本發(fā)明屬于油脂檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種油脂中縮水甘油酯的檢測方法。

背景技術(shù)：

縮水甘油酯(簡稱GEs)是縮水甘油和游離脂肪酸的酯化產(chǎn)物，其作為一類末端環(huán)氧酯，最初主要用于研究酯類的末端環(huán)氧化功能。然而，德國聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評估委員會(huì)(BFR)于2008年首次證實(shí)了精煉食用油中存在著大量的GEs。GEs是一種普遍存在于精煉食用油中的污染物。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將其定為2A級致癌物，同時(shí)其被德國油脂科學(xué)學(xué)會(huì)定義其為2類致癌物。

目前關(guān)于食用油脂中縮水甘油酯的檢測方法分為間接檢測方法和直接檢測方法。間接方法即選取與縮水甘油酯有特異性反應(yīng)的物質(zhì)衍生化處理,生成物易于氣相色譜或高效液相色譜等儀器進(jìn)行定量分析。直接方法即不破壞縮水甘油酯結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,使縮水甘油酯與甘油三酯分離,不進(jìn)行衍生化處理直接檢測的方法，一般使用質(zhì)譜法進(jìn)行檢測，成本高，所需時(shí)間較長，操作也相對麻煩。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先用路易斯酸將油脂中的縮水甘油酯催化使其環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)，生成含有羰基的化合物，通過使用分光光度法檢測羰基化合物含量來實(shí)現(xiàn)。比一般的色譜質(zhì)譜法簡單，成本低，檢測快速準(zhǔn)確，且具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性，為檢測油脂縮水甘油酯提供了一種十分可靠的方法。

本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種油脂中縮水甘油酯的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1：油脂中加入路易斯酸溶液，油脂中的縮水甘油酯在路易斯酸的催化作用發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，環(huán)氧基開環(huán)形成羰基化合物；路易斯酸溶液中的路易斯酸為AlCl₃、Me₃Al、Me₂AlCl、EtAlCl₂、SnCl₄、BF₃·OEt₂、HfCl₄或ZrCl₄中的一種。

步驟2：將步驟1得到的羰基化合物中加入過量的2,4-二硝基苯肼，發(fā)生加成反應(yīng)，生成2,4-二硝基苯腙；

步驟3：使用分光光度法檢測2,4-二硝基苯腙的濃度。

進(jìn)一步，路易斯酸溶液使用二氯甲烷作為溶劑配制，路易斯酸溶液濃度為15mmol/L。

進(jìn)一步，所述步驟1中發(fā)生開環(huán)反應(yīng)的溫度是-20℃。

進(jìn)一步，所述步驟1中發(fā)生開環(huán)反應(yīng)的時(shí)間是60min。

進(jìn)一步，所述步驟2中發(fā)生加成反應(yīng)的溫度是45℃。

進(jìn)一步，所述步驟2中發(fā)生加成反應(yīng)的時(shí)間是30min。

進(jìn)一步，所述步驟3使用分光光度法檢測苯腙濃度，檢測波長是355nm。

本發(fā)明反應(yīng)過程如下：

反應(yīng)步驟1：在路易斯酸的催化下，縮水甘油酯的環(huán)氧基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成帶一個(gè)羰基的化合物，反應(yīng)如圖2。

反應(yīng)步驟2：2,4-二硝基苯肼與羰基發(fā)生衍生化反應(yīng)如圖3，生成2,4-二硝基苯腙，具有紫外吸收。

棕櫚酸縮水甘油酯、油酸縮水甘油酯和亞油酸縮水甘油酯分別是食用油中含量最多的三種飽和、不飽和和多不飽和脂肪酸縮水甘油酯，溶于醇、酯類和氯仿，因此本實(shí)驗(yàn)采用棕櫚酸縮水甘油酯、油酸縮水甘油酯和亞油酸縮水甘油酯作為標(biāo)品。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:

(1)棕櫚酸縮水甘油酯、油酸縮水甘油酯和亞油酸縮水甘油酯分別是食用油中含量最多的三種飽和、不飽和和多不飽和脂肪酸縮水甘油酯，溶于醇、酯類和氯仿，具有化學(xué)性質(zhì)較活潑的環(huán)氧基?？s水甘油酯本身不具有紫外可見吸收光譜，所以可以通過衍生化使其環(huán)氧基斷裂生成具有紫外可見光的化合物。

(2)路易斯酸可溶于水和許多有機(jī)溶劑，化學(xué)性質(zhì)活潑，可使環(huán)氧基在溫和的反應(yīng)條件和較短的反應(yīng)時(shí)間下開環(huán)斷裂生成羰基化合物，并且生成物比較穩(wěn)定，進(jìn)而可以使用檢測醛基中羰基的方法來檢測，然后推算縮水甘油酯的含量。

(3)本檢測方法較于之前的直接和間接法檢測縮水甘油酯的方法來說，檢測成本低，檢測快速準(zhǔn)確，且具有較高的靈敏性和準(zhǔn)確性，為檢測油脂縮水甘油酯提供了一種十分可靠的方法。

