本發(fā)明涉及利用生物敏感標志物檢測水體污染，更具體地說，本發(fā)明涉及一種利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染的方法。

背景技術(shù)：

隨著城鎮(zhèn)化和工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，水體污染日益加劇。水域中的水體污染物也各有不同，有的為單一污染物，也有多種污染物混合污染。對于未知水域，只有測知水體是否被污染，是單一污染物的污染，還是多種污染物的污染，其污染程度如何，對生物的危害達到何種程度，才能調(diào)控和防治。對于水體中受到重金屬或多環(huán)芳烴一種或兩種污染時，用化學(xué)方法可以定性、定量檢測到污染，但是無法檢測其危害性和危害程度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。

本發(fā)明還有一個目的就是提供一種利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染的方法，本方法利用魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物，可敏感地監(jiān)測鎘等重金屬污染的污染程度和危害程度，還可以敏感地檢測菲(Phe)等多環(huán)芳烴污染的污染程度和危害程度，為水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、毒理診斷、調(diào)控和防治提供準確、快速的科學(xué)方法。

為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其他優(yōu)點，提供了一種利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染的方法。本檢測方法為獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物。其中，Ca²⁺-ATP是三磷酸腺苷-鈣的簡寫。

優(yōu)選的是，所述魚的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關(guān)。

優(yōu)選的是，所述魚的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中多環(huán)芳烴的濃度呈負相關(guān)。

優(yōu)選的是，建立魚的Ca²⁺-ATP酶活性與污染物濃度關(guān)系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中水體污染物的濃度。

優(yōu)選的是，所述標準曲線為魚的Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度的關(guān)系曲線，或者魚的Ca²⁺-ATP酶活性與多環(huán)芳烴濃度的關(guān)系曲線。

優(yōu)選的是，所述魚的Ca²⁺-ATP酶活性測定包括如下步驟：

步驟一、待測樣本處理：制備全魚勻漿，然后離心分層，取上清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本對應(yīng)加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置。預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、酶促反應(yīng)：在對照管和測定管中各加入等量的試劑盒之試劑一、試劑三、試劑四和試劑五，然后在所述測定管中加入待測樣本，混勻，37℃準確反應(yīng)10min；

步驟四、終止反應(yīng)：在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑七終止反應(yīng)，然后在所述對照管中加入與步驟三等量的待測樣本，混勻，分別離心分層取4號上清液和5號上清液；試劑七為反應(yīng)終止劑，加試劑七后再加入樣品則不繼續(xù)反應(yīng)，故對照管為后加樣品使之不起反應(yīng)，以平衡其他樣品管，減少測定誤差。

步驟五、定磷：將等量的4號上清液、5號上清液和磷標準品應(yīng)用液分別對應(yīng)加入4、5、6號管中，然后分別加入等量的定磷劑混勻，于37℃水浴30min后涼至常溫，預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長660nm處，逐管測定其光密度，分別記為對照OD值，測定OD值，標準OD值，然后代入如下公式計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性：

優(yōu)選的是，所述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65％的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，且所述離心分層用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min。

優(yōu)選的是，所述步驟二中等量的雙蒸水、蛋白標準品和待測樣本都是0.05ml，蛋白標準品的濃度為0.563g/L，分別加入考馬斯亮藍顯色劑的量均為3ml，靜置10min。

優(yōu)選的是，所述步驟三中，在對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑一130μl、試劑三40μl、試劑四40μl和試劑五40μl，然后在所述測定管中加入濃度為1％的待測樣本200μl，反應(yīng)溫度為37℃；所述步驟四中，在對照管和測定管中各加入試劑盒的試劑七50μl，然后在所述對照管中加入濃度為1％的待測樣本200μl；所述步驟五中等量的4號上清液、5號上清液和磷標準品應(yīng)用液均為200ul，加入定磷劑的量均為2000ul。優(yōu)選的是，所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明以水域中魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物，通過對比Ca²⁺-ATP酶活性就可以檢測出水體是否受到污染，不但檢測準確和敏感，而且直觀反映該水域的污染對生物的危害程度。特別是魚的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中重金屬鎘或多環(huán)芳烴的一種或兩種的濃度均呈負相關(guān)，所以檢測到魚的Ca²⁺-ATP酶活性越低，其的水域受污染的程度越大，并且明示受到重金屬鎘或多環(huán)芳烴的一種或多種的污染。通過建立魚的Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度關(guān)系的標準曲線，或者魚的Ca²⁺-ATP酶活性與菲等多環(huán)芳烴濃度關(guān)系的標準曲線，可以將待檢測水域中與建立標準曲線同種同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性比對，獲得水域中重金屬鎘濃度或菲等多環(huán)芳烴濃度或綜合污染濃度值，并且能反映出目前的污染程度對生物是否在安全范圍或受到危害。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書能夠據(jù)以實施。

