風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒。所述試劑盒包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述檢測試紙是由底板（1）和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊（6）、抗原墊（5）、標記物結(jié)合墊（4）、包被膜（3）和吸收墊（2）組成，根據(jù)WHO推薦的風疹抗體最低保護滴度水平，將試劑盒的最低檢測線設(shè)定為10IU/ml，用于檢測血清/血漿/全血中的抗風疹病毒IgG抗體。本實用新型所述的試劑盒成本低廉，制備工藝簡單，檢測血清抗體的結(jié)果與ELISA試劑盒的結(jié)果無顯著差異適，可用于風疹疫苗接種后免疫效果的快速評價。
【專利說明】風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]風疹是由風疹病毒引起的一種常見的急性傳染病，以低熱、全身皮疹為特征，常伴有耳后、枕部淋巴結(jié)腫大。若孕婦妊娠早期感染風疹病毒，可導致先天性風疹綜合癥((--，90%會出現(xiàn)多種胎兒畸形，且常常導致流產(chǎn)和死產(chǎn)，之后風險下降。16孕周后的感染很少會造成胎兒畸形，盡管到20孕周內(nèi)感染仍可導致胎兒感覺神經(jīng)性聽力障礙。風疹呈全球性分布，具有季節(jié)性(如溫帶地區(qū)冬春季高發(fā))，^5-9年流行一次。風疹病毒是一種包膜病毒，屬風疹病毒科，為單鏈I？嫩病毒，僅有一種血清型，與其它包膜病毒無交叉反應(yīng)。人類是已知的唯一宿主。風疹病毒通過呼吸道傳播，在鼻咽粘膜及局部淋巴結(jié)復制，潛伏期為12-23天，平均18天。在接觸病毒后5-7天會出現(xiàn)病毒血癥，病毒播散到不同器官。病毒還可經(jīng)胎盤感染胎兒。
[0003]預防風疹流行的有效措施主要是接種風疹疫苗。我國的擴大國家免疫規(guī)劃已將風疹疫苗列入常規(guī)免疫程序，目前已上市的風疹疫苗有單價、與麻疹或腮腺炎疫苗聯(lián)合的二價或三價的麻疹-腮腺炎-風疹聯(lián)合疫苗(麗幻，每年大約有數(shù)千萬兒童接受免疫接種。這提示我們，有必要對風疹疫苗的群體免疫效果進行評價。評價疫苗免疫效果最可靠的方法就是檢測接種者體內(nèi)血清中的特異抗體的含量。當前市場上檢測風疹抗體的商品化試劑盒多采用酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法，這些方法雖然靈敏度高、結(jié)果準確、化學發(fā)光試劑還可以對抗體進行定量，但在實際操作上存在諸多不便，如步驟復雜、耗時較長，還需使用特定的儀器設(shè)備；試劑盒需41保存；對樣品要求靜脈采血等，不易在基層普及運用。
[0004]免疫膠體金快速診斷技術(shù)是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)和免疫膠體金標記技術(shù)基礎(chǔ)上，以膠體金為標記物，利用特異的抗原抗體反應(yīng)放大反應(yīng)信號，通過直接觀察就可以判定結(jié)果的新技術(shù)。該技術(shù)具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學檢測、動物醫(yī)學檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測等諸多診斷領(lǐng)域迅速發(fā)展。目前，膠體金標記的快速檢測抗體的檢測試紙都是由樣品墊、標記物結(jié)合墊、包被膜(其上劃有檢測線、質(zhì)控線)和吸收墊組成，根據(jù)檢測原理的不同大體分為兩種:一種是將抗原標金，在標記物結(jié)合墊上包被膠體金標記的抗原，在包被膜上用待測抗體的抗體劃膜得到檢測I線；另一種是將抗原劃膜，在標記物結(jié)合墊上包被膠體金標記的待測抗體的抗體，在包被膜上用抗原劃膜得到檢測I線?，F(xiàn)有研究表明:因為抗體蛋白性質(zhì)較為穩(wěn)定，所以對抗體蛋白的膠體金標記較為穩(wěn)定，因此上述第一種方法所述的抗原的膠體金標記存在頗多問題，因為抗原多為病毒類，性質(zhì)多樣，有的大小甚至比膠體金顆粒還大，且穩(wěn)定性較差，因此很難直接將抗原標記在膠體金顆粒上；即使勉強能將抗原標記上，也需要抗原達到極高的純度，而對抗原病毒的純化是一項難度較大、成本較高的工程；也有人尋找抗原的重組抗原來代替這些天然抗原，但是很多抗原很難尋到能替代的重組抗原，而且即使有，成本也是極高的，由此說明，上述第一種方法的局限性比較高。