本發(fā)明涉及污水生物處理領(lǐng)域，提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮(NO)原位測(cè)定的方法。

背景技術(shù)：

生物脫氮過(guò)程包括硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程，在生物反硝化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生NO中間產(chǎn)物。NO對(duì)微生物作用存在不同論斷，一方面NO是無(wú)色無(wú)味且難溶于水的有毒氣體，對(duì)微生物會(huì)有一定的毒害作用；但另一方面NO是真核生物體內(nèi)重要的活性分子，在微生物體內(nèi)也發(fā)揮著重要作用，例如在過(guò)氧化氫壓力下保護(hù)微生物細(xì)胞、提高微生物耐藥性等。關(guān)于脫氮微生物胞內(nèi)NO對(duì)微生物作用的研究可能為脫氮型活性污泥的生理特性提供新的思路，因此對(duì)脫氮型微生物胞內(nèi)NO的研究具有重要意義。

然而目前對(duì)NO的檢測(cè)技術(shù)還存在不足之處，尤其是對(duì)脫氮型活性污泥中不同種類微生物NO產(chǎn)生情況及對(duì)反硝化作用影響的技術(shù)相對(duì)缺乏，開(kāi)發(fā)一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方法來(lái)研究脫氮型活性污泥微生物在反硝化過(guò)程中的作用及不同種類微生物在此過(guò)程中的NO貢獻(xiàn)情況十分必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)象不足之處，本發(fā)明提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮(NO)原位測(cè)定的方法，該方法可以對(duì)所有脫氮型污泥進(jìn)行微生物胞內(nèi)NO的原位測(cè)定，以此來(lái)確定反硝化過(guò)程中NO變化情況及NO在不同微生物細(xì)胞中的分布情況，本方法為分析各菌群對(duì)反硝化功能分析提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的優(yōu)化方案。

一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)、選取未膨脹的脫氮型污泥或已膨脹的脫氮型污泥作為目標(biāo)污泥，分析其特征情況；

(2)、用1*PBS清洗目標(biāo)泥三次，并用1*PBS稀釋至原本泥量，去除脫氮型污泥中其他雜質(zhì)的干擾；

(3)、未膨脹的脫氮型污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方案為：吸取步驟(2)1-10μL樣品均勻地涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個(gè)well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn)，并在室溫下晾干；在避光條件下，取1-20μL濃度為1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有樣品的每個(gè)well孔中，DAF-FM DA添加量以探針液包被住well孔中污泥；將樣品放置于20-37℃恒溫條件下靜置5-20分鐘后取出，在避光條件下用1*PBS洗滌玻片三次，將未進(jìn)入微生物細(xì)胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干，加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，進(jìn)行后續(xù)熒光原位檢測(cè)；

或已膨脹的脫氮型污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方案為：在避光條件下，先將稀釋好的1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)與步驟(2)樣品等體積混合，混勻后置于0-4℃條件下靜置5-20分鐘，后再吸取1-10μL加有DAF-FM DA的樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個(gè)well孔中(涂片量以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn))，并置于室溫下晾干，加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，進(jìn)行后續(xù)熒光原位檢測(cè)。

未膨脹的脫氮型污泥的SVI值小于150mL/g，已膨脹的脫氮型污泥的SVI值大于150mL/g。

DAF-FM DA的溶液優(yōu)選為1*PBS。

該方法可以對(duì)正常的未膨脹污泥及膨脹脫氮型污泥都可以進(jìn)行微生物胞內(nèi)NO的原位測(cè)定，以此來(lái)確定反硝化過(guò)程中NO變化情況及NO在不同微生物細(xì)胞中的分布情況，本方法為分析各菌群對(duì)反硝化功能分析提供一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的優(yōu)化方案。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮(NO)原位測(cè)定的方法，對(duì)正常的未膨脹污泥及膨脹污泥都可以進(jìn)行微生物胞內(nèi)NO的原位測(cè)定，以此來(lái)確定反硝化過(guò)程中NO變化情況及NO在不同微生物細(xì)胞中的分布情況。

(2)該發(fā)明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮(NO)原位測(cè)定的方法，和一氧化氮反應(yīng)形成的熒光產(chǎn)物受pH值的影響小，其產(chǎn)生的熒光更加穩(wěn)定，不容易淬滅且其檢測(cè)敏感度高。

(3)該發(fā)明提供的一種脫氮型活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮(NO)原位測(cè)定的方法，后期可以和膨脹污泥絲狀菌原位雜交試驗(yàn)相結(jié)合，探究具體絲狀菌中對(duì)NO及反硝化作用的影響。

