顆粒(50-80ηm)、外來體狀囊泡(20-50ηm)和凋亡囊泡(50-500ηm)。這些不同類別的微粒的主要區(qū)別參數(shù)是它們的大小，其中有最明確定義的類別是外來體。外來體在蔗糖中的密度為1.10至1.19克/毫升，在100,000g沉淀，具有富含膽固醇的脂質膜，其含有鞘磷脂、神經酰胺、脂筏和暴露的磷脂酰絲氨酸。外來體的生物合成是一個復雜的過程，涉及到通過生物合成和內吞途徑的復雜的細胞內膜運輸和物質分揀(cargosorting)。證實這種復雜生物合成的證據(jù)就是外來體的明顯特征是擁有內質網(wǎng)和核內體的標識，例如alix、tsg101、rab蛋白等等。外來體在通過多泡體(mvbs)與質膜融合而釋放之前存儲在多泡體內。外來體被發(fā)現(xiàn)調節(jié)細胞間通訊，特別是在免疫或腫細胞中3-8。最近，當本發(fā)明人公布了人esc起源的msc的外來體把心肌缺血再灌注(mi/r)受傷小鼠模型中的梗死面積減少約50％時，延伸此項功能到包括組織修復9，10。這些外來體是使用hplc上的尺寸排阻而純化為直徑約50-100ηm均勻大小的微粒，它們同時攜帶蛋白質和rna載荷9,11,12。然而，msc外來體的這種心臟保護作用的機制尚不確定。一部分原因可能是由于本發(fā)明人缺乏對外來體的一般生物效能的理解。盡管進行了大量針對來自各種細胞類型和生物液體的外來體的蛋白質組學和rna概況的分析，外來體的蛋白質和rna的生物效能在很大程度上仍然未被調查。截至目前，大多數(shù)生物效能的研究還局限在免疫細胞對外來體所作出的免疫反應上，特別是樹突細胞2，但這些生物反應的分子或生化基礎還沒有被闡明。技術實現(xiàn)要素：為了解決這個缺陷，本發(fā)明人對hplc純化的外來體進行了全面的蛋白組學分析來首先確定存在于這些外來體中的蛋白，然后使用這些蛋白質來預測外來體內生物活性或潛能的類型。這繼而通過生化或細胞測定而得以證實。總共檢測到了866個獨特的基因產物，它們可以根據(jù)功能分成32個過度代表的生物過程，這表明外來體有潛力發(fā)揮廣譜的生物化學或細胞作用。為了評估這種潛力，本發(fā)明人選擇了這些蛋白，對于這些蛋白，可以評估其生化和/或細胞活動的測定是可以獲得的且該測定的總和可以證實外來體廣譜的生物化學和細胞潛力，并提供對msc外來體的心臟保護性質的候選分子機理。這里考察的蛋白質包括分解葡萄糖以生成atp和nadh的糖酵解酶，增加糖酵解的pfkb3，水解amp為能夠通過腺苷受體激活信號級聯(lián)的腺苷的cd73，抑制膜攻擊復合物(mac)形成的cd59，和蛋白酶體20s。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明人提供了一種用于檢測治療性外來體的方法。該方法可以包括檢測外來體活性。該方法可以包括免疫調節(jié)活性。它可以包括補體抑制活性。它可以包括蛋白酶體活性。它可以包括糖酵解酶活性。它可以包括抗氧化活性。它可以包括細胞外基質(ecm)修飾活性。它可以包括nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性。它可能包括離子穩(wěn)態(tài)活性。它可以包括分子伴侶活性。它可包括上述的任何一個或多個活性?；钚钥梢园庖哒{節(jié)活性。免疫調節(jié)活性可以通過檢測表d10中列出的蛋白質的活性來檢測?；钚钥梢园ㄑa體抑制活性。補體抑制活性可以通過檢測表d1中列出的蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括蛋白酶體活性。蛋白酶體活性可以通過檢測表d2中列出的一個或多個，優(yōu)選全部蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括糖酵解酶活性。糖酵解酶活性可以通過檢測表d3中列出的一個或多個，優(yōu)選全部，蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括抗氧化活性。抗氧化活性可以通過檢測表d4中列出的一個或多個，優(yōu)選全部，蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括細胞外基質(ecm)修飾活性。細胞外基質(ecm)修飾活性可以通過檢測表d5中列出的一個或多個，優(yōu)選全部，蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性。nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性可以通過檢測表d6中列出的一個或多個，優(yōu)選全部，蛋白質的活性來檢測。該活性可以包括離子穩(wěn)態(tài)活性。離子穩(wěn)態(tài)活性可以通過檢測表d7中列出的一種或多種，優(yōu)選全部，蛋白質來檢測。該活性可以包括分子伴侶活性。分子伴侶活性可以通過檢測表d8中列出的一種或多種，優(yōu)選全部，蛋白質來檢測。該活性可以包括免疫調節(jié)活性。免疫調節(jié)活性可以通過檢測表d10中列出的一種或多種，優(yōu)選全部，蛋白質來檢測。如果一項活性被檢測到，外來體可能能夠抑制補體介導的細胞裂解。它也可以可替代的或可附加的，能夠減少梗死面積，例如在心肌缺血和再灌注損傷的小鼠或豬模型中檢測到的，或其能夠降低氧化應激，例如在過氧化氫(h2o2)誘導的細胞死亡的體外試驗中測定到的。它可以是上述兩個活動。如果一項活動被檢測到，外來體有可能包括一個具有治療活性的治療性外來體。該治療活性可以包括保護心臟的活性。該治療活性治療一個或多個疾病，其選自心力衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷和退行性疾病如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、癌癥、心肌梗死、皮膚創(chuàng)傷、皮膚失調、皮膚病變、皮炎、銀屑病、濕疣、尋常疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮膚癌、異位性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚t細胞淋巴瘤、潰瘍、特征是最初的損傷誘導導致炎癥和免疫失調導致慢性組織重組的病理狀況，包括纖維化和功能喪失，腎缺血性損傷，囊性纖維化，鼻竇炎和鼻炎或者骨科疾病。本發(fā)明的第二方面提供一種方法，其包括以下步驟：(a)從間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)中分離外來體，任選地，包括從其他組分中基于分子量、尺寸、形狀、組成或生物活性分離外來體，以及(b)檢測所分離的外來體中上述活性，優(yōu)選通過檢測上述一種或多種蛋白質的活性。本發(fā)明的第三方面提供生產外來體的方法，所述方法包括：(a)獲得間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)；(b)濃縮間充質干細胞條件培養(yǎng)物，例如用超過1000kda的膜進行超濾；(c)將濃縮的間充質干細胞條件培養(yǎng)物進行體積排阻色譜，如使用tskguard柱swxl，6×40mm，或tsk凝膠g4000swxl，7.8x300mm柱；(d)選擇uv吸收的部分，例如，在220nm處，表現(xiàn)出動態(tài)光散射，如由準彈性光散射(qels)檢測出的；其中，步驟(d)舉例包括通過保留時間為11-13分鐘，如12分鐘來洗脫收集組分；并且檢測外來體中上文所述的活性，優(yōu)選通過檢測一種或多種上文所述的蛋白質的活性。本發(fā)明的第四方面提供一種檢測外來體是否含有治療活性的方法，該方法包括檢測如上所述的酶活性，其中，如果檢測到酶活性，那么外來體包含治療活性。本發(fā)明的實施，除另有說明外，將會使用化學、分子生物學、微生物學、重組dna和免疫學的常規(guī)技術，其均在本領域普通技術人員的能力范圍內。這些技術在文獻中都有解釋。見，例如j.sambrook,e.f.fritsch和t.maniatis,1989,molecularcloning:alaboratorymanual,第二版，books1-3,coldspringharborlaboratorypress；ausubel,f.m.等人，(1995和周期性的補充；currentprotocolsinmolecularbiology,第9、13和16章,johnwiley&sons,newyork,n.y.)；b.roe,j.crabtree和a.kahn,1996,dnaisolationandsequencing:essentialtechniques,johnwiley&sons；j.m.polak和jameso’d.mcgee,1990,insituhybridization:principlesandpractice；oxforduniversitypress；m.j.gait(編輯),1984,oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,irlpress；d.m.j.lilley和j.e.dahlberg,1992,methodsofenzymology:dnastructureparta:synthesisandphysicalanalysisofdnamethodsinenzymology,academicpress；usingantibodies:alaboratorymanual:portableprotocolno.ibyedwardharlow,davidlane,edharlow(1999,coldspringharborlaboratorypress,isbn0-87969-544-7)；antibodies:alaboratorymanualbyedharlow(編輯),davidlane(編輯)(1988,coldspringharborlaboratorypress,isbn0-87969-314-2),1855。handbookofdrugscreening,由ramakrishnaseethala,prabhavathib.fernandes編輯(2001,newyork,ny,marceldekker,isbn0-8247-0562-9)；和labref:ahandbookofrecipes,reagents,andotherreferencetoolsforuseatthebench,由janeroskams和lindarodgers編輯,2002,coldspringharborlaboratory,isbn0-87969-630-3。全部這些文獻均通過引用并入本文。附圖說明圖1是一個圖解，其顯示先前在msc條件培養(yǎng)物里鑒定的739種蛋白與在純化的外來體中鑒定的866種蛋白質的交叉。圖2是一個圖解，其顯示外來體蛋白的蛋白質組分析。外來體中866種基因產物可以在功能上分成32個過度代表的生物過程和三個未被充分代表的生物過程(p<0.001)。421個在條件培養(yǎng)物(cm)中發(fā)現(xiàn)但不存在在于外來體中的蛋白按照功能分成11過度代表和2個未被充分代表的生物過程。黑條代表外來體中的基因產物的作用，白條代表在cm中找到但在外來體中未找到的基因產物的作用。圖3a至3d是顯示外來體調節(jié)糖酵解的示意圖。圖3a是糖酵解的示意圖。圖3b是條件培養(yǎng)物(cm)和外來體(exo)中磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)、磷酸甘油酸酯激酶(pgk)、丙酮酸激酶m2亞型(pkm2)和ppfkfb3的western印記分析。圖3c是msc外來體中gapdh、pgk和pkm2通過使用市售的測定試劑盒測定atp或丙酮酸的生產來測定的酶活性。一個單位(u)的酶活性被定義為在37℃下每分鐘產生1微摩爾產物。圖3d，外來體對寡霉素處理的細胞中atp生產的影響。h9c2心肌細胞用臺氏緩沖液(tyrode’sbuffer)洗滌兩次，然后在含有20μmol線粒體抑制劑、寡霉素、6mmol葡萄糖培養(yǎng)基，有或無0.1μg/ml外來體的臺氏緩沖液中孵育15分鐘、30分鐘和60分鐘。細胞atp濃度使用atplite1步發(fā)光atp檢測測定系統(tǒng)測量，并相對于沒有外來體、15分鐘處的樣品進行標準化。*p＝0.0173，**p＝0.0090圖4a和4b是顯示外來體中20s蛋白酶體的示意圖。圖4a，msc條件培養(yǎng)物(cm)和外來體(exo)使用特異于pmsa1-7肽的抗體的western印跡分析。圖4b，使用市售的蛋白酶體活性測定試劑盒(millipore)測定msc外來體中的蛋白酶體活性。蛋白酶體活性通過測量熒光探針肽在乳胞素(lactacystin)(一種蛋白酶體抑制劑)存在或不存情況下的降解速率來測量。一個單位(u)酶活性被定義為在37℃下每分鐘產生1μmol產物。*p＝0.00023圖5a至5c是顯示外來體通過nt5e(外生-5'-外核苷酸酶cd73)磷酸化erk和akt的示意圖。圖5a，使用特異性抗體針對msccm和外來體的cd73的western印跡分析。圖5b，條件培養(yǎng)基(cm)和外來體(exo)中cd73活性通過來源于amp水解的磷酸根離子的產生而測量。圖5c，h9c2細胞血清饑餓過夜，然后在有或沒有1mm茶堿的培養(yǎng)基中溫育一小時。然后將細胞在已用50μm的amp、0.1μg/ml外來體或amp和外來體預是溫育30分鐘的培養(yǎng)基中暴露5分種。然后將這些細胞收獲并裂解。將10μg的總蛋白用1:2000稀釋的兔抗perk的1/2、1:2000稀釋的兔抗erk1/2、1:500稀釋的兔抗pakt或1:500稀釋的兔抗akt進行免疫印記。圖6a至6b是顯示外來體抑制膜攻擊復合物(mac)形成的示意圖。圖6a，msc條件培養(yǎng)物(cm)和外來體(exo)用cd59特異性抗體進行的western印跡分析。圖6b，洗滌srbc，然后重新懸浮于含有c5b6和c7的pbs中，存在或不存在外來體。將混合物在37℃下溫育15分鐘，然后加入c8和c9，用或不用封閉cd59抗體來另外溫育30分鐘。將細胞離心，由裂解的srbc釋放在上清液中的血紅蛋白量通過415nm處的吸光度而測量。陽性對照(總溶血)是用tritonx–100完全裂解的細胞的上清液。陰性對照是不加補充成分的樣品。陽性對照的吸光度值歸一化到100％*p＝2.8e-06，**p＝3.51e-08。圖7是顯示msc外來體具有tlr配體的示意圖。圖8是顯示msc外來體不激活tlr2的示意圖。圖9是顯示msc外來體激活tlr4的示意圖。圖10是顯示msc外來體誘導thp-1細胞的促炎性細胞因子和抗炎性細胞因子的生產的示意圖。圖11a和11b是顯示cd4+小鼠t細胞誘導分化成treg(a)或th17(b)細胞的的示意圖。圖12a和圖12b是顯示通過先天免疫調節(jié)適應性免疫的示意圖。