上述的第二種方法使用待測抗體的抗體進行金標記，可以避免抗原金標記的問題，但在包被膜上使用抗原劃膜得到檢測I線，需要抗原具有較高的濃度和純度，這也增加了產(chǎn)品生產(chǎn)的成本和難度；另外由于抗原穩(wěn)定性較差，抗原劃膜后很難長時間保存，因此試紙條的有效期極短。這些都是限制抗體快速檢測類試劑盒快速發(fā)展的原因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本實用新型針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒，用該試劑盒對接種者體內(nèi)血清中的風疹病毒抗體進行膠體金法快速檢測，可以實現(xiàn)對風疹疫苗接種效果的快速評價。
[0006]本實用新型所采用的技術(shù)方案為:
[0007]風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒，包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙位于盒體內(nèi)，其特征在于，所述檢測試紙是由底板和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊、抗原墊、標記物結(jié)合墊、包被膜和吸收墊組成，所述抗原墊上包被有風疫抗原，所述標記物結(jié)合墊上包被有膠體金標記的鼠抗風疫單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測I線和質(zhì)控線，所述檢測I線上包被有鼠抗人I姊抗體，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠I姊抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為川幾/“。
[0008]按上述方案，所述樣品稀釋液為含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉和疊氮鈉的混合水溶液。
[0009]按上述方案，所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
[0010]按上述方案，所述底板為底板，所述底板的一面為雙面膠。
[0011]按上述方案，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
[0012]按上述方案，所述標記物結(jié)合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
[0013]按上述方案，所述抗原墊的制備方法為:使用抗原保護液將風疹抗原進行稀釋后均勻鋪在玻璃纖維、無紡布或聚酯膜上，置于371，相對濕度低于40%的環(huán)境中，干燥4小時，制成抗原墊；所述抗原保護液的配方為728，版收？0及6248，檸檬酸三鈉8.58，蔗糖108，疊氮鈉18，水定容至1 ；所述風疹抗原為粗抗原，其中抗原的含量為
40被％?50被％。
[0014]本實用新型中，所述試劑盒中檢測試紙的檢測原理為:在樣品墊加入血清或血漿或全血樣品，再加入2?3滴樣品稀釋液，若樣品中含有風疹病毒I姊抗體，其將和抗原墊中的風疹抗原形成風疹抗原-風疹病毒I姊抗體復合物，該復合物向前移動，復合物中的風疹抗原再與標記物結(jié)合墊中的膠體金標記的鼠抗風疹單克隆抗體結(jié)合，形成風疹病毒I姊抗體-風疹抗原-膠體金標記的鼠抗風疹單克隆抗體免疫復合物，該復合物由于層析作用沿紙條向前移動，至檢測I線，復合物中的風疹病毒I姊抗體與檢測I線上包被的鼠抗人1^6抗體反應(yīng)形成鼠抗人I姊抗體-風疹病毒I姊抗體-風疹抗原-膠體金標記的鼠抗風疹單克隆抗體免疫復合物，該復合物可聚集在檢測區(qū)，當聚集的復合物達到一定的數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的條帶(1線)，判斷結(jié)果為陽性；若樣品中不含有或含很少量的風疹病毒I姊抗體，則不能形成免疫復合物，即不能形成肉眼可見的條帶，判斷結(jié)果為陰性；線作為試劑的質(zhì)控標準，陽性和陰性檢測樣品均會產(chǎn)生條帶。
