表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法，包括下列步驟：（1）鼠抗抗體的偶聯(lián)：鼠抗抗體與表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片偶聯(lián)；（2）禽法氏囊單克隆抗體的捕獲及捕獲濃度的確定；（3）樣品的檢測(cè)：將待測(cè)樣品流過表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片的流池，測(cè)定混合物流過芯片之前和之后相應(yīng)流池的信號(hào)差值，根據(jù)上述信號(hào)差值確定所述病毒是否存在及其含量。本發(fā)明的檢測(cè)方法在檢測(cè)其他禽源病毒時(shí)無陽性響應(yīng)信號(hào)，特異性強(qiáng)；對(duì)禽法氏囊病毒重組蛋白的檢測(cè)極限達(dá)0.625nmol/L，靈敏度高。
【專利說明】表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法，屬于生物 技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性法氏囊病是由傳染性法氏羹病毒（Infectious Bursal Disease Virus， IBDV)引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞 嚴(yán)重受損為特征，從而引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。目前本病作為危 害養(yǎng)禽業(yè)的三大主要疫病之一，呈世界性分布，該病引起雛雞的免疫抑制，使病雞對(duì)大腸桿 菌、腺病毒、沙門氏菌、雞球蟲等病原更易感，對(duì)馬立克疫苗、禽法氏囊病毒疫苗等接種的反 應(yīng)能力下降，發(fā)病率高，幾乎達(dá)100%，死亡率一般為5%?15%，但現(xiàn)在流行的通過變異產(chǎn) 生的的超強(qiáng)毒株死亡率達(dá)到60 % -100 %，是當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。
[0003] 目前用于監(jiān)控IBDV的常用方法免疫學(xué)方法如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)、免疫 組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法，存在耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、靈敏度和特異性差的缺點(diǎn)，且均不 能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物大分子之間的相互作用，動(dòng)態(tài)觀察大分子之間結(jié)合與解離的平衡關(guān)系，較 為準(zhǔn)確地測(cè)定分子間相互作用的親和力。目前已成為篩選各類抗體建立免疫學(xué)反應(yīng)的瓶頸 和關(guān)鍵。同時(shí)傳統(tǒng)的免疫血清學(xué)診斷方法大多需要標(biāo)記各類抗體，無法在大規(guī)模推廣應(yīng)用 前實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體或參考抗原的篩選工作，因而需要研究一種相對(duì)廉價(jià)，并能夠?qū)Ψㄊ夏也《?的血清學(xué)診斷方法在建立推廣之前進(jìn)行高通量快速篩選、準(zhǔn)確鑒別的集成化診斷技術(shù)。
[0004] 表面等離子體共振技術(shù)（SPR)是利用在金屬膜/液面界面，由光的全反射引起的 物理光學(xué)現(xiàn)象來分析分子間相互作用的技術(shù)。SPR儀由自動(dòng)采樣機(jī)械手、高分辨率的CCD照 相儀和上面布有一個(gè)或多個(gè)流池的鍍金或鍍銀SPR生物傳感器芯片構(gòu)成。SPR技術(shù)在檢測(cè)、 分析生物分子間的相互作用等方面得到廣泛的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種利用表面等離子體共振技術(shù)來檢測(cè)禽法 氏囊病毒的方法，同時(shí)，所述的方法也可快速篩選一株適配的新城疫單克隆抗體。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏 囊病毒的非診斷性方法，包括下列步驟：