圖13是顯示外來體的伴刀豆球蛋白a激活的淋巴細胞增殖試驗的示意圖。具體實施方式哺乳動物細胞分泌含有蛋白質和rna的外來體。可以假設，可以從健康的細胞中收獲和純化這些外來體用于補充和支持患病或不良細胞中的細胞資源，使這些細胞開始恢復和修復。例如，本發(fā)明人已經證明，從人類胚胎干細胞來源的間充質干細胞獲得的外來體可以挽救急性心肌缺血-再灌注損傷后的心肌細胞免于細胞死亡。在這里，本發(fā)明人描述了這些外來體的生化性質。這些性質可以用來識別、選擇或評估外來體制劑用于治療病變的或不良細胞的治療潛力。處于作為損傷或疾病后果的苦惱中的細胞往往有著相似的細胞功能障礙。它們增加的線粒體膜通透性造成了atp和nadh生產的減少，ros水平增加和離子穩(wěn)態(tài)的喪失，包括na、ca、k和cl。也有由于變性蛋白質的積累導致的er應激、包涵體形成和過度先天免疫反應。為了開始恢復和修復的過程，細胞必須首先糾正這些細胞功能障礙。由于外來體是含有蛋白質和rna的分泌的磷脂囊泡，它們有傳遞可以迅速啟動必要的細胞活性以糾正這些細胞功能障礙的酶和rna的潛能。在這里，本發(fā)明人描述了治療性外來體的生化性質。這些生化性質包括a.補體活性的抑制(下表d1)b.降解變性蛋白質的蛋白酶體活性(下表d2)c.生成atp和nadh的糖酵解酶(下表d3)d.生成nadph的戊糖磷酸途徑的酶e.抗氧化活性(下表d4)f.mmp/timp活性(下表d5)g.激活生存信號通路的cd73外生-5'外核苷酸酶活性(下表d6)h.恢復離子穩(wěn)態(tài)的atp酶膜通道或轉運通道，如鈣、鈉、質子、鉀和氯通道(下表d7)i.保持蛋白質結構完整性的分子伴侶活性(下表d8)潛在的治療性外來體不應該只有具有這些生化活性的蛋白質，蛋白質還必須具有酶活性。因此，這些蛋白質的酶活性成為代替外來體制劑的治療功效的替代標記。本發(fā)明人因此提供了大量用于定義、鑒別和評估治療性外來體的生化測定。檢測治療性外來體本發(fā)明人描述了衍生自間充質干細胞(msc)的顆粒，例如外來體的生物學性質，特別是生化性質。根據(jù)這里描述的方法和組合物，外來體包括以下一個或多個：(a)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(c)糖酵解酶活性，(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ecm)修飾活性；(f)nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性；(g)離子穩(wěn)態(tài)活性；(h)分子伴侶活性，可以包括治療活性，以及(i)免疫調節(jié)活性。一種包含這樣性質的外來體可以自然治療一些疾病，如下所述，換言之，是一種治療性外來體。術語“外來體”在本文檔中的使用在上下文允許的情況下應該被理解為包括“治療性外來體”。外來體可以通過幾種手段的任何一種從msc中獲得，例如通過從msc分泌、出芽或散布。例如，外來體可以從msc生產、滲出、發(fā)射或脫落。如果是細胞培養(yǎng)中的msc，外來體可被分泌到細胞培養(yǎng)基中。外來體可特別包括囊泡。這里所描述的治療性外來體可以包括本文所描述的外來體的任何一個或多個性質。外來體可以包括由脂雙層限制的囊泡或扁平球體。外來體的可包括40-100nm的直徑。外來體可以通過核內體膜的向內出芽形成。外來體可以具有～1.13-1.19克/ml的密度，并在蔗糖梯度上漂浮。外來體富含膽固醇和鞘磷脂，如gm1、gm3、浮艦蛋白(flotillin)和src蛋白激酶lyn的脂筏標記。外來體可以包括一種或多種存在于間充質干細胞或間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)中的蛋白質，如一個擁有msc或msc-cm的特征的或者特異于msc或msc-cm的蛋白質。本發(fā)明人提供了一個外來體，其包括在msc中發(fā)現(xiàn)的或是在通過培養(yǎng)msc而條件化的介質中發(fā)現(xiàn)的一個或多個含有治療活性的基因。這樣的治療性外來體可以通過檢測顯示一個或多個活性的外來體來鑒別，這些活性選自：a)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(c)糖酵解酶活性；(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ecm)修飾活性；(f)nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性；(g)離子穩(wěn)態(tài)活性；(h)分子伴侶活性；以及(i)免疫調節(jié)活性。外來體可以包括由msc分泌的分子。這樣一個外來體和包含在其中的分子的任何分子組合(包括特定的蛋白質或多肽)可以被用于補充msc或被msc條件化的培養(yǎng)物的活性或者代替msc或被msc條件化的培養(yǎng)物，以用于例如治療或預防疾病的目的。外來體可能包括在細胞骨架中發(fā)現(xiàn)的細胞溶質蛋白，如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白，細胞內的膜融合和運輸，如膜聯(lián)蛋白和rab蛋白，信號轉導蛋白，如蛋白激酶、14-3-3和異三聚體g蛋白，代謝酶，如過氧化物酶、丙酮酸和脂質激酶和烯醇化酶-1，以及四跨膜蛋白家族，例如cd9、cd63、cd81和cd82。特別是，外來體可以包括一個或多個四跨膜蛋白。外來體可以包括mrna和/或microrna。術語“顆?！?，其包括外來體，在本文中的使用可以被解釋為一個獨立的實體。所述顆?？梢允菑拈g充質干細胞(msc)或間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)分離出來的物質。該顆?？梢载撠熤辽僖粋€msc或msc-cm活性。該顆?？韶撠?，并執(zhí)行，實質上大部分或所有的msc或msc-cm的功能。例如，該顆?？梢允莔sc或msc–cm的替代品(或生物替代品)。當術語“顆?！痹诒疚闹惺褂脮r，其應被理解為包括(只要情況允許)外來體的同義詞。外來體可用于msc或msc-cm可被投入使用的任何治療目的。外來體優(yōu)選具有至少一個間充質干細胞的性質，例如治療性質。外來體可以具有生物性質，例如生物活性。外來體可以具有msc的任何生物活性。例如，外來體可以具有msc的治療或恢復活性。已知使用msc條件化的介質(如間充質干細胞條件化的培養(yǎng)物或msc–cm，如下所述)包括msc的生物活性，能夠替代msc本身-參見例wo2009/105044。因此，msc的生物學性質或生物活性可能對應于經過間充質干細胞條件化的培養(yǎng)物的生物性質或活性。因此，外來體可以包括間充質干細胞條件化的培養(yǎng)物(msc-cm)的一個或多個生物性質或活性。這里所描述的治療性外來體可能從間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)中分離出來，并檢測以下一種或多種活性的存在：(a)補體抑制活性；(b)蛋白酶體活性；(c)糖酵解酶活性；(d)抗氧化活性；(e)細胞外基質(ecm)修飾活性；(f)nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性；(g)離子穩(wěn)態(tài)活性；(h)分子伴侶活性；以及(i)免疫調節(jié)活性?；钚詸z測每一種上述活性均可以在治療性外來體中通過本領域中已知的多種方式進行檢測。例如，相關活性可以通過檢測負責治療性外來體活性的蛋白質或多肽的存在來檢測。這可以通過例如使用同源抗體和本領域已知的免疫測定法和western印跡等檢測抗體和蛋白質之間的結合實現(xiàn)。概言之，1個酶活性單位(u)定義為每分鐘生產1微摩爾產品所需的活性。檢測活性的western印記方案一個使用western印跡雜交經由蛋白質或多肽檢測活力的范例方案載列如下。在4-12％sds-聚丙烯酰胺凝膠上分離12μg外來體，電轉染到硝酸纖維素膜上。把膜轉移到snapi.d.系統(tǒng)(milliporeinc.，billerica，ma)的膜支架中，封閉并和抗人一抗一起溫育，抗人一抗包括小鼠抗gapdh(1:100稀釋)，小鼠抗pgk(1:60)，小鼠抗pgd(1:60)，兔抗pfkfb3(1:60)，小鼠抗丙酮酸激酶(pk，1:200)，小鼠抗20s蛋白酶體α1-7(1:200)，小鼠抗cd73(1:60)和小鼠抗cd59(1:200)。然后，印跡與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體一起孵育。所用的第二抗體是山羊抗小鼠igg(1:1250)或驢抗兔igg(1:1250)。所有的抗體均獲得自santacruzbiotechnology,santacruz,ca,除鼠抗pk購自abcaminc.,cambridge,ma外。然后將印跡與hrp-增強的化學發(fā)光底物(thermofisherscientificinc.,waltham,ma)一起孵育，然后曝光于x射線膠片。液相色譜-質譜(lcms)或質譜(ms)也可以使用如質譜的其他方法來檢測存蛋白質或多肽在外來體中的存在。lcms在“basicsoflc/msprimer”(agilenttechnologies)文件中有詳細說明，網(wǎng)址為http://www.chem.agilent.com/library/support/documents/a05296.pdf使用液相色譜-質譜(lcms)或質譜(ms)的一個范例方案載列如下。根據(jù)描述(20)，將兩毫升透析的外來體中的蛋白質進行還原、烷基化和胰蛋白酶消化。然后，通過將消化的混合物通過條件化的sep-pakc-18spe柱(waters,milford,ma,美國),并用3％的乙腈(acn)(jtbaker,phillipsburg,nj)和0.1％甲酸(fa)緩沖液清洗兩次，并用70％acn和0.1％fa緩沖液洗脫將樣品進行脫鹽。然后，將洗脫下來的樣品通過真空離心除去有機溶劑干燥至約10％的其初始體積。為了減少樣品的復雜性，通過一個配置了polysulfoethylscx柱(200mm×4.6mm(polylc,美國)的hplc系統(tǒng)(shimadzu,日本)進行了離線肽分餾。流動相a(5mmkh4po4+30％乙腈)和流相b(5mmkh4po4+30％乙腈+350mmkcl)，1ml/min。收集8個餾分，并用真空離心干燥。分級的樣品被裝入到shimadzumicrohplc系統(tǒng)的自動進樣器，shimadzumicrohplc系統(tǒng)在線連接到配備了納米噴霧源(nanospraysource)的ltqft超線性離子阱質譜儀(thermoelectron,bremem,德國)。注射入的肽陷入zorvax300sb-c18富集柱中(5mmx03mm,agilenttechnologies,德國)并在其中脫鹽，并且洗脫進入納米鉆孔的c18填充柱(michrombioresources,auburn,ca)。使用分流器(splittertoanmminute)以恒定流速20ηl/min到有效流速200ηl/min的90l/min梯度洗脫進入質譜儀的肽。以數(shù)據(jù)依賴模式、通過進行ftms中來自于每一個ms掃描的最強烈的峰中的八個峰的ms/ms掃描來操作ltq。對于每個實驗，都通過一個自己編寫(home-written)的程序把八個scx組分的ms/ms(dta)譜合并成一個單一的mascot通用文件。蛋白質鑒定通過內部的mascot服務器(版本2.2.04,matrixscience,英國)在ipi人類蛋白質數(shù)據(jù)庫(版本3.34；69,164條序列,29,064,825個殘基)中搜索合并后的數(shù)據(jù)獲得。搜索參數(shù)是：使用胰蛋白酶的2個錯過的分裂的最大值；固定的修飾是半胱氨酸的氨甲酰甲基化修飾，可變修飾是蛋氨酸的氧化。肽前體和片段離子的質量公差分別設定為10ppm和0.8da。如果發(fā)現(xiàn)兩個不同的肽具有高于同源性得分的得分，蛋白質鑒定接受為真陽性。補體抑制活性治療性外來體中補體抑制活性可以通過檢測蛋白質的任一個或多個或它們的活性來檢測，例如表d1中所列出的，借此鑒定它們?yōu)橹委熜酝鈦眢w。表d1表d1。補體抑制活性另外可選的，或額外的，補體介導的細胞裂解活性可通過進行下述測定進行檢測。補體介導的細胞裂解實驗簡單地說，購買來的綿羊紅細胞(srbc)(innovativeresearch,southfield,mi)用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)洗滌三次，然后以1×108細胞/ml重懸在pbs中。純化的補體成分，c5b6，c8和c9均購自calbiochem(sandiego,ca)且c7購自sigma-aldrich(stlouis,mo)。完整的c5b-9在srbc上的裝配通過在存在或不存在終濃度為0.1μg/ml的外來體的1ml的c5b6(0.1μg/ml)和c7(0.4μg/ml)的每一種溫育15分鐘(37℃)后開始的。然后洗滌srbc，用1ml的c8(0.4μg/ml)加c9(0.4μg/ml)、加入或沒加入最終濃度為0.05μg/ml的封閉cd59抗體的每一種再培養(yǎng)30min。之后，離心srbc，上清液中由裂解的srbc釋放的血紅蛋白量由415nm處的吸光度測量?？?100％)溶血可以通過用1％(w/v)tritonx-100處理細胞得到。蛋白酶體活性治療性外來體中的蛋白酶體活性可通過檢測載于表d2中的蛋白質的任何一個或多個或它們的活性來檢測，從而鑒定它們是否是治療性外來體。表d2表d2。蛋白酶體活性另外可選的或額外的，蛋白酶體活性也可以通過進行下述檢測進行檢測。20s蛋白酶體檢測蛋白酶體活性的測定是在存在或不存在乳胞素(特定的20s蛋白酶體抑制劑)時，由20s蛋白酶體從標記的底物llvy-amc上的裂解之后，使用20s蛋白酶體活性測定試劑盒(milliporeinc)，基于檢測熒光團7-氨基-4甲基香豆素(amc)而進行。簡單地說，4μg外來體在25μm乳胞素存在或不存在的條件下和含有l(wèi)lvy-amc的反應緩沖液溫育。樣品和amc標準在37℃下孵育且在ex/em＝380/460nm的熒光強度的被監(jiān)測2小時。單位活性定義20s核心顆粒的1單位酶活性定義為每分鐘生產1微摩爾的產品所需的活性。發(fā)現(xiàn)外來體含有5.0μu20s核心顆?；钚?μg蛋白。糖酵解酶活性外來體中的糖酵解酶活性可以通過檢測表d3中列出的一個或多個蛋白質或它們的活性來檢測，從而確定它們能否是治療性外來體。表d3表d3。糖酵解酶活性*應理解，atp和nadh不是蛋白質。然而，它們可以被檢測，以檢測外來體中糖酵解酶活性，因此，可以用來建立外來體是否是治療性外來體。相似的，atp和nadh在細胞中的還原(roduction)(或兩者)的檢測也可以使用(見上文)。因此，應當理解，在本文的背景下，術語“蛋白質”或“多肽”可以包括如atp和nadh的小分子。