[0015]同時，依據(jù)世界衛(wèi)生組織(1?))推薦的血清中風疹病毒的最低保護抗體滴度水平為101 口加1，即當接種者體內(nèi)風疹病毒抗體的濃度? 101 口加1，說明風疹疫苗接種成功，當接種者體內(nèi)風疹病毒抗體的濃度? 101 口加1，說明風疹疫苗接種不成功。本實用新型中，將試劑盒的靈敏度設(shè)置為101 口加1，風疹病毒I姊抗體的檢測結(jié)果為陽性即表明風疹疫苗免疫成功，風疹病毒I姊抗體的檢測結(jié)果為陰性即表明風疹疫苗免疫不成功。因此，本實用新型所述的試劑盒可以實現(xiàn)快速評價風疹疫苗的接種效果。
[0016]本實用新型試劑盒的使用方法:將檢測試紙平放，在樣品墊加入59 1血樣，再加入2?3滴樣品稀釋液，用肉眼直接觀察在20分鐘內(nèi)檢測I線和質(zhì)控線的顯色情況:質(zhì)控線不顯色，說明本試驗失??；質(zhì)控線顯色，檢測I線不顯色說明風疹疫苗接種不成功；質(zhì)控線和檢測I線均顯色說明風疹疫苗接種成功。
[0017]本實用新型的有益效果:
[0018](1)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型所述的檢測試紙增加了抗原墊的結(jié)構(gòu)，通過在抗原墊上加入抗原保護液并包被風疹病毒抗原，在標記物結(jié)合墊上包被鼠抗風疹單克隆抗體，解決了風疹病毒抗原由于穩(wěn)定性差而不容易被金標記的問題；另一方面，本實用新型采用鼠抗人I姊抗體劃膜得到檢測I線，因為抗體相比較為穩(wěn)定，因此試紙條的有效期較長。
[0019](2)本實用新型所述風疹病毒抗原為粗抗原，不需對粗抗原進一步純化就能達到反應(yīng)效果，這是因為在試紙條反應(yīng)層析過程中，已經(jīng)通過雙抗體夾心法對粗抗原進行了篩選和純化，保證了試劑反應(yīng)的特異性，因此檢測試紙的制備成本低，利于推廣；實驗結(jié)果表明，利用本實用新型所述的檢測試紙檢測抗體，檢測的結(jié)果與此檢測結(jié)果一致。
[0020](3)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實用新型所述的試劑盒具有快速、簡便、靈敏、特異的特點，擺脫了試劑對設(shè)備、儀器、人員及儲存盒運輸環(huán)境的特殊要求，將試劑盒的靈敏度設(shè)置為10幾加1，可以實現(xiàn)對風疹疫苗接種效果的快速評估。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本實用新型的試劑盒整體結(jié)構(gòu)示意圖，其中八-盒體，8-裝有樣品稀釋液的容器，0檢測試紙，0-說明書。
[0022]圖2為本實用新型的試劑盒中檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1-底板，2-吸收墊，3-包被膜，4-標記物結(jié)合墊，5-抗原墊，6-樣品墊，7-質(zhì)控線，8-檢測丁線。

【具體實施方式】
[0023]為了更好地理解本實用新型，下面結(jié)合實施例進一步闡明本實用新型的內(nèi)容，但本實用新型的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實例。
[0024]如圖1所示，風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒，包括盒體八、裝有樣品稀釋液的容器8和檢測試紙0，所述裝有樣品稀釋液的容器8和檢測試紙位于盒體八內(nèi)，所述檢測試紙是由底板1和相互搭接粘貼在底板上的樣品墊6、抗原墊5、標記物結(jié)合墊4、包被膜3和吸收墊2組成，所述抗原墊上包被有風疫抗原，所述標記物結(jié)合墊上包被有膠體金標記的鼠抗風疹單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測I線8和質(zhì)控線7，所述檢測I線上包被有鼠抗人I姊抗體，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠I姊抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為101口鼠
[0025]盒體六內(nèi)放置有說明書0。