[0007] (1)鼠抗抗體的偶聯(lián)：鼠抗抗體與表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片偶聯(lián)；
[0008] (2)禽法氏囊單克隆抗體的捕獲及捕獲濃度的確定；
[0009] (3)樣品的檢測(cè)：將待測(cè)樣品流過表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片的流 池，測(cè)定混合物流過芯片之前和之后相應(yīng)流池的信號(hào)差值，根據(jù)上述信號(hào)差值確定所述病 毒是否存在及其含量。
[0010] 具體的，上述步驟具體為：
[0011] 鼠抗抗體與表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片偶聯(lián)的具體步驟為：在室溫 20-25攝氏度條件下，將試劑放在樣品架上，設(shè)定加樣流速為10 μ L/min，以inject方式進(jìn) 樣，順次用110 μ LNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入過量的鼠抗抗體偶聯(lián)在活化后的 芯片表面上，偶聯(lián)完畢后用6〇uL Ethanolamine HC1封閉，使過量的反應(yīng)基團(tuán)失活；分析偶 聯(lián)效果時(shí)，通過在開始注射鼠抗抗體前放置一個(gè)基線報(bào)道點(diǎn)，并在注射Ethanolamine HC1 結(jié)束后放置第二個(gè)報(bào)道點(diǎn)，如信號(hào)差在1000-5000RU，則結(jié)合鼠抗的水平良好。通常芯片偶 聯(lián)抗體后可進(jìn)行1〇〇次左右的結(jié)合及再生實(shí)驗(yàn)。
[0012] 法氏囊單克隆抗體與步驟（1)中的鼠抗抗體結(jié)合的具體步驟為：準(zhǔn)備 0. 1-0. 5 μ g/ml的含法氏囊單克隆抗體的腹水樣品和0. 5 μ Μ的法氏囊重組蛋白抗原，經(jīng) 0.22um的微孔過濾備用。在配體通道上嘗試進(jìn)樣10μ?單抗腹水樣品。然后同時(shí)在空白 參比通道和配體通道上進(jìn)樣3min抗原，解離5min，設(shè)定流速為10 μ L/min。為最大限度降 低背景值，應(yīng)控制捕獲單抗后抗原檢測(cè)的RU信號(hào)差值處在30?50RU的合理區(qū)間，以此確 定為合適的單抗捕獲濃度，后續(xù)的樣品檢測(cè)均以此捕獲濃度的單抗進(jìn)樣。最后用pH3. 0的 緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生。
[0013] 檢測(cè)樣品的具體步驟為：待檢抗原經(jīng)0.22 μ m的微孔過濾備用。設(shè)定流速為 10 μ L/min，在相應(yīng)的的配體通道上進(jìn)樣10 μ L確定好濃度的法氏囊單抗。分別注射25 μ L 的HBS緩沖液（作為陰性對(duì)照）和待檢抗原，順次進(jìn)樣與單抗結(jié)合，并限定120s解離時(shí)間， 最后用PH3.0的緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生。通過在開始注射單抗后放置一個(gè)基 線報(bào)道點(diǎn)，并在注射待檢樣品后放置第二個(gè)報(bào)道點(diǎn)。陰性對(duì)照無任何差值，陽性樣品信號(hào)有 差值，以此確定有禽法氏囊病毒的存在。
[0014] 優(yōu)選的，生物傳感器芯片為CM5芯片。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：能夠很快捷地發(fā)現(xiàn)鼠抗抗體與單抗分子間能否發(fā)生結(jié)合。 通過直接捕獲雜交瘤上清、腹水抗體，在5?10分鐘內(nèi)即可快速篩選一株適配的單克隆抗 體，運(yùn)行成本更低，芯片亦可反復(fù)使用，這為大面積推廣所篩選的抗體在其他免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中 的應(yīng)用提供了重要的參考數(shù)據(jù)。
[0016] 本發(fā)明的檢測(cè)方法在檢測(cè)其他禽源病毒時(shí)無陽性響應(yīng)信號(hào)，特異性強(qiáng)；對(duì)禽法氏 囊病毒重組蛋白的檢測(cè)極限達(dá)〇.625nmol/L，靈敏度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是本發(fā)明的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法，包括下列步驟：
[0020] 1.鼠抗抗體的偶聯(lián)