不應將不利的含義聯(lián)系到表格標題“蛋白質”(或本文檔中的其他地方)下的實體檢測的引用中，其中實體不是蛋白質物，而實際上是其他類型的實體，例如小分子。因此，本文中的某些表格的標題和其他參考(例如，表d3)為方便起見可能引用“蛋白質”名稱的物質，但可能包括對atp、nadh等(其中這些實體實際上都不是蛋白質)的引用。正如上文所述，這些實體的測定可用于測定治療性外來體。此外，由于糖酵解酶活性可能會被轉移到暴露于外來體的細胞，導致增加的atp和nadh的生產，檢測細胞的atp或nadh的生產(或兩者)可以作為檢測在產生的外來體中糖酵解酶活性的一種手段，從而確定它是否是治療性外來體。丙酮酸激酶檢測用細胞提取試劑盒(biovision,mountainview,ca)裂解5μg(在12μl中)外來體。裂解的外來體提取物和50μl的市售pk測定試劑盒(biovision)反應混合物一起溫育。在這個檢測中，通過pk產生的丙酮酸經丙酮酸氧化酶氧化產生熒光(ex/em＝535/587nm)。因此，熒光強度增加和產生的丙酮酸的量成比例。gapdh和pgk檢測gapdh和pgk活性通過使用兩個市售試劑盒，kdalertgapdh檢測試劑盒(ambioninc.,austin,tx)和aposensoradp/atp比率檢測試劑盒(biovision)基于糖酵解反應中其下游產品，atp而測量。簡單地說，使用細胞提取試劑盒(biovision)裂解外來體。為了測量gapdh活性，10μg的裂解后的外來體被加到含有d-甘油醛-3-磷酸，nad+和pi的kdalert反應緩沖液中形成1，3-二磷酸甘油酸酯+nadh+h+。然后，加入250u/ml的pgk和60μmadp，從而轉換1，3-二磷酸甘油酸酯和adp為3-磷酸甘油酸酯和atp。產生的atp量和gapd活性成比例，然后使用atp熒光素酶檢測進行測量。為了測量pgk活性，10μg的裂解的外來體被加入上面的檢測產生的1，3-二磷酸甘油酸酯。添加adp從而允許atp的形成。atp量和pgk活性成比例，然后使用atp熒光素酶檢測進行量化?；谔墙徒饧毎臋z測h9c2心肌細胞以每孔30000個細胞的密度接種到96孔板中(多聚賴氨酸包被的)。5小時后，將細胞用臺氏緩沖液洗滌兩次，然后在含有20μmol寡霉素(sigma-aldrich)、6mmol葡萄糖、有或無0.1μg/ml外來體的臺式緩沖液中溫育15分鐘、30分鐘和60分鐘。細胞atp濃度使用atplite1步發(fā)光atp檢測分析系統(tǒng)進行測量(perkinelmer,zaventem,比利時)。單位活性定義1個單位的gapdh(af261085.1)的酶活性定義為每分鐘生產1微摩爾產品所需的活性。發(fā)現(xiàn)外來體含有1.1μu的gapdh活性/μg蛋白質，3.59μu的pgk(l00159.1)活性/μg蛋白質和5.5μupkm2(m23725.1)活性/μg蛋白?？寡趸钚灾委熜酝鈦眢w中的抗氧化活性可以通過檢測載于表d4中的任何一個或多個的蛋白質或它們的活性來檢測，從而確定它們是否為治療性外來體。表d4表d4?？寡趸钚约毎饣|(ecm)修飾活性在治療性外來體中的細胞外基質(ecm)修飾活性可通過檢測載于表d5中的任何一個或多個蛋白質或它們的活性來檢測，從而確定它們是否為治療性外來體。表d5表d5。細胞外基質(ecm)修飾活性nt5e(cd73)外生-5’-外核苷酸酶活性在治療性外來體中的nt5e(cd73)外生-5’-外核苷酸酶活性可以通過載列于表d6的任何一個或多個蛋白質或它們的活性測試，從而確定它們是否為治療性外來體。此外，在amp存在條件下將細胞暴露于有nt5e(cd73)外生-5’-外核苷酸酶活性的外來體會誘導akt和erk1/2的磷酸化，外來體中或外來體的磷酸化的akt(即，磷酸化的akt1，磷酸化的akt2或磷酸化的akt3)或磷酸化的erk1或磷酸化的erk2(或這些的任何組合)的檢測可以用作檢測外來體中nt5e(cd73)外生-5’-外核苷酸酶活性的一種手段，從而測定它是否是治療性外來體。表d6表d6。nt5e(cd73)外生-5'-外核苷酸酶活性cd73檢測在外來體中的cd73(nt5e)酶活性通過將2.5μg外來體在ph7.4的含有50μmamp(sigma-aldrich,stlouis,mo)的100μltris緩沖液中孵育而測量。然后用colorlock金試劑盒((innovabiosciences,cambridge,英國)按照廠家說明書測定從amp水解釋放的磷酸根離子的量。單位活性定義1單位外生-5’-外核苷酸的酶活性定義為每分鐘生產1微摩爾產品所需的活性。發(fā)現(xiàn)外來體含有22.04μu外生-5’-外核苷酸酶活性/μg蛋白。離子穩(wěn)態(tài)活性治療性外來體中的離子穩(wěn)態(tài)活性通過檢測載于表d7中的任何一個或多個的蛋白質或它們的活性來測定，從而確定它們是否為治療性外來體。表d7表d7。離子穩(wěn)態(tài)活性分子伴侶活性治療性外來體中的分子伴侶活性通過檢測載于表d8中的任何一個或多個的蛋白質或它們的活性來檢測，從而確定它們是否為治療性外來體。表d8表d8。分子伴侶活性免疫調節(jié)活性治療性外來體可顯示免疫調節(jié)活性。先天免疫細胞的適應性免疫調節(jié)(綜述1-3)免疫系統(tǒng)的存在主要為了通過摧毀非自身的細胞或組織、中和傳染性或有毒物質并去除細胞碎片如死亡或瀕死細胞來保護生物體抵御疾病。在脊椎動物中，免疫系統(tǒng)由先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)組成。先天免疫細胞包括樹突狀細胞、巨噬細胞和嗜中性細胞，且這些細胞被遺傳編程以識別傳染性/有毒材料、應激信號、死亡/瀕死細胞或者非自身細胞的不變特征。它是進化上保守的，并提供了第一道防線。適應性免疫細胞是t和b淋巴細胞。它們適應每一種外來的、有毒的或非自身的物質，通過從頭產生針對這些材料的特異性受體來靶向中和或摧毀它們。另一方面，先天免疫細胞識別微生物病原體內的保守分子標識，被通常稱為病原體相關分子模式和如通過生殖編碼模式識別受體(ppr)的應激信號，如包括toll樣受體(tlr)、視黃酸誘導基因1樣rna解旋酶、核苷酸結合低聚域樣受體和c型凝集素受體。激活適應性免疫細胞來產生特異性針對傳染性或毒性劑的受體是復雜的，并由先天免疫細胞調控。在ppr中，tlr是關于適應性免疫反應調節(jié)的、得到最好特征描述的ppr，如igm、igg和iga抗體的生產，和th1，th17，cd4+以及cd8+t細胞的激活。tlr是高保守的1型整合膜糖蛋白。在人類中，截至目前已經發(fā)現(xiàn)10個tlr。所有的tlr，除tlr3外，均通過myd88依賴性途徑直接或與tirap組合發(fā)出信號，最終導致nfκb、激活蛋白1(ap1)或兩者的激活和核轉位，從而導致生產炎性細胞因子。tlr3和tlr4啟動myd88獨立、trif依賴信號通路，從而導致nfκb或irf3的激活和核轉位，分別產生炎癥細胞因子和i型干擾素。不同的tlr識別不同類別的病原體相關分子模式，例如tlr4識別細菌細胞表面脂多糖，tlr1和tlr2識別肽聚糖，tlr2和tlr6識別脂蛋白，tlr3識別病毒雙鏈rna，tlr7和tlr8識別病毒單鏈rna，tlr9識別細菌和病毒的cpg，tlr5識別鞭毛蛋白。tlr的內源性配體(綜述4)盡管tlr在調節(jié)宿主對傳染性物質及其產品的免疫有壓倒性的重要性，內源性配體激活tlr信號觸發(fā)無菌炎癥反應正日益被視為tlr的重要功能。迄今為止，許多不同的tlr的內源性配體已被確定(下面的表d9)。tlr被發(fā)現(xiàn)和缺血和再灌注損傷、組織修復和再生、自身免疫性疾病和腫瘤發(fā)生和腫瘤進展有關。表d9。tlr和其內源性配體。下劃線標出的配體發(fā)現(xiàn)也存在于msc外來體中。msc的免疫調節(jié)活性msc在體外顯示出免疫調節(jié)性質，如抑制同種抗原、有絲分裂原和cd3連接誘導的t細胞增殖，抑制b細胞增殖和天然殺傷細胞的活性5。測試基于msc的干預治療人類gvhd6和克羅恩病7的療效的臨床試驗令人鼓舞。然而，msc的免疫調節(jié)性質的基本機制仍然知之甚少。越來越多地，認為這些性質是由msc旁分泌介導的。在2008年，本發(fā)明人的小組證實，經過人類胚胎干細胞起源的msc(hesc-msc)條件化的培養(yǎng)物可以縮小缺血/再灌注損傷的豬和老鼠模型的梗死面積9，改善慢性缺血的豬模型中的心臟功能10，且活性成分具有50-200nm的假定直徑。此成分隨后經hplc純化，確定為外來體11。蛋白質組分析顯示，這些外來體包含tlr2和tlr4的內源性配體(表1)。因此，msc外來體有激活tlr2和tlr4和促進msc的免疫調節(jié)活性的潛力。治療性外來體中的免疫調節(jié)活性可通過檢測載于表d10中的任何一個或多個蛋白質或它們的活性來測定，從而確定它們是否為治療性外來體。表d10間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)條件細胞培養(yǎng)物，例如間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)，可通過在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質干細胞(msc)或其子代或由其衍生的細胞系；并分離所述細胞培養(yǎng)物而獲得。間充質干細胞可通過以下方法生產，所述方法包含通過分散胚胎干(es)細胞集落獲得細胞。所述細胞或其子代，可在包含fgf2的無血清培養(yǎng)基中，在沒有共培養(yǎng)的條件下增殖。可通過多種方法生產或分離外來體。此類方法可包括從間充質干細胞(msc)分離外來體。此類方法可包括從間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)分離外來體。例如，可基于外來體的任何性質，將外來體與非相關組分分離。例如，可基于分子量、大小、形狀、組分或生物活性分離外來體。例如，如本文他處用于分子量測試所述的，可使用由適合的截斷分子量或大小的膜的過濾。在間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)的分級期間，可使用外來體的一種或多種生物活性追蹤其活性。免疫調節(jié)活性測試可使用thp-1細胞和遺傳修飾的thp-細胞系/hek報告細胞系評估外來體的免疫調節(jié)活性。此類細胞系描述于下文的實施例中?？墒褂梦葱揎椀膖hp-1細胞，通過評估外來體誘導細胞因子產生的能力來評估外來體的免疫調節(jié)活性。這詳細描述于下文的實施例23中?；蛘?，可使用實施例中所述的替代報告細胞系評估細胞因子產生。例如，如實施例19中所述，可使用具有在nf-kb啟動子的轉錄控制下的穩(wěn)定轉染的分泌型胚胎堿性磷酸酶(seap)報告基因的thp1-xblue，或者myd88活性缺陷的thp1-xblue-defmyd。還可通過其抑制伴刀豆球蛋白a-激活的淋巴細胞的增殖的能力來評估外來體的免疫調節(jié)活性。這詳細描述于下文的實施例28中。還可使用評估外來體的免疫調節(jié)活性的其他方法。這些包括使cd4+t細胞暴露于外來體處理的單核細胞，例如thp-1，以測定其是否增強tregs或th17產生。這詳細描述于下文的實施例26中。外來體性質間充質干細胞的性質可包括間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)的性質。據(jù)稱產生此類間充質干細胞條件培養(yǎng)物的方法是本領域已知的，并且描述于例如wo2009/105044的實施例1中。所述性質可包括生物性質，例如生物活性。生物活性的實例包括心臟保護作用，降低氧化應激和減少梗死大小。心臟保護作用外來體，特別是治療性外來體，可具有包括心臟保護作用間充質干細胞和/或間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)的性質。所述心臟保護作用可包括在缺血和/或再灌注期間心臟功能的恢復或維持。心臟保護作用的測試心臟保護作用可使用例如wo2009/105044的實施例5、10、14和20中所述的方法的任意一種或多種進行測試。氧化應激外來體，特別是治療性外來體，可具有包括減少氧化應激(或細胞保護作用)的能力的間充質干細胞和/或間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)的性質。氧化應激的測試氧化應激的降低可使用例如過氧化氫(h2o2)誘導的細胞死亡的體外測試進行測試?？傊?，在人白血病cem細胞中誘導過氧化氫(h2o2)介導的氧化應激，并通過臺盼藍-排除監(jiān)測細胞生存性。將人白血病cem細胞與外來體、條件培養(yǎng)物或間充質干細胞(帶有作為對照的鹽水)一起溫育，并使用50μmh2o2處理以誘導氧化應激。在h2o2處理后12、24、36和48小時，使用臺盼藍-排除評估細胞生存性。氧化應激的降低可進一步使用dna氧化的體內測試進行測試。體內氧化應激還可按如下測試。使用外來體、條件培養(yǎng)物或間充質干細胞(帶有作為對照的鹽水)處理豬。獲取豬心臟的組織切片。通過氧化的dna的8-ohdg免疫染色量化經處理和未處理的豬的組織切片中的核氧化應激。測試組織切片的強烈核染色指明了dna氧化和氧化應激。梗死大小外來體，特別是治療性外來體，可具有包括減少梗死大小的能力的間充質干細胞和/或間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)的性質。梗死大小的測試梗死大小可使用例如wo2009/105044的實施例6和13中所述的方法的任意一種或多種進行測試。外來體大小外來體可具有大于100kda的分子量。其可具有大于500kda的分子量。例如，其可具有大于1000kda的分子量。可通過各種方式測定分子量。原則上，可通過大小分級以及通過具有相應截斷分子量的膜的過濾測定分子量。隨后，可通過跟蹤由sds-page分離的組分蛋白，或通過生物測試測定外來體的大小。通過hplc動態(tài)光散射測定外來體大小儀器裝備由在來自shimadzucorporation(kyoto,日本)的vp類軟件操作下的帶有二元泵、自動注射器、恒溫柱加熱爐和uv-可見光檢測器的液相色譜系統(tǒng)組成。所使用的色譜柱是來自tosohcorporation(tokyo,日本)的tskguard柱swxl，6x40mm和tsk凝膠g4000swxl，7.8x300mm。以下檢測器，dawn8(光散射)、optilab(折射率)和qels(動態(tài)光散射)串聯(lián)在uv-可見光檢測器之后。后3個檢測器來自wyatttechnologycorporation(california,美國)，并由astra軟件操作。通過大小排除分離樣品組分，即較大的分子在較小分子之前洗脫。所述使用的洗脫緩沖液是具有150mmnacl的20mm磷酸緩沖液，ph7.2。將此緩沖液通過0.1μm的孔徑過濾，并在使用前脫氣15分鐘。