[0026]所述樣品稀釋液為含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉和疊氮鈉的混合水溶液。以下實施例中，樣本稀釋液的組分為磷酸氫二鈉5.728，磷酸二氫鈉0.62?，氯化鈉88，疊氮鈉0.58，超純水定容至11。
[0027]所述底板為底板，所述底板的一面為雙面膠。
[0028]所述包被膜為硝酸纖維素膜；所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
[0029]所述標記物結(jié)合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
[0030]所述抗原墊通過使用抗原保護液將風疹抗原進行稀釋后均勻鋪在玻璃纖維、無紡布或聚酯膜上獲得，所述抗原為粗抗原，其中抗原的含量為40被％?50被％。
[0031〕 實施例1風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒
[0032]主要材料
[0033]抗原:風疹病毒抗原，購自!公司，培養(yǎng)的天然病毒，為粗純，但已滅活，不具有生物危害。用于制備抗原墊。
[0034]鼠抗人I姊抗體，購自廈門波生生物技術(shù)有限公司，用于硝酸纖維素膜I線的包被。
[0035]鼠抗風疹單克隆抗體，購自武漢賽欣生物技術(shù)有限公司，用于標記膠體金。
[0036]羊抗鼠I姊抗體，購自杭州隆基生物技術(shù)有限公司，用于硝酸纖維素膜質(zhì)控線的包被。
[0037]氯金酸:81卿￡1公司產(chǎn)品。
[0038]硝酸纖維素膜公司產(chǎn)品。
[0039]牛血清白蛋白(834)、酪蛋白:81職121公司產(chǎn)品。
[0040]其余化學試劑均為分析純試劑。
[0041]臨床血清由公司在武漢市血液中心獲得，其中風疹病毒I姊抗體陽性192份，I姊抗體陰性樣本108份。
[0042]風疹病毒I姊抗體檢測試劑盒(￡113八法):購自北京貝爾生物工程有限公司。國內(nèi)已注冊的商用產(chǎn)品。
[0043]2、標記物結(jié)合墊的制備
[0044]氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40鹽的膠體金溶液，制備完成后，取10001膠體金溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，調(diào)節(jié)邱至8.0，然后按每10001膠體金溶液0.5呢抗體加入鼠抗風疹病毒單克隆抗體0.51118，繼續(xù)攪拌30111111，再加入終濃度為1%的8“進行封閉，繼續(xù)攪拌30111111。標記結(jié)束后，以1000017111111對標記液進行離心，棄上清，然后將沉淀用復溶溶液進行復溶至原體積。所述復溶溶液的配方為965^,0886111-^2.58，檸檬酸三鈉2.58，吐溫-200.5001，蔗糖10.08，疊氮鈉1.08，用超純水定容至1匕將復溶好的金標記溶液按每“溶液鋪…挪2的比例均勻鋪在玻璃纖維上，置于371，相對濕度低于20%的環(huán)境中，干燥12?18小時，制成標記物結(jié)合墊。
[0045]3、抗原墊的制備
[0046]將獲得的風疹病毒抗原使用抗原保護液稀釋到8倍得到抗原液，將稀釋好的抗原液按每“溶液鋪18(31112的比例均勻鋪在玻璃纖維上，置于371，相對濕度低于40%的環(huán)境中，干燥4小時，制成抗原墊。所述抗原保護液的配方為728，版^2？0及62知，檸檬酸三鈉8.5〖，鹿糖108，疊氮鈉18，純化水定容至1匕
[0047]4、包被膜的制備
[0048]使用0.021，邱為7.2的磷酸鹽緩沖液將鼠抗人I姊抗體(1線溶液)稀釋成1.5呢加1，羊抗鼠1^((:線溶液)稀釋至1.0呢加1。然后使用劃膜儀將I線與0線溶液按1.5111/0111的出液量均勻地包被于從:膜上，^0膜已事先黏貼于塑料底板上，包被完成后，將%膜置于371，相對濕度低于40%的環(huán)境中，干燥3?4小時，制成包被膜。
[0049]5、風疹病毒I姊抗體檢測試紙的組裝
[0050]在干燥環(huán)境下(溫度20?251，相對濕度低于30% )，將包被膜置于潔凈環(huán)境中，在％膜的了線端，標記物結(jié)合墊(結(jié)合墊已事先切裁成6111111寬)緊密壓接％膜2111111，抗原墊(抗原墊已事先切裁成川臟寬)緊密壓接標記物結(jié)合墊另一側(cè)樣品墊緊密壓接抗原墊另一側(cè)4?5皿，最后用切條機將貼好的底板切成4皿寬的試紙條。
