本發(fā)明涉及一種用于檢測抗腫瘤藥物的電化學(xué)傳感器，具體涉及一種基于裸玻碳電極檢測抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素的比率雙信號電化學(xué)傳感器，屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于人口老齡化日益嚴重、生態(tài)環(huán)境遭到破壞、不健康的生活方式等多方面因素的影響，導(dǎo)致腫瘤患者人數(shù)逐年增加。近年來，腫瘤化療取得了相當(dāng)大的突破，腫瘤患者的生存時間被大大延長，尤其是對白血病、惡性淋巴瘤等惡性腫瘤的治療有了較大的突破；然而對嚴重危害人類生命健康的、占惡性腫瘤90％以上的實體瘤治療仍未能達到滿意的效果。鹽酸阿霉素(DOX)是目前治療惡性腫瘤最廣泛應(yīng)用的蒽環(huán)霉素類抗生素之一，對機體可產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)，具有強烈的細胞毒性作用。DOX的作用機制主要是阿霉素分子嵌入癌細胞DNA而抑制遺傳物質(zhì)核酸的合成，對多種腫瘤細胞均有殺滅作用，如乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、惡性淋巴癌和急性白血病等；但缺點是它在治療中伴有嚴重的心臟毒性、抑制骨髓造血功能和毒副作用等。因此，DOX在化療方面的應(yīng)用受到了一定程度的限制。測定體液中DOX，尤其是血液樣品中DOX的濃度對于用藥安全的評估具有重要意義。

目前檢測DOX常用的方法有熒光光譜法、超高效液相色譜法、液液萃取-高效液相色譜法和芯片毛細管電泳熒光檢測法等，其中發(fā)明專利“基于磁性納米吸附劑測定體液中DOX的方法”(專利號201310445367.X)采用化學(xué)共沉淀法，并通過層層組裝制備得到磁性納米吸附劑TSAB-coated Fe₃O₄/SiO₂，以此來檢測血漿和尿液樣品中DOX的含量，該方法制備的磁性吸附劑穩(wěn)定性好，吸附量大，可重復(fù)使用；但操作復(fù)雜，成本較高。因此，如何開發(fā)出針對DOX的簡單、高效、快速的檢測手段，是本領(lǐng)域亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種基于裸玻碳電極檢測抗腫瘤藥物DOX的比率雙信號電化學(xué)傳感器。利用DOX與亞甲基藍(MB)電化學(xué)活性高的特性，將二者直接加入電解液中，而無需對電極進行任何修飾；DOX與玻碳電極之間發(fā)生氧化還原，出現(xiàn)顯著的電信號；而MB作為參比出現(xiàn)穩(wěn)定的信號；在控制MB濃度不變的情況下，隨著DOX加入量的增大，DOX引起的電信號逐漸增強；通過電化學(xué)工作站對DOX和MB的電信號進行檢測，實現(xiàn)了對DOX的比率雙重電信號快速和高靈敏檢測。

本發(fā)明的目的之二在于提供上述電化學(xué)傳感器的制備/構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

此外，本發(fā)明的目的還在于提供一種DOX的檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，具體的本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

首先，本發(fā)明提供一種用于檢測DOX的電化學(xué)傳感器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將一定量的MB溶液與不同量的DOX溶液加入到緩沖液中，混合均勻，配制成一系列濃度梯度的DOX與定量MB的混合溶液；

(2)將玻碳電極打磨拋光，浸入步驟(3)得到的混合溶液中；

(3)將步驟(2)處理過的玻碳電極作為工作電極，與參比電極、對比電極連接到電化學(xué)工作站，共同構(gòu)成能檢測抗腫瘤藥物DOX電化學(xué)傳感器。

具體優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中MB溶液的濃度為0.1～1mM，DOX母液的濃度為2～200μM，配制成的混合溶液中DOX的一系列濃度梯度為0.01～4μM。

優(yōu)選的，步驟(1)中混合溶液的配制方法為：配制濃度為0.01-0.05M，pH6.0-7.0的PBS緩沖溶液；在避光條件下取一定量MB溶液逐滴滴入PBS緩沖溶液中；之后在避光條件下取不同量的DOX母液逐滴滴入上述溶液中，超聲分散，配制成一系列濃度梯度的DOX與定量MB的混合溶液。

更優(yōu)選的，PBS緩沖溶液濃度為0.01M，pH 6.5。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中，玻碳電極打磨拋光處理，具體為：將玻碳電極先后用0.03～0.5μm的Al₂O₃粉末打磨成鏡面，然后用去離子水清洗，再依次置于去離子水和乙醇中超聲1～10min；將處理好的玻碳電極浸入鐵氰化鉀溶液中進行循環(huán)伏安法掃描，使得氧化還原峰電位差為0～80mV，掃描電壓為-0.3～0.6V，掃速為0～0.05V s^-1；掃描完成后再次進行上述打磨拋光步驟，超聲清洗后用氮氣吹干。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)中，所述參比電極為甘汞或Pt或玻碳電極，所述對比電極為甘汞或Pt或玻碳電極。

其次，本發(fā)明提供上述構(gòu)建方法獲得的用于檢測DOX的電化學(xué)傳感器。

此外，本發(fā)明提供上述電化學(xué)傳感器在定性或定量檢測DOX中的應(yīng)用。

進一步的，本發(fā)明提供一種檢測DOX的方法，步驟為：

(1)將打磨拋光處理過的玻碳電極作為工作電極，與甘汞參比電極、Pt對比電極連接到電化學(xué)工作站；

(2)將玻碳電極浸入含有相同濃度MB、不同濃度DOX的PBS混合溶液中，測其方波伏安(SWV)響應(yīng)，掃描電壓為-0.9～0V，電位增量為0.002V，振幅為0.025V，頻率為25Hz，并根據(jù)不同DOX濃度的DOX與MB的電化學(xué)信號比ΔI_DOX/ΔI_MB繪制工作曲線；