以0.5ml/min的流速平衡色譜系統(tǒng)，直到dawn8中的信號穩(wěn)定在約0.3檢測器電壓單位。uv-可見光檢測器設置在220ηm，并將柱爐平衡至25℃。洗脫模式為等度，并且運行時間為40分鐘。樣品的注射體積在50至100ml的范圍。外來體的峰與所有其他峰相比的面積％由uv-可見光檢測器積分計算。通過qels和dawn8檢測器計算水力半徑rh。取峰頂?shù)淖罡哂嫈?shù)率(hz)為rh。收集在220ηm顯現(xiàn)的分離組分的峰作為用于進一步表征研究的分離物。通過sds-page測定分子量外來體可具有大于100kda的分子量。例如，外來體可以如此，以在進行過濾時，使具有小于100kda分子量的外來體的大部分蛋白分離到大于100kda分子量的保留物中。類似地，在使用500kda截斷值的膜進行過濾時，具有小于500kda分子量的外來體的大部分蛋白分離到大于500kda分子量的保留分離物中。這表明外來體可具有大于500kda的分子量。通過生物活性測定分子量外來體可具有大于1000kda的分子量。例如，外來體可以如此，以在使用截斷分子量為1000kda的膜進行分離時，使相關生物活性基本或主要保留在保留分離物中。可選地或此外，生物活性可不存在于濾液分離物中。生物活性可包括本文他處所述的外來體的任何生物活性。通過梗死大小測定分子量例如，生物活性可包括，如在心肌缺血和再灌注損傷的任何適合模型中測定的，梗死大小的減少。例如，如wo2009/105044的實施例中所述，在小鼠或豬模型中測試生物活性?？傊?，通過由縫合結扎的30分鐘左冠狀動脈(lca)梗塞誘導心肌缺血，并通過去除縫合發(fā)動再灌注。在再灌注之前5分鐘，通過尾靜脈經靜脈內使用包含外來體的液體(例如，未分離的msc-cm)、濾液(例如<100或1,000kd的分離物)、保留物(例如>1000kd的分離物)或鹽水處理小鼠。24小時后，切除心臟。在切除前，通過再啟動lca，隨后通過主動脈灌注evans藍，測定危險區(qū)面積(aar)。aar定義為沒有被染料染色的面積，并且表示為左室壁面積的百分比。使用evans藍和ttc，在24小時后評估梗死大小。當使用間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)和保留物(例如>1000kd)分離物處理的動物中的相對梗死大小在與鹽水相比顯著減少時，這表明外來體具有高于膜的相對截斷值的分子量(例如，大于1000kda)。外來體分子量外來體可具有大于2ηm的大小。外來體可具有大于5ηm、10ηm、20ηm、30ηm、40ηm或50ηm的大小。外來體可具有大于100ηm的大小，例如大于150ηm。外來體可具有實質上200ηm或更大的大小。外來體可具有一定范圍的大小，例如2ηm至20ηm，2ηm至50ηm、2ηm至100ηm、2ηm至150ηm或2ηm至200ηm之間。外來體可具有20ηm至50ηm、20ηm至100ηm、20ηm至150ηm或20ηm至200ηm之間的大小。外來體可具有50ηm至100ηm、50ηm至150ηm或50ηm至200ηm之間的大小。外來體可具有100ηm至150ηm或100ηm至200ηm之間的大小。外來體可具有150ηm至200ηm之間的大小?？赏ㄟ^各種方式測定大小。原則上，可通過大小分級，以及通過具有相應截斷分子量的膜的過濾測定大小。隨后，可通過跟蹤由sds-page分離的組分蛋白，或通過生物測試測定外來體的大小。還可以通過電子顯微鏡測定大小，如wo2009/105044的實施例21中所述。組成外來體可包含由間充質干細胞分泌的一種或多種蛋白。外來體可包含存在于間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)中的一種或多種蛋白。例如，外來體可包含10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多或70％或更多的這些蛋白。外來體可包含實質上約75％的這些蛋白。所述蛋白可通過參考一系列蛋白或一系列基因的基因產物限定?？砂谕鈦眢w內的蛋白和基因產物描述于例如wo2009/105044。外來體可通過本領域中已知并且描述于例如wo2009/105044中的方式分離賦予抵抗再灌注損傷的心臟保護作用的分泌中的活性組分，例如外來體。活性組分可包含由間充質干細胞(msc)分泌的外來體。外來體是在晚期內吞區(qū)室(多泡體)中形成的小膜泡，在1983年首次描述為由網(wǎng)狀細胞分泌，隨后發(fā)現(xiàn)由很多細胞類型分泌，包括各種造血細胞、造血或非造血起源的腫瘤和上皮細胞。它們是不同于最近描述的“核糖核酸酶復合物”的獨特實體，也稱作外來體。可通過形態(tài)和生物化學參數(shù)限定外來體。因此，本文所述的外來體可包含這些形態(tài)或生物化學參數(shù)的一種或多種。外來體通常定義為“茶碟樣”泡，或由脂雙層限定的直徑40-100nm的扁平球體，并且通過內涵體膜的向內出芽形成。類似于所有脂質泡且不同于凋亡細胞釋放的蛋白聚集物或核小體片段，外來體具有～1.13–1.19g/ml的密度并且漂浮在蔗糖梯度上。外來體富含膽固醇和鞘磷脂以及脂筏標記，例如gm1、gm3、浮艦蛋白和src蛋白激酶lyn，表明其膜富含脂筏。已檢測了來自不同細胞類型和不同物種的外來體的分子組成。通常，外來體包含看來常見于所有外來體的普遍存在的蛋白，以及細胞類型特異性的蛋白。此外，來自相同細胞類型但不同物種的外來體中的蛋白高度保守。普遍存在的外來體相關蛋白包括見于細胞骨架中的胞漿蛋白，例如微管蛋白、肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白；細胞內膜融合物和轉運物，例如膜聯(lián)蛋白和rab蛋白；信號轉導蛋白，例如蛋白激酶、14-3-3和異三聚g蛋白；代謝酶，例如過氧化物酶、丙酮酸和脂質激酶，以及烯醇化酶-1和四跨膜蛋白家族，例如cd9、cd63、cd81和cd82。四跨膜蛋白在外來體中高度富集，并且已知參與大分子復合體和膜亞結構域的組織。外來體中的細胞類型特異性蛋白的實例是來自表達ii型mhc的細胞的外來體中的ii型mhc分子、樹突細胞衍生的外來體中的cd86、t細胞衍生的外來體上的t細胞受體等。顯著地，外來體不包含核、線粒體、內質網(wǎng)或高爾基體來源的蛋白。此外，外來體中不存在高豐度的質膜蛋白，表明它們不是質膜的簡單片段。很多報道的普遍存在的外來體相關蛋白也存在于hesc-msc分泌的蛋白質組學圖譜中。還已知外來體包含mrna和microrna，其可遞送至另一個細胞，并且可以在此新位置發(fā)揮功能。外來體的生理功能仍很少定義。認為其輔助消除陳舊蛋白、回收蛋白、介導感染性顆粒(例如朊病毒和病毒)的傳播、誘導補體抗性、推動免疫細胞間通訊，以及轉送細胞信號。外來體現(xiàn)已用于癌癥治療的免疫療法中。來自間充質干細胞的治療性外來體的應用如上文和下文所述，外來體，包括治療性外來體，可用作msc或msc-cm的替代物。具體地，治療性外來體可用于目前使用的或在將來可使用的msc或msc-cm的任何治療目的。本文所述的方法和組合物顯然能夠從間充質干細胞生產治療性外來體。因此，間充質干細胞的任何應用可等同地適用于來自間充質干細胞的治療性外來體。本文所述的方法和組合物產生的間充質干細胞和分化的細胞可用于疾病的治療，或用于制備用于疾病治療的藥物組合物。此類疾病可包括可通過再生療法治療的疾病，包括心臟衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷；退行性疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病等，以及癌癥。因此，來自msc的治療性外來體可用于治療此類疾病。來自間充質干細胞的治療性外來體，例如根據(jù)本文所述的方法和組合物制備的那些，可用于各種在商業(yè)上重要的研究、診斷和治療目的。來自間充質干細胞的治療性外來體可特別用于制備用于治療疾病的藥物組合物。此類疾病可包括可通過再生療法治療的疾病，包括心臟衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷；退行性疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病等，以及癌癥。通過本文所述的方法和組合物制成的間充質干細胞具有與骨髓衍生的間充質干細胞(bm-msc)相似或相同的性質。因此，由這些制成的間充質干細胞和任何分化的細胞，以及由此衍生的治療性外來體，可用于已知使用bm-msc的或可使用bm-msc的任何應用?？赏ㄟ^來自間充質干細胞的外來體治療的疾病msc的蛋白質組分析顯示，表達的蛋白參與3個生物過程：代謝、防御反應和組織分化，包括血管形成、造血作用和骨骼發(fā)育。因此，本文所述的來自msc的治療性外來體可用于治療這些功能可能發(fā)揮作用的疾病，或其修復或治療涉及一種或多種這些生物過程的疾病。類似地，單獨或組合的，msc表達的蛋白，優(yōu)選以本文所述的治療性外來體的形式，可用于補充或替代msc或msc條件培養(yǎng)物的活性，用于例如治療或預防此類疾病的目的。顯示msc表達的201個基因產物激活心血管生物學、骨骼發(fā)育和造血作用中的重要信號途徑，例如jak-stat、mapk、toll-樣受體、tgf-β信號和mtor信號途徑。因此，來自msc等的治療性外來體可用于預防或治療涉及這些信號途徑中的任一種，或其病因涉及這些號途徑中的任一種或多種中的一種或多種缺陷的疾病。因此，此類治療性外來體可用于治療心臟衰竭、骨髓疾病、皮膚疾病、燒傷和退行性疾病，如糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森氏病等，以及癌癥。此類治療性外來體還可用于治療心肌梗死、皮膚創(chuàng)傷、皮膚失調、皮膚病變、皮炎、銀屑病、濕疣、尋常疣、血管瘤、瘢痕瘤、皮膚癌、異位性皮炎、白塞氏病、慢性肉芽腫病、皮膚t細胞淋巴瘤、潰瘍，癥狀是最初的損傷誘導炎癥和免疫失調導致慢性組織重組的的病理狀況，包括纖維化和功能喪失，腎缺血性損傷、囊性纖維化、鼻竇炎、鼻炎或者骨科疾病。治療性外來體可用于輔助個體中的傷口愈合、疤痕消退、骨形成、骨移植或骨髓移植。除非文中另有說明，所用術語“條件培養(yǎng)物”不僅包括暴露于msc的細胞培養(yǎng)基，還包括包含一種或多種，優(yōu)選基本所有存在于條件培養(yǎng)物中的多肽的組合物。治療性外來體還可用作msc分泌或表達的任何蛋白的來源。因此，本發(fā)明人提供了生產如包含在治療性外來體的多肽的方法，所述方法包括獲得所述的治療性外來體，和從所述治療性外來體分離多肽。治療性外來體的遞送本文所述的治療性外來體可通過任何適合的方式遞送至人體或動物體內。因此，本發(fā)明人描述了用于將本文所述的治療性外來體遞送至靶細胞、組織、器官、動物體或人體的遞送系統(tǒng)，以及使用所述遞送系統(tǒng)將治療性外來體遞送至靶標的方法。遞送系統(tǒng)可包含治療性外來體的來源，例如包含治療性外來體的容器。遞送系統(tǒng)可包含用于將治療性外來體分發(fā)至靶標的分配器。因此，本發(fā)明人提供了用于遞送治療性外來體的遞送系統(tǒng)，其包含本文中所述的治療性外來體的來源，以及有效地遞送治療性外來體至靶標的分配器。本發(fā)明人進一步提供了此遞送系統(tǒng)在用于將治療性外來體遞送至靶標的方法中的應用。用于將流體遞送至體內的遞送系統(tǒng)是本領域中已知的，并且包括注射、手術滴灌、導管(包括灌注導管)，例如美國專利6,139,524中所述的那些，例如藥物遞送導管，例如美國專利7,122,019中所述的那些?？墒褂美绫绢I域中已知(例如，美國設計專利d544,957中所示)的噴鼻劑、吹氣器、吸入器等，完成至肺或鼻通道的遞送，包括鼻腔遞送。可使用主動脈內腎遞送導管，例如美國專利7,241,273中所述，完成至腎的遞送。顯然地，應配置具體遞送，以將所需量的治療性外來體以適合的間隔遞送，從而實現(xiàn)最佳治療。例如，治療性外來體可用于治療或預防動脈粥樣硬化。在此，治療性外來體的灌注可通過靜脈內完成，以穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊或減少斑塊中的炎癥。治療性外來體可通過靜脈內灌注而用于治療或預防敗血性休克。治療性外來體可用于治療或預防心力衰竭。這可以通過治療性外來體的慢性冠狀動脈內或心肌內灌注，以延遲重構或延遲心力衰竭而實現(xiàn)。治療性外來體可通過鼻內遞送而用于治療或預防肺炎癥。治療性外來體可用于治療或預防皮膚病變，例如銀屑病。通過使用透皮顯微注射針，可采用治療性外來體的長期遞送，直到病變減輕。顯然地，遞送方法將依賴于有待于遞送治療性外來體的具體器官，并且，本領域技術人員能夠相應地確定所采用的方式。例如，在心臟炎癥的治療中，可通過穿過胸壁的直接冠脈內注射，或基于在透視引導下的方法，使用標準經皮導管直接注射到例如心肌的組織中，或從插入到體腔內的支架或導管灌注抑制劑，將治療性外來體遞送至例如心臟組織(即，心肌，心包或心內膜)。可使用任何的各種冠狀動脈導管或灌注導管施用化合物?；蛘撸蓪⒅委熜酝鈦眢w包被或滲入到放置在冠狀動脈血管中的支架上。組織再生根據(jù)本文所述方法和組合物制成的間充質干細胞和分化的細胞，以及由其衍生的治療性外來體，還可用于有此需要的人患者中的組織再建或再生。以允許細胞移植至期望組織位置并再建或再生功能性缺陷區(qū)域的方式施用細胞。例如，本文所述的方法和組合物可用于調節(jié)干細胞的分化。間充質干細胞和分化的細胞以及由其衍生的治療性外來體可用于組織工程，例如用于皮膚移植物的生長。干細胞分化的調節(jié)可用于人工器官或組織的生物工程化，或用于修復術，例如支架。癌癥通過本文所述的方法和組合物制成的間充質干細胞和分化的細胞，以及由其衍生的治療性外來體可用于癌癥的治療。術語“癌癥”和“癌(的)”是指或描述哺乳動物中的生理狀況，其典型地表征為不受調控的細胞生長。癌癥的實例包括但不限于惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰臟癌、神經膠質細胞瘤如膠質母細胞瘤和神經纖維瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎臟癌、腎癌、前列腺癌，外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸部癌。進一步的實例為實體瘤癌，包括結腸癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌；造血系統(tǒng)惡性腫瘤，包括白血病和淋巴瘤、霍奇金病、再生障礙性貧血、皮膚癌和家族性腺瘤性息肉病。進一步的實例包括腦腫瘤、結腸直腸腫瘤、乳腺腫瘤、宮頸腫瘤、眼部腫瘤、肝腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、皮膚腫瘤、睪丸腫瘤、腫瘤、骨腫瘤、滋養(yǎng)細胞腫瘤、輸卵管腫瘤、直腸腫瘤、結腸腫瘤、腎腫瘤、胃腫瘤和甲狀旁腺腫瘤。