實施例1

本方案利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并用所述魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物，通過檢測魚的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比對同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與某污染物濃度關(guān)系的標準曲線，就可以獲悉水體是否受到某污染物的污染，不但檢測準確和敏感，而且能直觀反映該水域的某污染物的污染程度及其對生物的危害程度。

實施例2

本方案利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物，根據(jù)魚的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關(guān)，通過測定魚的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比對同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與鎘濃度關(guān)系的標準曲線，如果檢測樣本魚的Ca²⁺-ATP酶活性比無污染的同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性低，則判斷水域受到鎘的污染；如果比無污染的同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性越低，則判斷水域的鎘污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。

實施例3

本方案利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染程度的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物，根據(jù)魚的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中菲(Phe)等多環(huán)芳烴的濃度呈負相關(guān)，通過測定魚的Ca²⁺-ATP酶活性，然后比對同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與某多環(huán)芳烴濃度關(guān)系的標準曲線，如果檢測樣本魚的Ca²⁺-ATP酶活性比無污染的同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性低，則判斷水域受到某多環(huán)芳烴的污染；如果比無污染的同類同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性越低，則判斷水域的某多環(huán)芳烴污染越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。

實施例4

本方案利用魚的Ca²⁺-ATP酶活性檢測水體污染的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的Ca²⁺-ATP酶作為敏感生物標記物。首先通過實驗建立魚的Ca²⁺-ATP酶活性與某污染物濃度關(guān)系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中某污染物的濃度。

通過實驗建立魚的Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度關(guān)系的標準曲線如下：

本實驗的檢測樣本以海水青鳉為例，從養(yǎng)殖10天齡的仔魚開始，分10組，每組3個平行進行，實驗結(jié)束每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3x3＝9個數(shù)據(jù)，將每組9個數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計后得到各組魚的結(jié)果。10組仔魚分別養(yǎng)殖在鎘濃度為0，80，160，240，320，400，480，560，640，720μg/L的水體中，養(yǎng)殖條件均是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天投喂飼料三次，總投喂量為投喂時魚體濕重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體鎘的變化，7天后隨機采集魚樣品，分別稱重，存于-80℃冰箱中(因忙未能即測)用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計后的各組魚Ca²⁺-ATP酶活性分別是：0.272、0.260、0.223、0.203、0.152、0.112、0.095、0.083、0.068、0.063μmolPi/mgprot/hour。海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中重金屬鎘的濃度呈負相關(guān)，然后根據(jù)實驗結(jié)果繪制關(guān)系標準曲線。

通過實驗建立魚的Ca²⁺-ATP酶活性與菲(Phe)濃度關(guān)系的標準曲線如下：

本實驗的檢測樣本以海水青鳉為例，從養(yǎng)殖10天齡的仔魚開始，分6組進行，每組3個平行進行，實驗結(jié)束每個平行取3個樣品測定，每組測定3x3＝9個數(shù)據(jù)，將每組9個數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計后得到各組魚的結(jié)果。6組中的1組仔魚作為0周樣品存于-80℃冰箱中，待測定用作對照；另外5組仔魚分別養(yǎng)殖在菲濃度為0、250、500、750、1000μg/L的水體中，養(yǎng)殖條件均是鹽度30±2，水溫為28±2℃，pH為8.10，溶氧量≥6.10mg/L，光暗比為14h:10h，各組實驗操作均相同。每天三次投喂飼料，總投喂量為投喂時魚體濕重的5％。每天仔細觀察和記錄仔稚魚活動、攝食、畸形、死亡等，并跟蹤檢測水體和魚體菲的變化，7天后隨機采集魚樣品，分別稱重，存于-80℃冰箱中(暫存待測)用于分子、基因、生理、毒理和生化測定。測定并經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計后的各組魚Ca²⁺-ATP酶活性分別是：0.203、0.133、0.095、0.054、0.036μmolPi/mgprot/hour。海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性與水體中菲(Phe)的濃度呈負相關(guān)，然后根據(jù)實驗結(jié)果繪制關(guān)系標準曲線。

測定待測水域中的海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性之具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣大小的海水青鳉制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將等量的雙蒸水(空白對照)、蛋白標準品和待測樣本對應(yīng)加入1、2、3號管中，并分別向各管加入等量的考馬斯亮藍顯色劑，分別混勻，靜置。預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度(OD)，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、酶促反應(yīng)：在對照管和測定管中各加入等量的試劑盒之試劑一、試劑三、試劑四和試劑五，然后在所述測定管中加入待測樣本，混勻，37℃準確反應(yīng)10min；