[0051]6、風疹病毒1姊抗體檢測試紙的使用方法
[0052]將待檢血清或血漿或全血(待檢樣品)平衡至室溫，上述制備好的檢測試紙平放于試驗臺上，在樣品塾處加入5111待檢樣品，若樣品中含有風疫病毒抗體，樣品加入后，風疹I(lǐng)姊抗體先與抗原墊中風疹抗原形成抗原-風疹病毒I姊抗體復合物，復合物向前移動，與標記物結(jié)合墊中的金標記的鼠抗風疹單克隆抗體形成風疹I(lǐng)姊抗體-風疹抗原-金標記的鼠抗風疹單克隆抗體免疫復合物，該復合物由于層析作用沿紙條向前移動，至檢測丁線與鼠抗人I姊抗體反應(yīng)形成鼠抗人I姊抗體-人風疹I(lǐng)姊抗體-風疹抗原-金標記的鼠抗風疹單克隆抗體免疫復合物，該復合物可聚集在檢測區(qū)，當聚集的復合物達到一定的數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的條帶(1線)，判斷結(jié)果為陽性；若樣品中不含有或含很少量的風疹病毒I姊抗體，則不能形成免疫復合物，則不能形成肉眼可見的條帶，判斷結(jié)果為陰性。線作為試劑的質(zhì)控標準，陽性和陰性檢測樣品均會產(chǎn)生條帶。用肉眼直接觀察試紙條在20分鐘內(nèi)的出線情況，并判定檢測結(jié)果。
[0053]7、根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定的風疹病毒I姊抗體的最低保護滴度為川幾/“，當風疹病毒I姊抗體濃度? 101^1說明人體對風疹病毒具有抵抗性，當風疹病毒I姊抗體濃度? 10幾加1說明人體對風疹病毒還沒有產(chǎn)生抵抗性，因此本試紙條將檢測風疹病毒I姊抗體的檢測臨界值設(shè)置為10幾加1，I線顯線表明風疹病毒I姊抗體的濃度彡10幾加1，風疹疫苗接種成功'線不顯線表明風疹病毒I姊抗體的濃度? 101^/1111，風疹疫苗沒有接種成功。
[0054]8、臨床樣品檢測結(jié)果對照
[0055]對公司收集的臨床血清樣本使用本申請所述檢測試紙及商用檢測￡[13八試劑盒同時進行檢測，再對檢測結(jié)果進行對照。
[0056]以試劑盒為對照，對風疹病毒I姊抗體進行檢測，檢測出192份風疹I(lǐng)姊陽性樣本，108份風疹1姊陰性樣本，而本申請試紙條檢測出191份風疹1姊陽性樣本，109份風疹I(lǐng)姊陰性樣本，總體符合率為99.33%。臨床檢測結(jié)果表明，本申請檢測試紙的的性能和￡[13八試劑盒相比無顯著差異，說明本實用新型所述的試劑盒適合用于臨床檢驗，具有實用價值。
[0057]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本實用新型創(chuàng)造的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.風疹疫苗接種效果快速評價試劑盒，包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙位于盒體內(nèi)，其特征在于，所述檢測試紙是由底板和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊、抗原墊、標記物結(jié)合墊、包被膜和吸收墊組成，所述抗原墊上包被有風疫抗原，所述標記物結(jié)合墊上包被有膠體金標記的鼠抗風疫單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測T線和質(zhì)控C線，所述檢測T線上包被有鼠抗人IgG抗體，所述質(zhì)控C線上包被有羊抗鼠IgG抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為10IU/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底板為PVC底板，所述PVC底板的一面為雙面膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標記物結(jié)合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
【文檔編號】G01N33/577GK204203235SQ201420636037
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】張薇, 吳邊, 王方杰, 金玉翠, 龔華岳, 倪龍泉 申請人:武漢生命科技股份有限公司