還包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、肺癌、惡性黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宮頸癌和膽道癌。根據(jù)本文所述方法和組合物制成的間充質干細胞和分化的細胞，以及由其衍生的治療性外來體還可以與抗癌劑組合使用，例如內皮抑素和血管抑素，或細胞毒性劑或化療劑。例如，藥物，如柔紅霉素、阿霉素、順鉑、依托泊甙、紫杉醇、多西他賽，和生物堿，如長春新堿，以及抗代謝藥物，如甲氨蝶呤。本文使用的術語“細胞毒性劑”是指抑制或阻止細胞功能和/或導致細胞破壞的物質。此術語用于包括放射性同位素(例如i、y、pr)、化療劑和毒素，例如細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素或其片段。此外，此術語包括致癌基因產物/酪氨酸激酶抑制劑，例如wo94/22867中公開的雙環(huán)安沙霉素類；ep600832中公開的1,2-二(芳基氨基)苯甲酸衍生物；ep600831中公開的6,7-二氨基-二氮雜萘-1-酮衍生物；ep516598中公開的4,5-雙(芳基氨基)-酞亞胺衍生物；或抑制酪氨酸激酶與含sh2的底物蛋白結合的肽(例如，參見wo94/07913)?！盎焺笔强捎糜诎┌Y治療的化學化合物?；焺┑膶嵗ò⒚顾亍⒍嗳岜刃?、5-氟尿嘧啶(5-fu)、阿糖胞苷(ara-c)、環(huán)磷酰胺、塞替派、白消安、細胞毒素(cytoxin)、紫杉醇、氨甲喋呤、順鉑、馬法蘭、長春堿、博萊霉素、足葉乙甙、異環(huán)磷酰胺、絲裂霉素c、米托蒽醌、長春新堿、vp-16、長春瑞濱、卡波鉑、替尼泊苷、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、更生霉素、絲裂霉素、煙酰胺、esperamicins(參見美國專利no.4675187)、美法侖和其他相關氮芥，和內分泌療法(例如乙烯雌酚(des)、他莫昔芬、lhrh拮抗藥、孕激素、抗孕激素等)。獲得間充質干細胞(msc)可以從間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)分離或生產外來體，包括治療性外來體?？赏ㄟ^本領域中已知的任何方法制備適合用于生產條件培養(yǎng)基和外來體的msc。具體地，可在包含fgf2的無血清培養(yǎng)基中，在沒有共培養(yǎng)的條件下增殖通過分散胚胎干(es)細胞集落獲得的細胞或其子代制備msc。這詳述于以下部分中。從hesc獲得間充質干細胞(msc)或msc樣細胞的現(xiàn)有技術方法包括將人端粒逆轉錄酶(htert)基因轉染到分化中的hesc(xu等人,2004)，或與小鼠op9細胞系共培養(yǎng)(barberi等人,2005)。外源遺傳材料和小鼠細胞在這些衍生方案中的應用引入了致腫瘤性，或異型生物質感染劑的感染的不可接受的風險。因此，可以通過使用從分化hesc分離相似或相同(例如同質)msc群的臨床相關且可重復方案而衍生出的msc制備外來體。通常，所述方法包括將胚胎干(es)細胞集落分散成細胞。隨后，將細胞濾出并增殖。在包含成纖維細胞生長因子2(fgf2)的無血清培養(yǎng)基中，在沒有共培養(yǎng)的條件下增殖細胞，從而獲得間充質干細胞(msc)。因此，此方案不需要血清，不需要使用小鼠細胞或遺傳操作，并且需要更少的操作和時間，因此，具有高度的可擴展性。此方案可用于從兩種不同的hesc系，即hues9和h-1，以及第三種細胞系hes-3，分離msc。通過本文所述方法和組合物獲得的人es細胞衍生的msc(hesc-msc)非常類似于骨髓衍生的msc(hesc-msc)。胚胎干細胞培養(yǎng)物可包括人胚胎干細胞(hesc)培養(yǎng)物。在一個實施方式中，產生間充質干細胞(msc)的方法包括在補充fgf2和任選的pdgfab的培養(yǎng)基中，在沒有飼養(yǎng)者支持的條件下，用胰蛋白酶處理和增殖hesc，然后分類cd105+cd24-細胞。此方法可包括在補充fgf2和任選的pdgfab的培養(yǎng)基中，在沒有飼養(yǎng)支持的條件下增殖一周后，從胰蛋白酶化的hesc分類出cd105+、cd24-細胞，以產生hesc-msc細胞培養(yǎng)物，其中至少一些，例如基本所有，或所有細胞彼此相似或相同(例如同質)。通過此方法產生的msc可用于生產間充質干細胞條件培養(yǎng)物(msc-cm)，從該msc-cm可分離外來體。解聚胚胎干細胞集落生產間充質干細胞的一種方法可包括將胚胎干細胞集落分散或解聚成細胞。胚胎干細胞集落可包括hues9集落(cowanca,klimanskayai,mcmahonj,atienzaj,witmyerj等人，(2004)derivationofembryonicstem-celllinesfromhumanblastocysts.nengljmed350:1353-1356)，或h1esc集落(thomsonja,itskovitz-eldorj,shapiross,waknitzma,swiergieljj等人，(1998)embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.science282:1145-1147.)?？蓪⒓渲械募毎饩刍蚍稚⒅梁艽蟮某潭龋粗辽俪赡龎K。可將集落解聚或分散至集落中的所有細胞都是單細胞的程度，即將集落完全解聚?？墒褂梅稚┩瓿山饩?。分散劑可以是能夠使集落中的至少某些胚胎干細胞彼此脫離的任何物品。分散劑可包括破壞集落中細胞之間，或細胞與基質之間，或二者的粘附的試劑。分散劑可包括蛋白酶。分散劑可包括胰蛋白酶。胰蛋白酶處理可在37℃持續(xù)例如3分鐘左右。隨后，可將細胞中和、離心并在濾出前重懸在培養(yǎng)基中。此方法可包括使用胰蛋白酶分散人胚胎干細胞的匯合板，并濾出細胞。解聚可包括至少以下順序步驟的部分：抽吸、沖洗、胰蛋白酶處理、孵育、移動、淬熄、再接種和分裝。采用來自美國圣迭哥hedricklab的以下方案(http://hedricklab.ucsd.edu/protocol/coscell.html)。在抽吸步驟中，抽吸培養(yǎng)物或通常從容器，例如燒瓶，取出培養(yǎng)物。在沖洗步驟中，使用例如5-10ml體積的緩沖培養(yǎng)基沖洗細胞，所述培養(yǎng)基可不含ca2+和mg2+。例如，可使用不含鈣和鎂的pbs沖洗細胞。在胰蛋白酶處理步驟中，向容器添加一定量的在緩沖劑中的分散劑，并且滾動容器以使分散劑溶液包被在生長表面。例如，可向燒瓶添加1ml在hank’sbss中的胰蛋白酶。在培育步驟，將細胞在維持的溫度保持一定時間。例如，可將細胞在37℃保持數(shù)分鐘(例如，2至5分鐘)。在移動步驟中，可通過機械作用移動細胞，例如通過刮掉，或通過用手重擊容器側面。細胞應成片脫落并滑落到表面。在淬熄步驟中，向燒瓶添加一定體積的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可包含中和劑以終止分散劑的作用。例如，如果分散劑是蛋白酶，例如胰蛋白酶，所述培養(yǎng)基可包含蛋白質，例如血清蛋白，其將結束蛋白酶的活性。在具體實施例中，向燒瓶添加3ml的含血清的細胞培養(yǎng)基，以構成4ml的總體積?？沙榇蚣毎砸苿踊蚍稚⒓毎?。在再接種步驟中，將細胞再接種到新鮮培養(yǎng)容器并添加新鮮培養(yǎng)基。可按不同的分流比進行多次再接種。例如，可按1/15的稀釋比和1/5的稀釋比再接種細胞。在具體的實施例中，可通過向25cm2燒瓶添加1滴細胞，并向另一個燒瓶中添加3滴細胞以再接種培養(yǎng)基，從而再接種細胞，隨后，向每個燒瓶添加7-8ml培養(yǎng)基，以由例如75cm2燒瓶提供1/15的稀釋比和1/5的稀釋比。在分裝步驟中，可將細胞分裝到新器皿，或任何期望的分流比，并添加培養(yǎng)基。在具體實施方式中，所述方法包括以下步驟：首先將人es細胞以非粘附的方式懸浮培養(yǎng)以形成胚體(eb)。隨后，將5-10日齡的eb用胰蛋白酶處理，隨后濾出為明膠包被的細胞培養(yǎng)板上的粘附細胞。維持細胞培養(yǎng)物所述解聚的細胞可被鋪板并維持為細胞培養(yǎng)物。所述細胞可鋪在培養(yǎng)皿或基質上，如涂膠的平板。關鍵地，在沒有共培養(yǎng)存在的情況下，例如，在沒有飼養(yǎng)細胞存在的情況下生長和繁殖所述細胞。所述細胞培養(yǎng)物中的細胞可例如以5ng/ml、在無血清培養(yǎng)基中生長，該培養(yǎng)基補充一個或更多生長因子，如成纖維細胞生長因子2(fgf2)和任選地血小板衍生生長因子ab(pdgfab)。當匯合、用胰蛋白酶處理、清洗和再鋪板時，所述細胞培養(yǎng)物中的細胞可被1：4的分離或繼代培養(yǎng)。無共培養(yǎng)所述細胞可在無共培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。術語“共培養(yǎng)”指共同生長的兩種或更多種不同種細胞的混合物，例如基質飼養(yǎng)細胞。因此，在典型的es細胞培養(yǎng)物中，通常用已經處理以使它們不分離的小鼠胚胎皮膚細胞的飼養(yǎng)層包被培養(yǎng)皿的內表面。飼養(yǎng)層提供使es細胞能夠附著和生長的附著表面。此外，飼養(yǎng)細胞釋放營養(yǎng)到es細胞生長所需的培養(yǎng)基中。在本文所述方法和組合物中，可在無此類共培養(yǎng)的情況下培養(yǎng)es和msc細胞。所述細胞可作為單層培養(yǎng)，或在無飼養(yǎng)細胞下培養(yǎng)。胚胎干細胞可在無飼養(yǎng)細胞的情況下培養(yǎng)，以建立間充質干細胞(msc)。分散或解聚的胚胎干細胞可直接鋪在培養(yǎng)基質上。該培養(yǎng)基質可包含如皮氏培養(yǎng)皿的組織培養(yǎng)皿。該培養(yǎng)皿可預先處理。細胞可鋪在或生長在涂膠的組織培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿涂膠的范例方案如下。制作蒸餾水中的0.1％明膠溶液，高壓蒸汽處理。此溶液可在室溫下儲存。用明膠溶液覆蓋組織培養(yǎng)皿的底部，溫育5～15分鐘。移除明膠，培養(yǎng)皿待用。為防止低滲裂解，加入細胞前要加入培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基分散或解聚的胚胎干細胞可在包含無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。術語“無血清培養(yǎng)基”可包含不含血清蛋白的細胞培養(yǎng)基，如胎牛血清。無血清培養(yǎng)基是本領域中已知的，并描述在如美國專利5,631,159和5,661,034中。無血清培養(yǎng)基可從如gibco-brl(invitrogen)購得。無血清培養(yǎng)基可不包含蛋白質，因為它可缺乏蛋白質、水解產物和未知組成的成分。無血清培養(yǎng)基可包括化學限定的培養(yǎng)基，其中所有成分都具有已知化學結構。化學限定的不含血清的培養(yǎng)基具有優(yōu)越性，因為其提供完全確定的體系，此體系消除變異，允許提高重復性和更大的一致性，并減少外源試劑導致的污染的可能。無血清培養(yǎng)基可包括knockoutdmemmedia培養(yǎng)基(invitrogen-gibco,grandisland，newyork)。無血清培養(yǎng)基可補充有1種或多種諸如血清替代培養(yǎng)基的成分，濃度例如為5％、10％、15％等。無血清培養(yǎng)基可包括或補充有購自invitrogen-gibco(grandisland，newyork)的10％血清替代培養(yǎng)基。生長因子在其中培養(yǎng)分散或解聚的胚胎干細胞的無血清培養(yǎng)基可包括1種或多種生長因子。本領域中已知許多生長因子，包括pdgf、egf、tgf-a、fgf、ngf、紅細胞生成素、tgf-b、igf-i和igf-ii。生長因子可包含成纖維細胞生長因子2(fgf2)。培養(yǎng)基也可包含其它生長因子，如血小板源生長因子ab(pdgfab)。本領域中已知這兩種生長因子。方法可包括在包括fgf2和pdgfab的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞?？商娲幕虼送?，培養(yǎng)基可包含或進一步包含表皮生長因子(egf)。egf的使用可增加msc的生長。egf可在的任何合適濃度下使用，如5-10ng/ml的egf。egf可代替pdgf使用。egf是本領域中公知的蛋白質，并指符號egf,alt.符號urg,entrez1950,hugo3229,omim131530,refseqnm_001963,uniprotp01133。這樣，本發(fā)明人公開了包含(i)fgf2、(ii)fgf2和pdgf和(iii)fgf2和egf與其它組合的培養(yǎng)基的使用。fgf2是一種廣譜促有絲分裂、血管生成和神經營養(yǎng)因子，其在許多組織和細胞類型中低水平表達，在大腦和垂體中達到高濃度。fgf2涉及眾多的生理和病理過程，包括肢體發(fā)育、血管形成、傷口愈合和腫瘤生長。fgf2可從如invitrogen-gibco(grandisland，newyork)中購得。血小板衍生的生長因子(pdgf)是包括成纖維細胞、平滑肌和結締組織的廣泛細胞類型的強效促細胞分裂素。pdgf由稱為a鏈和b鏈的兩個鏈的二聚體組成，能以aa或bb同型二聚體或以ab異型二聚體呈現(xiàn)。人類pdgf-ab是由13.3kdaa鏈和12.2kda的b鏈組成的25.5kda的同源二聚體蛋白質。pdgfab可從peprotech(rockyhill，newjersey)購得。生長因子，如fgf2和任選地pdgfab，可以大約100pg/ml，例如約500pg/ml、例如約1ng/ml、例如約2ng/ml、例如約3ng/ml、例如約4ng/ml、例如約5ng/ml的濃度存在于培養(yǎng)基中。在一些實施方式中，培養(yǎng)基包含約5ng/ml的fgf2。培養(yǎng)基還可包含例如大約5ng/ml的pdgfab。分離細胞(splittingcells)培養(yǎng)物中的細胞通常持續(xù)生長直到匯合，當接觸抑制導致細胞分裂和生長停止時。然后從基質或培養(yǎng)瓶分散這樣細胞，并“分離”，通過稀釋到組織培養(yǎng)基中和再鋪板進入繼代培養(yǎng)或傳代。因此，本文所述方法和組合物可包括培養(yǎng)過程中的傳代或分離。細胞培養(yǎng)物中的細胞可以1:2或更高，例如1:3，例如1:4、1:5或更高的比率分離。術語“傳代”指包含下述步驟的過程：取細胞系融合培養(yǎng)物的等份，接種到新鮮培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)細胞系直到達到融合或飽和。選擇、篩選或分類步驟方法可進一步包括選擇或分類步驟，以進一步分離或選擇間充質干細胞。