[0021] (1)樣品無需預(yù)處理，利用HBS作為緩沖分析buffer,偶聯(lián)鼠抗抗體固定于CM5芯 片。設(shè)定偶聯(lián)引導(dǎo)模式：在Surface Preparation窗口中，同時(shí)選擇Immobilisation和芯 片Sensor Chip:CM5及Amine Coupling方法，同時(shí)設(shè)置不偶聯(lián)鼠抗的空白參比通道。
[0022] (2)將所有試劑平衡到室溫20-25°C，設(shè)定加樣流速為10 μ L/min。
[0023] (3)以inject方式進(jìn)樣，順次用110 μ LNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入過量 的鼠抗抗體偶聯(lián)在活化后的芯片表面上，偶聯(lián)完畢后用60UL Ethanolatnine HC1封閉，使 過量的反應(yīng)基團(tuán)失活；
[0024] (4)分析偶聯(lián)效果時(shí)，通過在開始注射鼠抗抗體前放置一個(gè)基線報(bào)道點(diǎn)，并在注射 Ethanolamine HC1結(jié)束后放置第二個(gè)報(bào)道點(diǎn)，如信號(hào)差在l〇〇〇_5〇〇〇RU之間，則結(jié)合鼠抗 的水平良好。通常芯片偶聯(lián)抗體后可進(jìn)行1〇〇次左右的結(jié)合及再生實(shí)驗(yàn)。
[0025] 2.單克隆抗體的捕獲及適當(dāng)捕獲濃度的確定
[0026] 因每次檢測(cè)均需要作預(yù)實(shí)驗(yàn)，故每次捕獲單克隆抗體均需要確定合適的捕獲濃 度。
[0027] (1)準(zhǔn)備0. 1?0. 5 μ g/ml的含法氏囊單克隆抗體的腹水樣品和〇· 5 μ Μ的法氏囊 重組蛋白抗原，用0.22 μ m的微孔過濾備用。
[0028] (2)在配體通道上嘗試進(jìn)樣10 μ L單抗腹水樣品。然后同時(shí)在空白參比通道和配 體通道上進(jìn)樣3min抗原，解離5min，設(shè)定流速為10 μ L/min，
[0029] (3)為最大限度降低背景值，應(yīng)控制捕獲單抗后抗原檢測(cè)的RU信號(hào)差值處在30? 50RU的合理區(qū)間，以此確定為合適的單抗捕獲濃度，后續(xù)的樣品檢測(cè)均以此捕獲濃度的單 抗進(jìn)樣。最后用PH3. 0的緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生。
[0030] 3.樣品的檢測(cè)
[0031] (1)待檢樣品經(jīng)0. 22 μ m的微孔過濾備用。
[0032] (2)在相應(yīng)的預(yù)要捕獲法氏囊單抗的配體通道上進(jìn)樣，設(shè)定流速為10 μ L/min，進(jìn) 樣10 μ L確定好濃度的法氏囊單抗。
[0033] (3)分別注射25yL的HBS緩沖液（作為陰性對(duì)照）和待檢抗原，順次進(jìn)樣與單抗 結(jié)合，并限定120s解離時(shí)間，最后用ρΗ3· 0的緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生。
[0034] (4)通過在開始注射單抗后放置一個(gè)基線報(bào)道點(diǎn)，并在注射待檢樣品后放置第二 個(gè)報(bào)道點(diǎn)。陰性對(duì)照無任何差值，陽性樣品信號(hào)有差值，以此確定有禽法氏囊病毒的存在。
[0035] 實(shí)施例2特異性試驗(yàn)
[0036] 在SPR芯片表面分析不同毒株的抗原，將傳染性支氣管炎病毒（IBV)、新城疫病毒 (NDV)、禽白血?。ˋLV)、鴨病毒性肝炎（DVH)、鴨病毒性腸炎（DEV)的病原材料，尿囊液及細(xì) 胞培養(yǎng)液均經(jīng)〇. 22um的微孔濾膜過濾上樣處理，除法氏囊病毒外均無特異的顯著的結(jié)合 反應(yīng)，在SPR分析圖譜中未出現(xiàn)與上述亞型一致的特征峰圖。SPR的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 1 (縱軸為儀器的RU響應(yīng)值）。
[0037] 實(shí)施例3靈敏性分析
[0038] 取三株法氏囊單抗，濃度依次倍比稀釋成250、I25、62· 5、31· 25、15. 625至 7. 8125nmol/mL并依次進(jìn)樣獲取該單抗的結(jié)合和解離常數(shù)KD值（如表1)，并由公式測(cè)得結(jié) 合速率與解離速率，便于篩選免疫反應(yīng)效果更好的單抗。由公式美*黑AB (A為 溶液中的待分析物由流動(dòng)系統(tǒng)控制，AB的濃度可由儀器直接檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)RU得到，B為偶 聯(lián)在傳感芯片上的分子，相當(dāng)于最大結(jié)合反應(yīng)理論值U由此推導(dǎo)得出