(3)將一定量的MB溶液與待測溶液加入到PBS緩沖液中，混合均勻配制成混合溶液，MB溶液與PBS溶液同步驟(2)；

(4)用玻碳電極測定步驟(3)混合溶液中DOX和MB的SWV信號，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定DOX的含量。

優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(1)中，玻碳電極打磨拋光處理，具體為：將玻碳電極先后用0.03～0.5μm的Al₂O₃粉末打磨成鏡面，然后用去離子水清洗，再依次置于去離子水和乙醇中超聲1～10min；將處理好的玻碳電極浸入鐵氰化鉀溶液中進行循環(huán)伏安法掃描，使得氧化還原峰電位差為0～80mV，掃描電壓為-0.3～0.6V，掃速為0～0.05Vs^-1；掃描完成后再次進行上述打磨拋光步驟，超聲清洗后用氮氣吹干。

具體優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(2)中混合溶液的配制方法為：配制濃度為0.01-0.05M，pH 6.0-7.0的PBS緩沖溶液；在避光條件下取一定量MB溶液逐滴滴入PBS緩沖溶液中；之后在避光條件下取不同量的DOX母液逐滴滴入上述溶液中，超聲分散，配制成一系列濃度梯度的DOX與定量MB的混合溶液。

更優(yōu)選的，步驟(2)中所述MB溶液的濃度為0.1～1mM，DOX母液的濃度為2～200μM，配制成的混合溶液中DOX的一系列濃度梯度為0.01～4μM。

本發(fā)明所述檢測鹽酸阿霉素/DOX的方法可用于檢測人血漿、血清或尿液中的DOX含量，也可以用于常規(guī)試驗試劑或溶液、反應(yīng)液中DOX的定量。

本發(fā)明取得了以下有益效果：

(1)本發(fā)明的比率雙信號電化學(xué)傳感器制備方法簡單，容易操控，反應(yīng)條件溫和；本發(fā)明的電化學(xué)檢測法具有操作簡單、成本低廉、靈敏度高和響應(yīng)速度快等諸多優(yōu)點，尤其是，比率雙信號的使用可有效避免單信號強度波動而引起測量的誤差，這對于檢測DOX是一個理想的選擇；

(2)截至目前，尚未有比率雙信號電化學(xué)DOX傳感器，也尚未有基于裸電極(如玻碳電極)上構(gòu)建比率雙信號電化學(xué)傳感器的國內(nèi)外相關(guān)文獻和專利的報道；本發(fā)明首次將DOX與MB結(jié)合制備出比率雙信號電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)對DOX快速、高效的檢測；

(3)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器利用裸玻碳電極直接對DOX進行檢測，無需對電極進行任何修飾，對DOX的檢測限度可低至4nM，靈敏度高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的比率雙信號電化學(xué)傳感器檢測DOX的原理圖

圖2為不同濃度梯度DOX與固定濃度MB的SWV

圖3為DOX與MB電化學(xué)信號比ΔI_DOX/ΔI_MB與DOX濃度的線形關(guān)系圖

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。

實驗中所使用的儀器及試劑為：(1)儀器：CHI650電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；采用飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為對電極；(2)試劑：DOX(生工生物工程(上海)有限公司)，分析純；MB(阿拉丁試劑(上海)有限公司)，分析純。

其他試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

實施例1：

(1)配制濃度為0.01M，pH 6.5的PBS緩沖溶液。在避光條件下取50μL、1mM MB溶液逐滴滴入PBS緩沖溶液中。同樣避光條件下取不同量的200μM DOX逐滴滴入上述MB的PBS溶液中，超聲混勻分散，分別配成濃度梯度為0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM和4μM。

(2)將玻碳電極先后用0.5μm和0.03μm的Al₂O₃粉末打磨成鏡面，然后用去離子水清洗，再依次放置于去離子水和乙醇中超聲1～2min；將處理好的玻碳電極浸入鐵氰化鉀溶液中進行循環(huán)伏安法掃描，使得氧化還原峰電位差小于80mV；掃描完成后再次進行上述打磨拋光步驟，超聲清洗后用氮氣吹干。將電極浸入上述混合溶液中測DOX和MB的SWV信號。

實施例2：實際樣品的測定

(1)將人血清用0.01M，pH 6.5的PBS緩沖溶液稀釋十倍。在避光條件下取50μL、1mM MB溶液逐滴滴入人血清溶液中。同樣避光條件下取一定量的DOX滴入上述MB的人血清溶液中，超聲混勻。

(2)用玻碳電極測定人血清溶液中DOX和MB的SWV信號的步驟同實施例1的步驟(2)，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定DOX的含量。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例3

(1)配制濃度為0.03M，pH 7.0的PBS緩沖溶液。在避光條件下取50μL、0.1mM MB溶液逐滴滴入PBS緩沖溶液中。同樣避光條件下取不同量的100μM DOX逐滴滴入上述MB的PBS溶液中，超聲混勻分散，分別配成濃度梯度為0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM和4μM。

(2)將玻碳電極先后用0.5μm和0.03μm的Al₂O₃粉末打磨成鏡面，然后用去離子水清洗，再依次放置于去離子水和乙醇中超聲2min；將處理好的玻碳電極浸入鐵氰化鉀溶液中進行循環(huán)伏安法掃描，使得氧化還原峰電位差小于80mV；掃描完成后再次進行上述打磨拋光步驟，超聲清洗后用氮氣吹干。將電極浸入上述混合溶液中測DOX和MB的SWV信號。