選擇或分類步驟可包括通過一種或多種表面抗原標記從細胞培養(yǎng)物中選擇間充質干細胞(msc)。使用選擇和分類步驟進一步增強了特異于msc分類和選擇的嚴謹性，此外，潛在降低了來自胚胎肝細胞的可能污染，胚胎干細胞如hesc和來自起始材料的其它hesc-衍生物。然后，這將進一步減小畸胎瘤形成的風險，并進一步提高本發(fā)明人描述的方案的臨床可靠性。已知基于抗原表達的大量選擇或分類方法，且任意這些方法均可用于本文所述的選擇或分類步驟。通過熒光活化細胞分選術(facs)可實現(xiàn)選擇或分類。因此，如本領域中已知的，facs涉及暴露細胞給報告分子，如結合并標記被細胞表達的抗原的標記抗體。本領域中已知產生抗體方法或標記它以形成報告分子的方法，并在例如harlow和lane中有描述。然后，細胞通過facs機器，其根據(jù)標記將細胞彼此分類。替代地或此外，可使用磁珠細胞分選法(macs)將細胞分類。本發(fā)明人已經意識到，盡管許多候選表面抗原已知與與msc相關，例如cd105、cd73、anpep、itga4(cd49d)、pdgfra，一些msc相關表面抗原，例如cd29和cd49e也在es細胞中高表達，所述es細胞例如hesc，且其表達可通過facs分析進行證實。表面抗原與msc的相關性可能不足夠以定性所述抗原為用于從例如hesc的es細胞中分離msc的選擇標簽。因此，選擇或分類步驟可使用在msc和es細胞間差異表達的抗原。本發(fā)明人的方法的選擇和分類步驟可根據(jù)抗原表達陽性選擇間充質干細胞?？衫缤ㄟ^比較hesc和hescmsc的基因表達譜識別這樣的抗原。在具體的實施方式中，選擇或分類可特別地使用如下表e1a和e1b中所示的任何一種抗原。本發(fā)明人方法的選擇和分類步驟可根據(jù)識別為在msc上表達而不在例如hesc的es細胞上表達的抗原的表達對間充質干細胞進行陽性選擇。cd73在msc上高表達，而在hesc上不高表達。cd73和cd105都是在msc上高表達的表面抗原，且是位列相對于hesc的hesc-msc中前20高表達的表面抗原，cd73或cd105任一種(或二者)作為假定的msc選擇標記，在分類通過分化hesc產生的假定msc中同等有效。替代地或此外，選擇或分類步驟可根據(jù)在如hesc的胚胎干細胞(es細胞)上而不在例如hesc-msc的間充質干細胞上高表達為表面抗原的表面抗原陰性選擇抗原。選擇或分類步驟可基于已知的或以前鑒定的如mibp、itgb1bp3和podxl和cd24的hesc-特異的表面抗原。facs分析證實了cd24在hesc而不在hesc-msc上的表達。因此，cd24自身可用作陰性選擇或分類標記，或與cd105組合用作用于從分化的hesc培養(yǎng)物分離假定的msc的陽向選擇標記。實施例實施例1.材料和方法—制備外來體外來體如先前所述，使用hplc從hues9.e1衍生的msc條件培養(yǎng)物(cm)純化外來體外來體。簡言之，使用具有100kdamwco(sartorius,goettingen，德國)的膜通過切向流過濾(tff)將從msc培養(yǎng)物中收集的cm濃縮50倍。然后，cm通過層析柱(tskguard柱swxl,6x40mm和tsk凝膠g4000swxl,7.8×300mm，tosohcorp.,tokyo，日本)。從洗脫的第一個峰值中收集外來體外來體，用100kdamwco過濾器(sartorius)濃縮。在儲存或使用前用0.22μm過濾器過濾外來體外來體。實施例2.材料和方法——lcms/ms如所述(20)，在2ml透析外來體外來體中的蛋白質被還原、烷基化和胰蛋白酶消化。然后，通過將消化混合物通過條件化的sep-pakc-18spe試劑盒(waters，milford，ma，美國)使樣品脫鹽，用3％乙腈(acn)(新jtbaker，phillipsburg,nj)和0.1％甲酸(fa)緩沖液洗兩次，并用70％的acn和0.1％fa緩沖液洗脫。然后，通過在真空離心機中去除有機溶劑，將洗脫樣品干燥至它們初始體積的大約10％。為降低樣品復雜性，通過polysulfoethylscx柱(200mm×4.6mm)(polylc，美國)用hplc系統(tǒng)(shimadzu,日本)進行離線肽分餾。1ml/min，流動相a(5mmkh4po4+30％乙腈)和流動相b(5mmkh4po4+30％乙腈+350mmkcl)。在真空離心機中收集和干燥成8個組分。分餾的樣品裝入在線連接至裝備納米噴霧源的ltq-ft超線性離子阱質譜儀(thermoelectron，bremem，德國)的shimadzu微hplc系統(tǒng)的自動上樣器。在zorvax300sb-c18濃縮柱(5mm×03mm，agilenttechnologies，德國)中捕獲注入的肽并脫鹽，并洗脫到納米鉆孔的c18填充柱(michrombioresources,auburn,ca)中。使用分離器以恒定流速20l/min到有效流速200ηl/min的90分鐘梯度，洗脫肽到質譜儀中。以數(shù)據(jù)依賴模、通過進行ftms中來自每個ms掃描的最強烈的峰中的八個峰的ms/ms掃描來操作ltq。對于每個實驗，都通過一個自己編寫的程序把8個scx組分的ms/ms(dta)譜合并成一個單一的mascot通用文件。蛋白質鑒定通過內部的mascot服務器(版本2.2.04，matrixscience，英國)在ipi人類蛋白質數(shù)據(jù)庫(版本3.34；69,164條序列，29,064,825個殘基)中搜索合并后的數(shù)據(jù)獲得。搜索參數(shù)是：使用胰蛋白酶的2個錯過的分裂的最大值；固定的修飾是半胱氨酸的氨甲酰甲基化修飾)，并且可變修飾是蛋氨酸的氧化。肽前體和片段離子的質量公差分別設為10ppm和0.8da。如果發(fā)現(xiàn)兩個不同的肽具有高于同源性得分的得分，蛋白質鑒定接受為真陽性。實施例3.材料和方法——抗體芯片根據(jù)制造商的說明，使用基于生物素標記的人類抗體芯片i(raybio,norcross,ga)檢測來自三個獨立制品的500l非條件培養(yǎng)物和外來體外來體的細胞因子和其它蛋白的存在。如果信號強度比非條件培養(yǎng)物高2倍(p<0.05)，認為外來體外來體中存在細胞因子和其它蛋白。實施例4.材料和方法—western印跡雜交在4～12％的sds聚丙烯酰胺凝膠上分離12μg外來體外來體，并電轉染到硝酸纖維素膜上。轉移膜到snapi.d.系統(tǒng)(millipore，billerica，ca)的膜支架上，封閉并用抗人一抗培養(yǎng)，抗人一抗包括小鼠抗gapdh(1:100稀釋)、小鼠抗pgk(1:60)、小鼠抗pgd(1:60)、兔抗pfkfb3(1:60)、小鼠抗丙酮酸激酶(pk,1:200)、小鼠抗20s蛋白酶體α1-7(1:200)、小鼠抗cd73(1:60)和小鼠抗cd59(1:200)。然后，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗溫育印跡。所用的第二抗體是山羊抗小鼠igg(1:1250)或驢抗兔igg(1:1250)。所有抗體，除了鼠抗pk獲得自abcaminc.，cambridge，ma之外，均獲得自santacruzbiotechnology，santacruz，ca。然后印跡與hrp增強化學發(fā)光底物(thermofisherscientificinc.，waltham，ma)孵育并然后暴露于x射線膠片。實施例5.材料與方法-酶分析-丙酮酸激酶分析5μg外來體(在12μl中)被使用細胞提取試劑盒(biovision，mountainview，ca)裂解。所裂解的外來體提取物與50μl市售的pk分析試劑盒(biovision)中的反應混合物孵育。在該分析中，由pk產生的丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化以產生熒光(ex/em＝535/587nm)。因此，熒光強度的升高與所產生的丙酮酸的的量成比例。實施例6.材料與方法-酶分析-gapdg和pgk分析gapdh和pgk活性基于它們在糖酵解反應中的下游產物atp進行檢測，使用2個市售的試劑盒，kdalertgapdh分析試劑盒(ambioninc.，austin，tx)和aposensoradp/atp比例分析試劑盒(biovision)。簡要地，外來體使用細胞提取試劑盒(biovision)裂解。為了檢測gapdh活性，10μg裂解的外來體加至含有d-甘油醛-3-磷酸、nad+和pi的kdalert反應緩沖液以形成1,3-二磷酸甘油酸酯+nadh+h+。然后，250u/mlpgk和60μmadp加入以轉換1,3-二磷酸甘油酸酯和adp為3-磷酸甘油酸酯和atp。所產生的atp的量與gapdh活性成比例，然后使用atp熒光素酶分析來檢測。為了檢測pgk活性，10μg裂解的外來體加至上述分析中產生的1,3-二磷酸甘油酸酯。加入adp以允許形成atp。atp的量與pgk活性成比例，然后使用atp熒光素酶分析來定量。實施例7.材料與方法-酶分析-20s蛋白酶體分析蛋白酶體活性采用20s蛋白酶體活性分析試劑盒(millipore)進行測定，基于在存在或不存在特異性20s蛋白酶體抑制劑乳胞素情況下，由20s蛋白酶體裂解標記的底物llvy-amc后對熒光基團7-氨基-4甲基香豆素(amc)的檢測。簡要地，4μg外來體于含有l(wèi)lvy-amc、在存在或不存在25μm乳胞素的反應緩沖液中孵育。樣品和amc標準品于37℃孵育，并監(jiān)測于ex/em＝380/460nm處的熒光強度2小時。實施例8.材料與方法-酶分析-cd73分析外來體中cd73(nt5e)的酶活通過將2.5μg外來體于100μl含有50μmamp(sigma-aldrich，stlouis，mo)的ph7.4的tris緩沖液中孵育確定。然后，amp水解釋放的磷酸根離子的量通過colorlockgold試劑盒(innovabiosciences，cambridge，英國)按照制造商的說明書進行確定。實施例9.材料與方法-細胞分析-糖酵解h9c2心肌細胞以每孔30,000細胞接種于96孔板(包被聚賴氨酸)。5小時后，在包含20μmol寡霉素(sigma-aldrich)、6mmol葡萄糖，并在有或者沒有0.1μg/ml外來體存在下孵育15、30和60分鐘之前，細胞用臺氏緩沖液洗滌兩次。細胞atp濃度采用atplite一步熒光atp檢測分析系統(tǒng)(perkinelmer，zaventem，比利時)檢測。實施例10.材料與方法-細胞分析-腺苷酸介導的信號轉導h9c2心肌細胞以每孔200,000細胞接種到6孔板并血清饑餓過夜。然后在有或沒有1mm茶堿(theophylline)存在下孵育細胞另一小時。同時，準備兩個系列的無血清培養(yǎng)基。一個系列未包含添加，單獨50μmamp，單獨0.1μg/ml外來體或50μmamp和0.1μg/ml外來體的組合。第二個系列與第一個相似，除了培養(yǎng)基包含1mm茶堿。兩個系列在37℃孵育30分鐘。第一個系列用于替換在無血清培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)的細胞的培養(yǎng)物，第二個系列是對那些在包含茶堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。五分鐘后，收集細胞并使用市售的哺乳動物細胞提取試劑盒(biovision)在存在蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物1(sigmaaldrich)下裂解。蛋白濃度通過標準bradford分析確定。10μg總蛋白采用1:2000稀釋的兔抗-perk1/2(cellsignaling，9101s)、1:2000稀釋兔抗p-akt(cellsignaling，9271s)、1:500稀釋的兔抗erk1(santacruz，sc-94)和1:500稀釋兔抗akt(cellsignaling，9272s)通過western印跡雜交進行分析。實施例11.材料與方法-細胞分析-補體介導的細胞裂解簡要地，購買綿羊紅細胞(srbc)(innovativeresearch，southfield，mi)并用磷酸鹽緩沖液(pbs)在以1×108細胞/mlpbs重懸之前洗滌三次。純化的補體組分c5b6、c8和c9購自calbiochem(sandiego，ca)，以及c7購自sigma-aldrich(stlouis，mo)。在srbc上完整的c5b-9的裝配起始于與1ml每種c5b6(0.1μg/ml)和c7(0.4μg/ml)在存在或不存在終濃度0.1μg/ml的外來體情況下孵育15min(37℃)。然后，洗滌srbc并與1ml每種c8(0.4μg/ml，)加c9(0.4μg/ml)在有或者沒有終濃度0.05μg/ml封閉cd59抗體的情況下額外孵育30min。之后，離心srbc并且上清中由裂解的srbc釋放的血紅蛋白的量由415nm處的吸光度測定。用1％(w/v)tritonx-100處理細胞得到全部(100％)溶血。實施例12.結果-外來體的蛋白質組學譜外來體從hues9.e1條件化的培養(yǎng)基中純化，hues9.e1是由先前所述的hplc9，10的人類esc衍生的間充質干細胞13。使用質譜和抗體方法的蛋白質組學譜如先前所述9-11在3個獨立制備批次的hplc純化的外來體中進行。總共檢測到866個蛋白并且這些蛋白基于它們的基因符號進行了注釋以幫助分析(表e1)。這些中，發(fā)現(xiàn)739個蛋白中的318個基因產物先前在未分級的條件培養(yǎng)基中被鑒定了9，10(圖1)?；谠趶呐囵B(yǎng)的細胞和生物學流體純化的外來體所進行的15個蛋白質組學分析的數(shù)據(jù)分析，thery等人已經觀察到一系列大約17個蛋白，即甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapdh)、丙酮酸激酶(pk)、真核翻譯延長因子1a1(eef1a1)、乳脂肪球egf因子8蛋白(mfge8)、四跨膜蛋白、14-3-3蛋白、gα蛋白、網(wǎng)格蛋白、alix(pdcd6ip)、mhc1類、膜聯(lián)蛋白(anx)、rab蛋白、埃茲蛋白(vil2)、根蛋白(rdx)和膜突蛋白(msn)(erm)、肌動蛋白、微管蛋白，在鑒定的至少50％的外來體2中發(fā)現(xiàn)存在hsp70和hsp90。未出乎意料地，這些蛋白中的大部分也被發(fā)現(xiàn)在hplc純化的msc外來體的蛋白酶體中(表e1)。還與外來體的核內體來源一致的是，本發(fā)明人檢測了核內體相關蛋白例如alix(pdcd6ip)和rab的存在(表e1)。表e1：由lcms/ms和抗體芯片確定的3個獨立制備的外來體的蛋白質組學譜。黑體字-由lcms/ms鑒定。下劃線-由抗體芯片鑒定?；疑幱?由lcms/ms鑒定并在鑒定的至少50％的外來體2中發(fā)現(xiàn)存在。實施例13.結果-外來體蛋白蛋白質組的計算分析為了更好地理解外來體中蛋白質的生物學意義，866個蛋白在生物過程中的功能性群集使用panther(proteinanalysisthroughevolutionaryrelationships，通過進化關系的蛋白分析)分析軟件14，15進行。