附圖說(shuō)明

圖1(1a-1d)為本發(fā)明脫氮型無(wú)膨脹活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮熒光原位圖(1000倍)；

圖2(2a-2d)為本發(fā)明脫氮型膨脹活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮熒光原位圖(1000倍)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方法對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、選取實(shí)驗(yàn)室中未膨脹的和已膨脹的脫氮型污泥作為目標(biāo)污泥，將未膨脹脫氮型污泥標(biāo)記為1號(hào)樣片，膨脹的脫氮型污泥標(biāo)記為2號(hào)樣品；

2、分別分析1號(hào)和2號(hào)樣品的特征：1號(hào)和2號(hào)樣品的污泥濃度分別為3000mg/L和2500mg/L，SVI值分別為65mL/g和281mL/g，總氮去除率分別為55.3％和68.6％；

3、用1*PBS清洗目標(biāo)泥三次，并用1*PBS稀釋至原本泥量，去除污泥中其他雜質(zhì)的干擾；

4、將1號(hào)樣品混勻后均分為4份，分別標(biāo)記為A、B、C和D樣品；

5、在避光條件下，將原有的DAF-FM DA(NO熒光探針)在20℃水浴溫育片刻至全部融解后，將其濃度稀釋為10μmol/L。

6、分別取1mL的A和B樣品置于5mL的離心管中，在避光條件下，添加等體積稀釋好的DAF-FM DA(NO熒光探針)，輕輕混勻。將A樣品置于4℃冰箱，B樣品放置于37℃恒溫箱中，靜置20分鐘后取出。

7、在避光條件下，用10μL槍頭分別吸取上過(guò)探針的A和B樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個(gè)well孔中，涂片量以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn)，本試驗(yàn)涂片量為3-5μL，并在室溫下晾干；

8、用10μL槍頭分別吸取C和D樣品均勻的涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個(gè)well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn)，本試驗(yàn)涂片量為3-5μL，并在室溫下晾干；

9、在避光條件下，分別取10μL DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有C和D樣品的每個(gè)well孔中，其添加量以探針液包被住well孔中污泥為宜，本試驗(yàn)中添加量為10μL。將C樣品置于4℃冰箱，D樣品放置于37℃恒溫箱中，靜置20分鐘后取出。

10、在避光條件下將C和D樣品用1*PBS洗滌玻片三次，將未進(jìn)入微生物細(xì)胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干；

11、待A、B、C和D樣品都處理完畢后，分別對(duì)各樣品加入抗熒光衰減劑，并用指甲油密封，放置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，圖(1a-1d)分別對(duì)應(yīng)未膨脹A、B、C和D樣品。

12、對(duì)不同條件下的NO顯微鏡照片進(jìn)行比對(duì)分析，得出最優(yōu)的脫氮型無(wú)膨脹活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方案為：吸取3-5μL樣品均勻地涂在事先用明膠包被好的玻片上的每個(gè)well孔中，涂片量同樣以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn)，并在室溫下晾干；在避光條件下，取10μL DAF-FM DA(NO熒光探針)添加到涂有樣品的每個(gè)well孔中，其添加量以探針液包被住well孔中污泥為宜。將樣品放置于37℃恒溫靜置20分鐘后取出后在避光條件下用1*PBS洗滌玻片三次，將未進(jìn)入微生物細(xì)胞的DAF-FM DA(NO熒光探針)液去除，并置于室溫下晾干，熒光照片(圖1-d)顯示脫氮型微生物胞內(nèi)NO分布均勻；

13、將2號(hào)樣品按照3-12的步驟進(jìn)行分析，得出最優(yōu)的脫氮型膨脹活性污泥微生物胞內(nèi)一氧化氮原位測(cè)定的方案為：在避光條件下，先將稀釋好的10μmol/L的DAF-FM DA(NO熒光探針)與樣品等量混合，輕輕混勻后置于4℃條件下靜置20分鐘，后再吸取3-5μL樣品均勻平鋪涂在事先用明膠包被好的玻片每個(gè)well孔中(涂片量以剛好平鋪實(shí)際玻片上well孔為準(zhǔn))，并在室溫下晾干，熒光照片顯示即使在絲狀菌體內(nèi)(圖2-a)也有NO產(chǎn)生并廣泛分布，其中圖(2a-2d)分別對(duì)應(yīng)已膨脹A、B、C和D樣品。。

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