附圖說明

圖1縮水甘油酯含量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2步驟1油脂中的縮水甘油酯在路易斯酸的作用下發(fā)生開環(huán)反應(yīng)示意圖；

圖3步驟2羰基化合物與2,4-二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)示意圖。

具體實(shí)施方法

實(shí)施例1：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

(1)精確稱取50mg 2,4-二硝基苯肼到100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為A液。精確稱取100mg縮水甘油酯于100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，為B液。精確稱取4g氫氧化鉀于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為G液。

(2)分別取4個(gè)10mL容量瓶，精確稱取0.5mL B液于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，為C液。分別精確稱取2mL、4mL和6mL C液于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度,分別為D液、E液和F液。

(3)精確稱取10mg氯化鋁于15mL具塞圓底燒瓶中，再加入5mL的二氯甲烷將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h得到路易斯酸溶液。之后精確吸取1mL的D液、E液、F液和C液分別加入其中，反應(yīng)溫度-20℃，充分反應(yīng)60min。之后分別精確吸取12組催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mLG液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，各管在355nm波長下測吸光度。根據(jù)各管的吸光度值減去空白管的吸光度值繪制縮水甘油酯含量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

實(shí)施例2：

樣品的檢測

(1)油樣空白檢測：

①精確稱取50mg 2,4-二硝基苯肼到100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為A液。精確稱取4g氫氧化鉀于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為G液。

②精確稱取5mL的二氯甲烷于15mL具塞圓底燒瓶中，將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h。之后加入1ml油樣，完全反應(yīng)催化時(shí)間60min，溫度-20℃。之后分別精確吸取催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mL G液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，在355nm波長下測定各管的吸光度。

(2)油樣檢測：

①精確稱取10mg氯化鋁于15mL具塞圓底燒瓶中，再加入5mL的二氯甲烷將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h得到路易斯酸溶液。之后精確吸取1mL油樣于其中，完全反應(yīng)催化時(shí)間60min，溫度-20℃，各3個(gè)平行。之后分別精確吸取催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mL G液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，在355nm波長下測定各管的吸光度。

②355nm波長下油樣檢測的吸光度值減去油樣空白檢測方法中檢測的吸光度值的結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算即可得油樣中的縮水甘油酯含量。

油脂縮水甘油酯含量計(jì)算公式：

式中字母代表：

X-代表縮水甘油酯含量(mg/ml)；

Y-代表油樣檢測的吸光度值；

Y_空-代表油樣空白檢測的吸光度值；

A,B-代表標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝AX+B的系數(shù)。

實(shí)施例3：

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

(1)精確稱取50mg 2,4-二硝基苯肼到100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為A液。精確稱取100mg縮水甘油酯于100mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，為B液。精確稱取4g氫氧化鉀于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為G液。

(2)分別取4個(gè)10mL容量瓶，精確稱取0.5mL B液于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，為C液。分別精確稱取2mL、4mL和6mL C液于10mL容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度,分別為D液、E液和F液。

(3)精確稱取10mgZrCl₄于15mL具塞圓底燒瓶中，再加入5mL的二氯甲烷將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h得到路易斯酸溶液。之后精確吸取1mL的D液、E液、F液和C液分別加入其中，反應(yīng)溫度-20℃，充分反應(yīng)60min。之后分別精確吸取12組催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mLG液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，各管在355nm波長下測吸光度。根據(jù)各管的吸光度值減去空白管的吸光度值繪制縮水甘油酯含量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

實(shí)施例4：

樣品的檢測

(2)油樣空白檢測：

①精確稱取50mg 2,4-二硝基苯肼到100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為A液。精確稱取4g氫氧化鉀于100mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，為G液。

②精確稱取5mL的二氯甲烷于15mL具塞圓底燒瓶中，將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h。之后加入1ml油樣，完全反應(yīng)催化時(shí)間60min，溫度-20℃。之后分別精確吸取催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mL G液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，在355nm波長下測定各管的吸光度。

(2)油樣檢測：

①精確稱取10mgZrCl₄于15mL具塞圓底燒瓶中，再加入5mL的二氯甲烷將其放置于恒溫磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?h得到路易斯酸溶液。之后精確吸取1mL油樣于其中，完全反應(yīng)催化時(shí)間60min，溫度-20℃，各3個(gè)平行。之后分別精確吸取催化產(chǎn)物1mL和1mL A液分別于干燥的具塞比色管中，充分搖勻，放置于恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)為45℃，反應(yīng)時(shí)間30min(2,4-二硝基苯肼檢測羰基化合物的反應(yīng)條件)，完全反應(yīng)完后，在反應(yīng)溶液中各加入8mL G液，用離心機(jī)3000r，離心5min，取上清液。以A液做為空白調(diào)零，在355nm波長下測定各管的吸光度。②355nm波長下油樣檢測的吸光度值減去油樣空白檢測方法中檢測的吸光度值的結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算即可得油樣中的縮水甘油酯含量。

油脂縮水甘油酯含量計(jì)算公式：

式中字母代表：

X-代表縮水甘油酯含量(mg/ml)；

Y-代表油樣檢測的吸光度值；

Y_空-代表油樣空白檢測的吸光度值；

A,B-代表標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝AX+B的系數(shù)。