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 表面離子共振技術(shù)檢測(cè)禽法氏囊病毒的非診斷性方法，其特征在于，包括下列步 驟： (1) 鼠抗抗體的偶聯(lián)：鼠抗抗體與表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片偶聯(lián)； (2) 禽法氏囊單克隆抗體的捕獲及捕獲濃度的確定； (3) 樣品的檢測(cè)：將待測(cè)樣品流過表面離子共振系統(tǒng)中的生物傳感器芯片的流池，測(cè)定 混合物流過芯片之前和之后相應(yīng)流池的信號(hào)差值，根據(jù)上述信號(hào)差值確定所述病毒是否存 在及其含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括下列步驟： (1) 鼠抗抗體的偶聯(lián)： (a )樣品無需預(yù)處理，利用HBS作為緩沖液，設(shè)定偶聯(lián)引導(dǎo)模式：在Surf ace Preparation 窗口中，同時(shí)選擇 Immobilisation 和芯片 Sensor Chip: CM5 及 Amine Coupling方法，同時(shí)設(shè)置不偶聯(lián)鼠抗抗體的空白參比通道； (b) 將所有試劑平衡到室溫20-25°C，設(shè)定加樣流速為1〇μ?7π?η ; (c) 以inject方式進(jìn)樣，順次用11(^LNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入過量的鼠 抗抗體偶聯(lián)在活化后的芯片表面上，偶聯(lián)完畢后用6〇μ? Ethanolamine HC1封閉，使過量的 反應(yīng)基團(tuán)失活； (d) 分析偶聯(lián)效果：通過在開始注射鼠抗抗體前放置一個(gè)基線報(bào)道點(diǎn)，并在注射 Ethanolamine HC1結(jié)束后放置第二個(gè)報(bào)道點(diǎn)，如信號(hào)差達(dá)到1000-5000RU，則結(jié)合鼠抗的水 平良好； (2) 新城疫單克隆抗體的捕獲及適當(dāng)捕獲濃度的確定： (a) 將0. 1~0. 5Pg/ml的含新城疫單克隆抗體的腹水樣品和10(Tl000nM的新城疫重組 蛋白抗原，經(jīng)〇. 22Mm的微孔過濾備用； (b) 在配體通道上進(jìn)樣1〇μ?單抗腹水樣品，然后同時(shí)在空白參比通道和配體通道上進(jìn) 樣3min抗原，解離5min，設(shè)定流速為lOPL/min ; (c) 控制捕獲單抗后抗原檢測(cè)的RU信號(hào)差值處在3(T50RU之間，以此確定為合適的 單抗捕獲濃度，后續(xù)的樣品檢測(cè)均以此捕獲濃度的單抗進(jìn)樣；最后用PH3. 0的緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生，去除新城疫單克隆抗體； (3) 樣品的檢測(cè) (a) 待檢抗原經(jīng)0. 22Mm的微孔過濾備用； (b) 在相應(yīng)的預(yù)要捕獲新城疫單克隆抗體的配體通道上進(jìn)樣，設(shè)定流速為1〇μ?7π?η，進(jìn) 樣1〇μ?確定好濃度的新城疫單克隆抗體； (c) 分別注射25PL的HBS緩沖液作為陰性對(duì)照和待檢抗原，順次進(jìn)樣與新城疫單克隆 抗體結(jié)合，并限定120s解離時(shí)間，最后用ρΗ3. 0的緩沖液10mM Glycine HC1進(jìn)行再生； (d) 通過在開始注射新城疫單克隆抗體后放置一個(gè)基線報(bào)道點(diǎn)，并在注射待檢樣品后 放置第二個(gè)報(bào)道點(diǎn)，陰性對(duì)照無任何差值，陽性樣品信號(hào)有差值，以此確定有新城疫病毒的 存在。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，生物傳感器芯片為CM5芯片。
【文檔編號(hào)】G01N21/552GK104297215SQ201410649854
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】孫濤, 曹丙蕾, 孫明君, 徐彪, 房保海, 王群 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心