步驟四、終止反應(yīng)：在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑七終止反應(yīng)，然后在所述對照管中加入與步驟三等量的待測樣本，混勻，分別離心分層取4號上清液和5號上清液；試劑七為反應(yīng)終止劑，加試劑七后再加入樣品則不繼續(xù)反應(yīng)，故對照管為后加樣品使之不起反應(yīng)，以平衡其他樣品管，減少測定誤差。

步驟五、定磷：將等量的4號上清液、5號上清液和磷標準品應(yīng)用液分別對應(yīng)加入4號管、5號管和6號管中，然后分別加入等量的定磷劑混勻，于37℃水浴30min后涼至常溫，預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長660nm處，逐管測定其光密度，分別記為對照OD值，測定OD值，標準OD值，然后代入如下公式計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性：

然后將計算得海水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受到污染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度的大小或綜合污染的大小，更能知道水體對生物體的危害程度。

實施例5

利用實驗可以建立任何水體任何魚種的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度關(guān)系的標準曲線，或者建立不同種類的魚的Ca²⁺-ATP酶活性與菲濃度關(guān)系的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要做樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。

測定待測水域中的魚的Ca²⁺-ATP酶活性具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當(dāng)?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將雙蒸水、濃度為0.563g/L的蛋白標準品和待測樣本各0.05ml加入1、2、3號管中，并分別向各管加入考馬斯亮藍顯色劑3ml，分別混勻，靜置10min，預(yù)熱到35℃，預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、酶促反應(yīng)：在對照管和測定管中各加入等量的試劑盒試劑一130μl、試劑三40μl、試劑四40μl和試劑五40μl，然后在所述測定管中加入待測樣本200μl，混勻，37℃準確反應(yīng)10min；

步驟四、終止反應(yīng)：在所述對照管和測定管中各加入試劑盒的同樣量的試劑七50μl終止反應(yīng)，然后在所述對照管中加入待測樣本200μl，混勻，分別離心分層取4號上清液和5號上清液；

步驟五、定磷：將4號上清液、5號上清液和濃度為0.5umol/ml的磷標準品應(yīng)用液各200ul分別加入4、5、6號管中，然后分別加入2000ul定磷劑混勻，于37℃水浴30min后，涼至常溫，預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長660nm處，測定各管光密度，分別記為對照OD值，測定OD值，標準OD值，然后代入如下公式計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性：

將計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受污染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度的大小或綜合污染的大小，更能知道水體對生物體危害程度。

實施例6

利用實驗建立20日齡的淡水青鳉的Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度關(guān)系的標準曲線和Ca²⁺-ATP酶活性與多環(huán)芳烴菲濃度關(guān)系的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要取得樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。

取得待測水域中20日齡的淡水青鳉做樣本，然后測定待測水域中的該魚的Ca²⁺-ATP酶活性具體步驟如下：

步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當(dāng)?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質(zhì)量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min分層，取上層清液為待測樣本；

步驟二、待測樣本蛋白濃度的測定：分別將雙蒸水、濃度為0.563g/L的蛋白標準品和待測樣本各0.05ml加入1、2、3號管中，并分別向各管加入考馬斯亮藍顯色劑3ml，分別混勻，靜置10min，預(yù)熱到35℃，預(yù)熱待用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長595nm處，測定1、2、3號管中溶液的光密度，分別記為1號OD值，2號OD值，3號OD值，然后代入如下公式計算得待測樣本蛋白濃度：

步驟三、酶促反應(yīng)：使用南京生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒將對照管和待測樣本酶促反應(yīng)后，分別離心分層取得4號上清液(對照管)和5號上清液(待測樣本管)，其中酶促反應(yīng)具體操作如表1：

表1酶促反應(yīng)的具體操作

步驟四、定磷：將4號上清液、5號上清液和濃度為0.5umol/ml的磷標準品應(yīng)用液各200ul分別加入4、5、6號管中，然后分別加入2000ul定磷劑混勻，于37℃水浴30min后，冷卻至常溫，預(yù)熱，用分光光度計并用雙蒸水調(diào)零后，于1cm光徑，波長660nm處，測定各管光密度，分別記為對照OD值，測定OD值，標準OD值，然后代入如下公式計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性為0.255μmolPi/mgprot/hour：

將計算得魚的Ca²⁺-ATP酶活性大小與Ca²⁺-ATP酶活性與重金屬鎘濃度關(guān)系的標準曲線以及Ca²⁺-ATP酶活性與多環(huán)芳烴菲濃度關(guān)系的標準曲線分別比對，得到待測水域的鎘污染濃度為90μg/L，多環(huán)芳烴菲濃度為0；這樣既可以知道水體已受到污染，而且從標準曲線中可以知道水體中鎘濃度或菲濃度的大小，更能知道水體對生物體危害程度。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列應(yīng)用范例，它完全適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地另行修改他用，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。