從每個生物過程中外來體蛋白質組所觀察到的基因頻率與ncbi數(shù)據(jù)庫相應生物過程的基因的參考頻率進行比較。866個基因產物可以歸集于32個過度代表(over-represented)的生物過程(p<0.001)和3個未被充分代表(under-represented)的生物過程(p<0.001)(圖2)。這些生物過程可以進一步歸類為與外來體生物學有關的幾種活動，例如，通訊、細胞運動性、炎癥和外來體生物發(fā)生(biogenesis)。由于外來體的功能通常被假定作為細胞內通訊和形態(tài)發(fā)生素信號轉導4，16和免疫活性的介質2的載體，外來體蛋白在信號轉導通路、細胞結構、細胞運動性和免疫反應中的涉及并非未預期到的。本發(fā)明人暫時稱為“外來體生物發(fā)生”的第四類過程實質上反映外來體的生物發(fā)生和釋放，其通過涉及核內體、escrt介導的分選和多泡體的形成以及與質膜的融合。因此，例如轉高爾基網(wǎng)絡、細胞內蛋白運輸(traffic)、普通囊泡轉運、胞吞作用、受體介導的胞吞作用、其它蛋白靶向和定位以及胞吐作用中涉及的那些蛋白質并非未預期到富集于外來體中。本發(fā)明人分類為組織修復和再生的其它生物過程包括涉及包括骨骼發(fā)育和血管形成的中胚層和外胚層組織的發(fā)育和分化的那些生物過程。這些生物過程與間充質干細胞的分化潛力一致17并反映外來體的細胞起源。在本發(fā)明人的代謝分類中，本發(fā)明人包括涉及產生能量的分解代謝或合成代謝及為生長和再生提供基礎材料的過程。血液凝固也是重要的本發(fā)明人假定的過度代表的生物過程，其在改善組織損傷中可能是重要的。所有三個未被充分代表的生物過程并未不可預料地涉及在轉錄水平調節(jié)基因表達。在這些過程中涉及的大部分蛋白傾向于有效轉運至細胞核，使得它們好像與外來體更少相關。本發(fā)明人還觀察到，發(fā)現(xiàn)于條件培養(yǎng)物(cm)中的421個蛋白并未存在于外來體中(圖1)，并且這些蛋白可功能性歸集于十一個過度代表和兩個未被充分代表的生物過程。在過度代表的生物過程中，六個還被發(fā)現(xiàn)歸集在外來體中發(fā)現(xiàn)的866個蛋白中，而剩下的五個，即氨基酸活化、蛋白折疊、染色體包裝和重塑、蛋白復合體裝配和mrna剪接沒有被發(fā)現(xiàn)。兩個未被充分代表的生物過程還被發(fā)現(xiàn)是未被充分代表的外來體蛋白。msc外來體中的蛋白種種陣列意味著它們有潛力參與廣譜生化和細胞活性。為了檢測這個假設，本發(fā)明人選擇可以分析檢測它們的生化和細胞活性并且其總和提供外來體活性的廣譜多樣性的指示的那些蛋白。實施例14.結果-外來體通過糖酵解增強的細胞atp產生外來體蛋白質組的一個顯著特征是存在糖酵解的atp產生階段的所有五種酶(圖3a)：甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapdh)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、磷酸葡萄糖變位酶(pgm)、烯醇化酶(eno)和丙酮酸激酶m2亞型(pkm2)。這些之中，產生atp或nadh的三種酶，即gapdh、pgk和pkm還被免疫印跡證實存在(圖3b)。它們的酶活性分別被確定為每μg蛋白1.1μu、3.59μu和5.5μu(圖3c)，其中1單位(u)酶活性定義為每分鐘生成1微摩爾產物所需的活性。此外，外來體包含轉換果糖6-磷酸為果糖2,6-二磷酸的pfkfb3。pfkfb3是由四個不同基因pfkfkb1、2、3和4編碼的四種pfkfb亞型之一。pfkfb負責維持果糖2,6-二磷酸的細胞水平，其為催化糖酵解定型的磷酸果糖激酶18的強有力的變構激活子。它們被認為對高糖酵解速率或癌癥細胞中的“warburg作用”19負責。pfkfb3的激酶活性由蛋白激酶，例如camp依賴的蛋白激酶和蛋白激酶c的磷酸化上調。質譜分析顯示外來體中pfkfb3的存在并且免疫印跡進一步證實該酶是磷酸化的(圖3a)。外來體中產生atp的糖酵解酶和磷酸化的pfkfb3的存在預示，將細胞暴露于外來體可以提高糖酵解流出和提高atp產量。為了檢測這一點，本發(fā)明人測定了這些外來體是否可以在寡霉素處理的h9c2細胞中提高atp合成。由于寡霉素抑制線粒體atp酶20，寡霉素處理的細胞會不得不利用糖酵解作為它們細胞atp的主要來源。與存在糖酵解酶和pfkfb3一致，以及本發(fā)明人先前證實h9c2細胞能內在化msc外來體12，在暴露于外來體15至30分鐘時，外來體通過提高的糖酵解分別提高寡霉素處理的細胞的atp水平75.5+28.8％或55.8+16.5％。實施例15.外來體中的20s蛋白酶體是酶活性的msc外來體的質譜分析不僅檢測到20s核心顆粒的所有七種α-(pmsa1-7)和所有七種β-亞基(pmsb1-7)的存在，還檢測到“免疫蛋白酶體”的三種β亞基，pmsb8(β5i或lmp7)、pmsb9(β1i或lmp2)、pmsb10(β2i或lmp10)基因產物21。一些20s蛋白酶體肽的存在進一步由western印跡雜交證實(圖4a)。20s核心顆粒的所有七種α-(pmsa1-7)和所有七種β-亞基(pmsb1-7)的存在意味著msc外來體包含完整的20s蛋白酶體復合體，并因此潛在地具有20s蛋白酶體酶活性。與此一致的，msc外來體能夠以5.00μu/μg蛋白的酶活降解短熒光肽并且這種降解被乳胞素，一種蛋白酶體抑制劑，抑制(圖4b)。本發(fā)明人還觀察到與上述糖酵解酶分析不一樣，外來體中20s蛋白酶體活性可不通過裂解外來體被檢測到。這意味著20s蛋白酶體可能存在于外來體的表面而不是內腔。先前觀察到20s蛋白酶體優(yōu)選以“在端點”(“end-on”)的構型裝配于磷脂酰肌醇脂單層、er和高爾基脂質膜22上，以致20s蛋白酶體的進入是垂直于膜的。因此，這個與本發(fā)明人的觀察一起表明，外來體中的20s蛋白酶體附著于外膜表面并且它們的進入是垂直于外來體膜的。實施例16.結果-外來體通過nt5e(cd73)外生-5’-外核苷酸酶磷酸化erk和akt外生-5’-外核苷酸酶(nt5e或cd73)與外生-三磷酸腺苷雙磷酸酶(cd39)一起酶法轉換前體核苷酸為腺苷。在細胞損傷過程中，細胞釋放atp和adp23。cd39水解胞外atp和adp為amp，然后其由外生-5’-外核苷酸酶降解為腺苷。在人類血液中腺苷具有十秒的半衰期。它是強有力的血管舒張劑，但沒有用于臨床作為血管舒張劑，因為它的作用非常短。它被用于超心室性心博過速的快速治療。腺苷是內源性嘌呤核苷，其通過四種已知的腺苷受體亞型(a1、a2a、a2b和a3)調節(jié)許多生理過程24。nt5e通過質譜分析發(fā)現(xiàn)并被免疫印跡證實存在于msc外來體中(圖5a)。它們的酶活性確定為22.04μu/μg蛋白。為了確定外來體是否能夠通過cd73介導的amp水解激活細胞中的腺苷信號轉導，h9c2心肌細胞血清饑餓過夜，然后暴露于外來體和amp。然后分析細胞裂解物的erk1/2和akt的磷酸化(圖5b，圖5c)。血清過夜饑餓之后，暴露于外來體和amp誘導erk1/2和akt的磷酸化。erk1/2和akt的磷酸化被茶堿(一種非選擇性腺苷受體拮抗劑，拮抗a1、a2a、a2b和a3受體)的存在所破壞。實施例17.結果-外來體抑制膜攻擊復合物的形成補體系統(tǒng)是先天性免疫系統(tǒng)的一部分，其補充抗體的功能。一旦激活，生化級聯(lián)反應被啟動以產生幾種關鍵產物：c3b，其結合到病原表面并增強對這些病原的吞噬作用；c5a，其通過趨化作用幫助招募炎性細胞；以及c5b，其啟動由c5b、c6、c7、c8和多聚c9組成的mac的形成。沉積于靶細胞上的mac形成跨膜通道，其導致隨后的細胞裂解。補體通路的異常激活被認為在心肌缺血再灌注損傷中起有害的作用26。msc外來體通過質譜分析發(fā)現(xiàn)含有cd59并且這被免疫印跡所證實(圖6a)。因為cd59抑制mac的形成27，這表明外來體可以抑制補體激活和隨后的補體介導的細胞裂解。與這個假設一致的是，外來體抑制補體介導的綿羊紅細胞(srbc)的裂解(圖6b)。當cd59封閉抗體被用于預處理外來體時，該抑制被消除，這顯示外來體的cd59直接涉及補體裂解的抑制。實施例18.討論(對實施例1至17)在這個報道中，本發(fā)明人對3個獨立制備的、hplc純化的esc衍生的msc外來體的蛋白質組采用質譜和細胞因子芯片進行描繪，并鑒定了866個蛋白質。這些蛋白包括通常在其它外來體中發(fā)現(xiàn)的許多蛋白。根據(jù)它們的功能歸集這些蛋白顯示，外來體具有驅動許多生物過程的潛力。為了評估這個設想的生物學潛力，本發(fā)明人檢查了基于分析它們的生化和細胞活性是可用的所選擇的一系列蛋白，并且作為一組，它們證明了活性的廣泛多樣性。更重要的是，這些所選擇的蛋白的生化和細胞活性能夠潛在地改良急性心肌缺血/再灌注損傷的組織損傷。msc外來體的蛋白質組包含各種各樣的蛋白質。顯著的部分是涉及通過生物合成和內吞途徑高度調節(jié)和復雜的細胞內膜運輸和分類28，并且這些蛋白的存在可能反映了外來體的生物發(fā)生，其實質上是許多細胞類型分泌的小脂雙層膜囊泡。先前觀察到，不同細胞來源的外來體攜帶一組共同的蛋白質，其中許多反映了它們的生物發(fā)生29。外來體的生物發(fā)生的復雜性和蛋白質和rna貨物裝載的選擇性裝載顯示細胞資源的沉重投入并且這種承諾(commitment)必須基于重要的生理功能。雖然外來體已經被發(fā)現(xiàn)超過30年了，外來體的生物學重要性才剛剛開始被揭示。它已經涉及越來越多的重要生理和病理過程，例如無用蛋白的去除1、抗原提呈30、遺傳交換31、免疫反應32，33和腫瘤轉移32-37?？傊?，這些觀察表明，作為一個群體或個體，外來體可以調節(jié)許多生物過程。后者的可能性由外來體中已經發(fā)現(xiàn)的大量蛋白質和rna支持12，38。除了上述所列的外來體的功能，本發(fā)明人最近還觀察到，msc分泌的外來體可以減少小鼠急性心肌缺血/再灌注損傷模型的梗死面積9。為了研究和闡明分子機制，本發(fā)明人進行了對msc的外來體進行了系統(tǒng)的蛋白質組學研究，以揭示這些外來體的細胞和生化潛力，以及鑒定能夠改良急性心肌缺血/再灌注損傷中的組織損傷的候選生物學活性9。本發(fā)明人首先確定了負責產生atp和nadh的糖酵解酶18，其不僅存在于外來體中而且還是生化活性的。此外，外來體還包含催化果糖-2,6-二磷酸形成的pfkb3的活性磷酸化形式，其是磷酸果糖激酶的強有力的變構激活子。這些觀察表明msc外來體具有通過糖酵解恢復細胞atp和nadh的潛力，獨立于線粒體的功能。除了作為atp產生的主要位點，線粒體也是調節(jié)細胞死亡的主要細胞器39。在病理情況下，如急性心肌缺血/再灌注損傷，線粒體功能損失和隨后的atp耗竭通常代表導致細胞死亡的級聯(lián)反應的早期步驟。atp缺乏，細胞活力的主要指標，是線粒體功能障礙的關鍵結果。由于msc外來體可以被細胞內在化12，外來體具有通過提高糖酵解酶的細胞含量或帶有線粒體損傷的細胞中磷酸化的pfkb3以恢復細胞atp水平的潛力。實際上，當h9c2細胞中的線粒體atp酶被寡霉素抑制時，外來體可以提高這些細胞中的atp產量。共同組成20s蛋白酶體的所有七個α和β亞基的存在和隨后在外來體中20s蛋白酶體酶活性的驗證顯示，msc外來體的治療活性可以部分歸因于20s蛋白酶體的存在。20s蛋白酶體負責大約90％的所有細胞內氧化損傷蛋白40的降解且減弱的蛋白酶體活性已被假定為衰老相關神經退行性疾病的病理發(fā)生中的促進因素，所述疾病例如阿爾茨海默氏病和帕金森氏病41,42或心血管疾病43-45。msc外來體通過cd73水解amp為腺苷和隨后通過腺苷受體誘導akt和erk1/2的磷酸化的生化潛力顯示，msc外來體具有水解由不良細胞釋放的amp和刺激存活信號轉導通路的能力。來自歐洲心臟病學會的最近的立場文件(positionpaper)突出顯示，腺苷受體的激活和例如pi3激酶-akt和erk1/2促存活激酶的磷酸化可能在限制性再灌注損傷中具有作用46。因此，已經顯示具有心肌保護作用46，47的腺苷受體的活化也可以是介導外來體改良再灌注損傷的分子機制。外來體上cd59抑制補體介導的紅細胞裂解代表另外一個外來體的心肌保護作用的候選機制。補體激活是例如腸、心臟和腎臟組織中缺血/再灌注損傷的已知媒介，并且它的減弱或抑制已經顯示改良組織損傷48-50?？傊景l(fā)明人的外來體蛋白質組研究和生化驗證已經揭示了各種各樣的生化和細胞活性，并且鑒定了外來體的心肌保護作用的幾個候選通路。進一步在合適的動物模型中的驗證研究將需要確定一個或多個這些候選通路是否促成msc外來體在急性心肌損傷治療中減少再灌注損傷的有效性51。msc外來體中生化潛力的多數(shù)提供同時靶向多于一種組織損傷的媒介并潛在地誘導與在組合藥物治療中觀察到的相似的治療的協(xié)同作用的可能性。能夠靶向損傷的多個媒介的可能性進一步由使用酶驅動這些靶向活性增強。由于酶活性取決于它們的微環(huán)境，例如底物濃度或ph，基于酶的外來體的治療活性可以與疾病沉淀的微環(huán)境的嚴重程度成比例地被激活或被減弱。于是，基于外來體治療的有效性會對疾病沉淀的微環(huán)境呈高度反應性并也被其所限制?？傊?，這些特點可能使得基于外來體的治療本質上更安全并更有效。實施例19.結果-msc外來體激活tlr使用兩種衍生自thp-1(已知表達大部分人類tlr的急性單核白血病細胞系)的細胞系來首次評估m(xù)sc外來體激活tlr的潛力。第一細胞系是在nf-kb啟動子的轉錄控制下穩(wěn)定轉染分泌型胚胎堿性磷酸酶(seap)報告基因的thp1-xblue。第二細胞系是myd88活性缺陷的thp1-xblue-defmyd，這樣，thp1-xblue而不是thp1-xblue-defmyd的激活顯示tlr配體的存在。在0.1μg/ml，msc外來體激活thp1-xblue至與0.01μg/ml的lps的激活程度相同的程度，并且與lps不同，這種激活沒有被多粘菌素b(polymyoxinb)破壞，這排除在msc外來體制備物中l(wèi)ps的污染。msc外來體和lps均沒有激活thp1-xblue-defmyd，這顯示thp1xblue的激活僅由thp-1細胞上存在的一些tlr的激活介導(圖6)。由于msc外來體包含推定的tlr2和tlr4的配體，它們被使用穩(wěn)定轉染人類tlr2或tlr4和seap報告系統(tǒng)的hek報告細胞系檢測了激活這些受體的潛力(圖7和圖8)。盡管msc外來體包含tlr2和tlr4二者的內源性配體，僅tlr4被0.1μg/ml外來體激活。1.0μg/ml外來體對tlr2有一些小但顯著的(p<0.01)激活顯示msc外來體激活tlr2的能力至少低10倍。由于外來體激活tlr4沒有被多粘菌素b破壞，這排除了在msc外來體制備物中l(wèi)ps的污染。因此，msc外來體可以激活tlr4但不激活tlr2。