本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)質(zhì)量安全檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種谷物中赭曲霉毒素A的檢測方法。
背景技術(shù)：
：赭曲霉毒素(ochratoxins)是由曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒代謝物質(zhì)。赭曲霉毒素包括7種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A(ochratoxinsA，OTA)毒性最強，分布最廣。赭曲霉毒素A是一種可溶于極性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液，微溶于水，赭曲霉毒素A的化學(xué)名稱為7-(L-β-苯基丙氨基-羰基)-羧基-5-氯代-8-羥基-3,4-二氫化-3R-甲基異氧雜奈鄰?fù)?香豆素)，分子式為C2OH18ClNO6。動物毒性試驗表明，赭曲霉毒素A具有免疫抑制毒性、神經(jīng)毒性、致畸性及致癌性。1993年，國際癌癥研究中心已將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。因此世界各國均重視對赭曲霉毒素A的檢測和控制，制定了相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國在2011年最新頒布的國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的最高限量值為5μg/kg。目前，對于赭曲霉毒素A的分析方法主要包括液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法。國內(nèi)外對于谷物中赭曲霉毒素A檢測的前處理方法主要是免疫親和柱法，因其選擇性高，特異性強，樣品回收率較高，準(zhǔn)確度高，但缺點是成本太高。為評價我國谷物中赭曲霉毒素A的污染情況，當(dāng)前急需建立一種簡單、快捷、靈敏、成本較低的谷物中赭曲霉毒素A的快速定量檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于：提供一種谷物中赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法為：先對樣品進(jìn)行提取凈化，凈化液經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC/MS/MS)檢測，最后通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定樣品中赭曲霉毒素A的含量。該方法適用于檢測小麥和玉米中赭曲霉毒素A。具體的說，本發(fā)明的一種谷物赭曲霉毒素A的檢測方法，包括如下步驟：一種谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，具體步驟如下：(1)樣品提純將乙腈與水按體積比4:1混合配制成乙腈溶液，按體積質(zhì)量比(mL/g)5:1加入谷物樣品粉末中，置于搖床中180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min收集上清液；將5mL乙腈溶液通過氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安譜公司)，棄淋洗液；取5mL上清液過氨基固相萃取柱，棄過柱液；再取5mL乙腈溶液過柱淋洗兩次，棄淋洗液；將乙腈與甲酸按體積比17:3配制成色譜乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脫富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；取吹干后的殘渣用甲醇溶解，過0.22μm的濾膜(SCAA-104，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)，濾液即為樣品提純液；(2)取濃度依次為0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，獲得赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)曲線；(1)(3)對步驟(1)獲得的樣品提純液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，檢測結(jié)果帶入步驟(2)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，以外標(biāo)法測得樣品中赭曲霉素A的濃度，在依據(jù)公式(1)計算樣品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——樣品中赭曲霉素A含量，單位為微克每克，μg/g；C——待測液中赭曲霉素A的濃度，單位為微克每毫升，μg/mL；V——定容體積，單位為毫升，mL；M——樣品稱樣量，單位為克，g。進(jìn)一步，本發(fā)明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，所述高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測具體是指：(1)色譜條件：a)色譜柱：WatersT-3色譜柱(4.6×150mm,5μm)；b)進(jìn)樣量：2μL；c)柱溫：40℃；d)流速：0.4mL/min；e)流動相和洗脫時間：流動相A：含5mmol/L乙酸銨的水溶液；流動相B：甲醇；采用線性梯度洗脫：90％A，10％B初始，0-3min，A為90％-10％，B為10％-90％，3-5min，A為10％，B為90％；5-7min,，A為10％-90％，B為10％-90％；平衡3min，總共單次樣品運行時間10min；(2)質(zhì)譜條件：離子化模式為電噴霧電離正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度500℃；駐留時間100ms；霧化氣壓50psi；輔助氣壓50psi；噴霧電壓5500V；碰撞室射出電壓6V；赭曲霉毒素A質(zhì)譜條件參數(shù)如表1所示：表1赭曲霉毒素A質(zhì)譜條件參數(shù)注*：定量離子。進(jìn)一步，如本發(fā)明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法中，所述谷物為小麥或玉米。進(jìn)一步，如本發(fā)明所述谷物中赭曲霉毒素A的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法中，所述谷物樣品粉末是指過0.5mm孔篩后的谷物樣品粉末。本發(fā)明的一種谷物中赭曲霉素A的檢測方法可應(yīng)用于小麥和玉米等谷物中赭曲霉素A的提取、凈化和檢測。與其他檢測方法相比具有簡單、快捷、靈敏準(zhǔn)確的特點，可適用于大批量樣品的檢測。同時本發(fā)明解決了傳統(tǒng)的赭曲霉素A采用免疫親和柱檢測成本高的問題。本方法的建立使小麥和玉米等谷物中赭曲霉素A的含量得以準(zhǔn)確測定，能為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估提供準(zhǔn)確的分析方法。附圖說明圖1為小麥、玉米空白樣品離子色譜圖。圖2為濃度為2g/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖。圖3為小麥空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為玉米空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為OTA樣品色譜圖。