實施例20.msc外來體具有tlr配體-方法msc外來體上tlr配體的存在使用兩種衍生自thp-1(已知表達大部分人類tlr的急性單核白血病細胞系)的細胞系來確定。第一細胞系是在nf-kb啟動子的轉錄控制下穩(wěn)定轉染分泌型胚胎堿性磷酸酶(seap)報告基因的thp1-xblue。第二細胞系是myd88活性缺陷的thp1-xblue-defmyd。105細胞/孔接種于96孔板并與10ηg/mllps(e.coli026:b6，sigma)或0.1μg/mlmsc衍生的外來體(msc-exo)在有或者沒有多粘菌素b(一種結合并失活lps的抗生素)的情況下孵育24小時。seap水平用quanti-blue(invivogen)(一種堿性磷酸酶的熒光底物)進行分析。結果顯示于圖7中。實施例21.msc外來體不激活tlr2-方法msc外來體的tlr2激活潛力使用市售的已經穩(wěn)定共轉染在nf-κb啟動子轉錄控制下的人類tlr2、md2和cd14以及優(yōu)化的分泌型胚胎堿性磷酸酶(seap)報告基因的hek293細胞系來進行評估。這個細胞系，hek-blue-htlr2(invitrogen)以104細胞/孔接種于96孔板并與10μg/ml脂磷壁酸(lta，金黃色葡萄球菌，sigma)或0.1、0.5和1.0μg/mlmsc衍生的外來體(msc-exo)孵育24小時。seap水平用quanti-blue(invivogen)(一種堿性磷酸酶的熒光底物)進行分析。結果顯示于圖8中。實施例22.msc外來體激活tlr4-方法msc外來體的tlr4激活潛力使用市售的已經穩(wěn)定共轉染在nf-κb啟動子的轉錄控制下的人類tlr4、md2和cd14以及優(yōu)化的分泌型胚胎堿性磷酸酶(seap)報告基因的hek293細胞系來進行評估。這個細胞系，hek-blue-htlr4(invitrogen)以104細胞/孔接種于96孔板并與10ηg/mllps(e.coli026:b6,sigma)或0.1μg/mlmsc衍生的外來體(msc-exo)在有或者沒有多粘菌素b(一種結合并失活lps的抗生素)情況下孵育24小時。seap水平用quanti-blue(invivogen)(一種堿性磷酸酶的熒光底物)進行分析。結果顯示于圖9中。實施例23.msc外來體誘導由thp-1細胞的促炎和抗炎細胞因子的產生方法thp-1細胞以1×106細胞/ml接種到24孔培養(yǎng)板，用10ηg/mllps或0.1μg/mlmsc-exo刺激0.5、1、3、6、12、24、48、72、96和120小時。收集細胞并用實時定量rt-pcr分析細胞因子產量。總rna使用rneasy迷你試劑盒(qiagen)提取并使用高容量cdna反轉錄試劑盒(abip/n.4368813)進行反轉錄。pcr在steponeplustm實時pcr系統(tǒng)(abip/n.4376592)以總體積20μl進行，該pcr存在10μl2×fastgreenmastermix(abi,p/n4385612)、1μlcdna和1μl寡核苷酸引物，起始變性步驟為95°c10min，隨后是40個循環(huán)的95℃變性3s、60℃退火和延伸30s。所使用的引物如下：il-1β(fw:5′-cctgtcctgcgtgttgaaaga-3′；rv:5′-gggaactgggcagactcaaa-3′),tnf-α(fw:5′-ccccagggacctctctctaatc-3′；rv:5′-ggtttgctacaacatgggctaca-3′),il-6(fw:5′-tcgagcccaccgggaacgaa-3′；rv:5′-gcaactggaccgaaggcgct-3′),il-12p40(fw:5′-catggtggatgccgttca-3′；rv:5′-acctccacctgccgagaat-3′),il-10(fw:5′-gtgatgccccaagctgaga-3′；rv:5′-cacggccttgctcttgtttt-3′),tgf-β1(fw:5′-cagcaacaattcctggcgata-3′；rv:5′-aaggcgaaagccctcaattt-3′),gapdh(fw:5′-gtcttcaccaccatggagaaggct-3′；rv:5′-catgccagtgagcttcccgttca-3′)。對于每個樣品，mrna含量與人類gapdhmrna的含量進行歸一化并與未處理的對照相比顯示n倍表達。每個樣品檢測三個平行。數(shù)據(jù)使用比較δct方法和appliedbiosystemsstepone軟件版本2.0.1，根據(jù)制造商的說明書，進行分析。結果msc外來體作用于thp-1細胞的細胞因子產生。由于tlr是調節(jié)先天性免疫的激活的一類主要的受體并且msc外來體可以在人類單核細胞中激活tlr，本發(fā)明人測定這種激活是否導致細胞因子的產生(圖10)。msc外來體誘導促炎和抗炎細胞因子的雙相產生，峰值分別位于3和72-96小時。實施例24.msc外來體對適應性免疫的調節(jié)msc外來體對tlr的激活和對促炎和抗炎細胞因子的誘導顯示msc外來體可以調節(jié)適應性免疫。具體地，本發(fā)明人檢測了msc外來體是否對treg或th17分化具有任何作用。treg指已知為調節(jié)性t細胞或抑制子t細胞的t細胞亞群12。它們下調免疫系統(tǒng)并維持對自身抗原的耐受。這些細胞已經被用于免疫疾病的免疫治療，例如過敏和哮喘、糖尿病、移植排斥反應等1314。th17細胞是cd4+記憶性t細胞并由它們分泌il-17細胞因子的標志定義。它們被認為在自身免疫疾病的病理發(fā)生中位于中心位置15。為了檢測msc外來體對cd4+小鼠t細胞分化為treg或th17細胞的作用，cd4+小鼠細胞與msc外來體孵育。作為陽性對照，cd4+小鼠細胞由tgf-β1誘導分化為treg細胞并且由il-6&tgf-β1誘導分化為th17細胞。它們均未對cd4+小鼠t細胞分化為cd4+cd25+foxp3+treg或th17細胞施加任何作用(圖11a和圖11b)。實施例25.誘導cd4+小鼠t細胞分化為treg(a)或th17細胞(b)如前所述16，鼠脾細胞從6至8周齡balb/c小鼠制備。簡要地，去除小鼠脾臟，剁碎并過濾(strained)。然后，裂解紅細胞。使用fitc標記的大鼠抗小鼠cd4抗體并用easysepfitc選擇試劑盒(stemcelltechnologies)收集cd4+細胞，并且純度由流式細胞術驗證為>95％。純化的cd4+t細胞使用抗cd3mab和5μg/ml的抗cd28mab激活。a)對于treg分化：培養(yǎng)基補充10ηg/mlrhtgf-β1或0.1μg/mlmsc-exo。6天后，由cd4+、cd25+定義的treg細胞和小鼠foxp3+細胞的數(shù)量由facs使用標準抗體染色技術來確定。b)對th17分化，培養(yǎng)基補充20ηg/mlril-6&1ηg/mlrhtgf-β1或0.1μg/mlmsc-exo。6天后，由cd4+、il17a+細胞定義的th17細胞的數(shù)量由facs使用標準抗體染色技術來確定。a和b中treg和th17細胞相對于未處理的細胞進行歸一化。實施例26.msc外來體對適應性免疫的調節(jié)由于msc外來體對thp-1細胞施加了深遠的激活作用以及先天性免疫在調節(jié)適應性免疫反應中起著核心作用，本發(fā)明人假設外來體可以通過其作用于先天性免疫調節(jié)適應性免疫。為了檢測這個假設，本發(fā)明人以一些修飾重復了圖11a和11b所述的實驗。在cd4+細胞分化為treg或th17細胞的過程中，t細胞與已經暴露于外來體6天的thp-1細胞孵育(圖12a和12b)。作為陽性對照，t細胞分別與tgf-β1或ril-6+tgf-β1孵育。已經暴露于msc外來體48小時的thp-1細胞誘導t細胞分化為treg但不分化為th17細胞，顯示msc外來體能夠誘導免疫抑制但不誘導促炎性t細胞反應。實施例27.通過先天性免疫調節(jié)適應性免疫cd4+小鼠t細胞被純化并如圖11a和11b中所述進行激活。a)對treg分化：培養(yǎng)基補充10ηg/mlrhtgf-β1，thp-1細胞或thp-1細胞暴露于0.1μg/mlmsc外來體48小時。thp-1細胞所加比例為1thp-1對1000cd4+小鼠t細胞。6天后，由cd4+、cd25+定義的treg細胞和小鼠foxp3+細胞的數(shù)量由facs使用標準抗體染色技術來確定。b)對th17分化，培養(yǎng)基補充20ηg/mlril-6&1ηg/mlrhtgf-β1或或thp-1細胞暴露于0.1μg/mlmsc外來體48小時。thp-1細胞所加比例為1thp-1對1000cd4+小鼠t細胞。6天后，由cd4+、il17a+定義的th17細胞的數(shù)量由facs使用標準抗體染色技術來確定。a和b中treg和th17細胞相對于未處理的細胞進行歸一化。實施例28.msc外來體刀豆蛋白a激活淋巴細胞增殖分析msc外來體可以通過它們抑制刀豆蛋白a激活的淋巴細胞的增殖的能力來分析。參見圖13。分離小鼠脾細胞并用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)標記。cfse標記的脾細胞與不同濃度的msc外來體(0.1、0.5、1和4μg/ml)在存在或不在5μg/ml刀豆蛋白a(cona)下孵育3天。msc外來體按照先前描述(lai等人，見下文)進行準備。每個處理組的熒光細胞的數(shù)量由facs定量。數(shù)據(jù)相對于未處理的對照進行歸一化并以三個重復樣品的平均數(shù)(±sd)呈現(xiàn)。msc-exo并沒有影響脾細胞的增殖(p>0.05)并且4.0μg/mlmsc-exo顯著抑制cona刺激的脾細胞的增殖(*p<0.01)。文獻參考r.c.lai,f.arslan,m.m.lee,n.s.sze,a.choo,t.s.chen,m.salto-tellez,l.timmers,c.n.lee,r.m.eloakley,g.pasterkamp,d.p.dekleijn,s.k.lim,exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury,stemcellres,4(2010)214-222。實施例29.結論(對實施例19-28)msc外來體能夠激活促炎和抗炎先天性免疫反應但僅能夠間接通過先天性免疫系統(tǒng)誘導抑制的適應性免疫反應。它們不直接或間接激活炎癥適應性免疫反應。因此，msc外來體可以被用于增強組織修復和抑制自身免疫疾病的疾病進展，例如gvhd、克羅恩病、sle、1型糖尿病、多發(fā)性硬化、als。實施例30.參考文獻(對實施例19-29)1kawai,t.&akira,s.therolesoftlrs,rlrsandnlrsinpathogenrecognitionarticle.internationalimmunology21,317-337,doi:10.1093/intimm/dxp017(2009).2devitt,a.&marshall,l.j.theinnateimmunesystemandtheclearanceofapoptoticcells.journalofleukocytebiology90,447-457,doi:10.1189/jlb.0211095(2011).3iwasaki,a.&medzhitov,r.regulationofadaptiveimmunitybytheinnateimmunesystem.science327,291-295,doi:10.1126/science.1183021(2010).4yu,l.,wang,l.&chen,s.endogenoustoll-likereceptorligandsandtheirbiologicalsignificance.journalofcellularandmolecularmedicine14,2592-2603,doi:10.1111/j.1582-4934.2010.01127.x(2010).5nauta,a.j.&fibbe,w.e.immunomodulatorypropertiesofmesenchymalstromalcells.blood110,3499-3506,doi:10.1182/blood-2007-02-069716(2007).6leblanc,k.etal.mesenchymalstemcellsfortreatmentofsteroid-resistant,severe,acutegraft-versus-hostdisease:aphaseiistudy.thelancet371,1579-1586(2008).7garcía-olmo,d.etal.aphaseiclinicaltrialofthetreatmentofcrohn'sfistulabyadiposemesenchymalstemcelltransplantation.diseasesofthecolon&rectum48,1416-14231410.1007/s10350-10005-10052-10356(2005).8singer,n.g.&caplan,a.i.mesenchymalstemcells:mechanismsofinflammation.annualreviewofpathology:mechanismsofdisease6,457-478,doi:10.1146/annurev-pathol-011110-130230(2011).9timmers,l.etal.reductionofmyocardialinfarctsizebyhumanmesenchymalstemcellconditionedmedium.stemcellresearch1,129-137(2008).10timmers,l.etal.humanmesenchymalstemcell-conditionedmediumimprovescardiacfunctionfollowingmyocardialinfarction.stemcellresearch6,206-214,doi:10.1016/j.scr.2011.01.001(2011).11lai,r.c.etal.exosomesecretedbymscreducesmyocardialischemia/reperfusioninjury.stemcellres4,214-222,doi:s1873-5061(09)00141-x[pii]10.1016/j.scr.2009.12.003(2010).12vignali,d.a.a.,collison,l.w.&workman,c.j.howregulatorytcellswork.natrevimmunol8,523-532(2008).13riley,j.l.,june,c.h.&blazar,b.r.humantregulatorycelltherapy:takeabillionorso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