具體實施方式實施例中所用的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為日本島津20ADXR液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)美國AB3500質(zhì)譜。實施例1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)按GB/T25220-2010的方法對從市場購買的小麥樣品和玉米樣品進(jìn)行檢測，取OTA未檢出的小麥和玉米(如圖1所示，其中圖1A為小麥空白樣品，圖1B為玉米空白樣品)作為空白樣品；將乙腈與水按體積比4:1混合配制成乙腈溶液，按體積質(zhì)量比(mL/g)5:1分別加入空白樣品粉末(磨碎過0.5mm孔篩)中，搖床180rpm振蕩30min后，2500rpm離心5min收集上清液；將5mL乙腈溶液通過氨基固相萃取柱(500ng,6mL.安譜公司)，棄淋洗液；取5mL上清液過氨基固相萃取柱，棄過柱液；再取5mL乙腈溶液過柱淋洗兩次，棄淋洗液；將乙腈與甲酸按體積比17:3配制成色譜乙腈-甲酸溶液，取10mL乙腈-甲酸溶液加入氨基固相萃取柱，洗脫富集在柱上的赭曲霉毒素A，收集洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；取吹干后的殘渣用甲醇溶解，過0.22μm的濾膜(SCAA-104，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)，濾液即為樣品提純液(空白基質(zhì))；(2)取2g/L赭曲霉素A標(biāo)準(zhǔn)母液(OTA標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖如圖2所示)置于棕色小瓶中，用乙腈稀釋成濃度為50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別用步驟(1)中的空白小麥和玉米基質(zhì)稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別配成0.5、1、5、10、20μg/L的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，小麥和玉米的空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖3、4所示。具體高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法為：進(jìn)樣量2μL，柱溫40℃。高效液相色譜分離的條件為：色譜柱為WatersT-3色譜柱(4.6×150mm,5μm)，流動相：A為水(含5mmol/L乙酸銨)，B為甲醇，采用線性梯度洗脫：洗脫時間：90％A，10％B初始，0-3min，A為90％-10％，B為10％-90％，3-5min，A為10％，B為90％；5-7min,，A為10％-90％，B為10％-90％；平衡3min，總共單次樣品運行時間10min。串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件為：電噴霧電離正離子模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度500℃；駐留時間100ms；霧化氣壓50psi；輔助氣壓50psi；噴霧電壓5500V；碰撞室射出電壓6V；赭曲霉毒素A質(zhì)譜條件參數(shù)如表1所示：表1赭曲霉毒素A質(zhì)譜條件參數(shù)注*：定量離子。赭曲霉毒素A線性方程、檢出限和定量限如表2所示:表2赭曲霉毒素A線性方程、檢出限和定量限采用基質(zhì)加標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，赭曲霉素A在不同的基質(zhì)中均線性良好，相關(guān)系數(shù)(R)≥0.99。靈敏度：將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用基質(zhì)梯度稀釋的方法測定方法的靈敏度，方法的定量為0.5μg/L，檢出限為0.25μg/L。回收率：采用基質(zhì)加標(biāo)法對方法的回收率進(jìn)行考察，高、中、低(1、2、5μg/kg)三個濃度3個平行的添加回收率范圍為81.2-102.6％，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.41-4.26％。精密度：赭曲霉素A在小麥和玉米基質(zhì)中的日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.71-3.53％，日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.69-1.58％，重復(fù)性：赭曲霉素A在小麥和玉米基質(zhì)中的重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.72-4.56％。實施例2樣品檢測1、制備樣品提純液取市場采集的小麥和玉米樣品，分別按下述操作過程進(jìn)行分析檢測：(1)取小麥和玉米樣品，粉碎后過篩(樣品經(jīng)粉碎機粉碎至能完全通過0.5mm篩為止)，置于4℃冰箱內(nèi)保存待用；(2)將樣品取出恢復(fù)至室溫后，取5g樣品粉末置于150mL三角瓶中，加入25mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液，搖床180r/min震蕩30min后，2500rpm離心5min，取上清液；(3)將5mL乙腈-水80:20(v/v)通過氨基固相萃取柱，棄淋洗液；(4)取5mL上清液通過氨基固相萃取柱，棄過柱液，分別取5mL乙腈-水80:20(v/v)的溶液過柱淋洗，棄淋洗液；(5)將色譜乙腈和甲酸按體積比85:15(v/v)混合后，準(zhǔn)確取10mL混合液加入氨基固相萃取柱進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液于干凈的玻璃試管中，氮氣吹干；(6)吹干后殘渣用1mL甲醇溶液溶解，過0.22μm的濾膜后，過濾液待進(jìn)樣分析。(2)對本實施例中獲得的樣品(玉米樣品1、玉米樣品2、小麥樣品1、小麥樣品2)提純液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，OTA樣品色譜圖如圖5所示，其中，圖5A為玉米樣品1檢測結(jié)果，圖5B為玉米樣品2檢測結(jié)果，圖5C為小麥樣品1檢測結(jié)果，圖5D為小麥樣品2檢測結(jié)果；再將檢測結(jié)果帶入實施例1獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，以外標(biāo)法測得樣品中赭曲霉素A的濃度，在依據(jù)公式(1)計算樣品中赭曲霉毒素A的含量；式(1)中：X——樣品中赭曲霉素A含量，單位為微克每克，μg/g；C——待測液中赭曲霉素A的濃度，單位為微克每毫升，μg/mL；V——定容體積，單位為毫升，mL；M——樣品稱樣量，單位為克，g。本實施例中不同樣品中赭曲霉毒素A的檢測結(jié)果見表3:表3不同樣品中赭曲霉毒素A的檢測結(jié)果名稱濃度(ug/kg)玉米1玉米2小麥1小麥2赭曲霉素A4.521.891.01-aa低于檢出限同時，為了驗證方法的精密度及準(zhǔn)確性，采用國標(biāo)GB/T25220-2010測定谷物中赭曲霉毒素A，通過本方法所得到的赭曲霉毒素A含量與國標(biāo)方法得到的含量偏差≤5％，證明方法準(zhǔn)確可靠。并且本方法使用的氨基固相萃取柱價格遠(yuǎn)低于國標(biāo)方法的免疫親和柱，極大的節(jié)省了成本。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實施例中所作的描述，不偏離本發(fā)明方案中心的修改都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3