一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器及其制備和檢測(cè)方法
【專利摘要】一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器及其制備和檢測(cè)方法，傳感器包括條狀光學(xué)玻璃，其底部鍍有金屬內(nèi)反射膜，側(cè)壁鍍有鉻膜，納米鉻薄膜上鍍有帶生物分子敏感層的金膜，同時(shí)條狀光學(xué)玻璃的入射光路上設(shè)有平行光管，出射光路上依次設(shè)有偏振片、光纖準(zhǔn)直器以及與光纖準(zhǔn)直器通過多模光纖連接的光纖光譜儀。在條狀光學(xué)玻璃的底端鍍上金屬內(nèi)反射膜；在其頂部的側(cè)壁上依次鍍鉻膜和金膜；在金膜表面形成生物分子敏感層；并用BSA溶液封閉，得到探入式表面等離子體共振生物傳感器。本發(fā)明插入試管液體中進(jìn)行SPR測(cè)量簡(jiǎn)化了系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了傳感器的便攜化。同時(shí)，克服了現(xiàn)有探針式SPR傳感器的缺陷，其測(cè)量方式則簡(jiǎn)便的多，實(shí)現(xiàn)了儀器便攜化。
【專利說明】一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器及其制備和檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種表面等離子體共振生物傳感器，具體涉及一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器及其制備和檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)是光束通過介質(zhì)表面與金屬薄膜耦合而產(chǎn)生的一種物理光學(xué)現(xiàn)象。1902年，Wood在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。形成SPR的必要條件之一是金屬與電介質(zhì)界面的存在，當(dāng)平行表面的平行光以大于全反射臨界角的某一角度入射，如果其頻率與金屬表面振蕩的自由電子(即等離子)頻率一致，入射光就會(huì)被耦合入表面等離子體內(nèi)，在這個(gè)角度由于表面等離子體共振將引起對(duì)入射光束能量的顯著吸收從而使反射率顯著減少，出射光譜中必然會(huì)呈現(xiàn)一個(gè)吸收峰。SPR對(duì)附著在金屬表面的電介質(zhì)的折射率非常敏感，把入射到金屬膜上的光按入射角度或者波長(zhǎng)變化來掃描，如果金屬膜表面的光學(xué)折射率由于結(jié)合了生物分子而發(fā)生微小變化，那么出射端得到的光譜吸收峰的位置也會(huì)所變化，這是SPR生物傳感器的理論基礎(chǔ)。
[0003]1983年，Liedberg等首次將表面等離子體共振技術(shù)用于化學(xué)傳感器領(lǐng)域，并研制出基于表面等離子體共振原理的氣體傳感器。1990年，瑞典BIAcore公司開發(fā)出世界上第一臺(tái)商業(yè)化的SPR生物分子相互作用分析儀。之后，SPR生物傳感器的研究全面展開并不斷深入，其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。由于SPR傳感器具有能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)生物分子間相互作用、方便快捷、無須標(biāo)記樣品及樣品需要量少等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種成熟的檢測(cè)生物分子間相互作用的方法，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、受體/配體、抗體/抗原分子結(jié)合、免疫識(shí)別、癌癥研究和新藥篩選等生命科學(xué)領(lǐng)域，用于實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)研究蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/核酸、新藥分子/靶蛋白等生物分子的相互作用過程。
[0004]在SPR儀器市場(chǎng)上，目前Biacore和Spreeta SPR儀器產(chǎn)品占據(jù)絕大部分國際國內(nèi)市場(chǎng)。其中，Biacore儀器采用入射角掃描方式，它需要精確的機(jī)械轉(zhuǎn)角儀，而精密轉(zhuǎn)角儀通常比較沉重，再加上液流控制系統(tǒng)，這類臺(tái)式儀器僅適合于具備一定條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，且價(jià)格昂貴。Spreeta TM雖屬便攜式SPR儀器，但仍然需要液流輸送系統(tǒng)，并且靈敏度不如臺(tái)式Biacore。光纖SPR傳感器可使儀器系統(tǒng)微型化，是便攜SPR儀器發(fā)展的重要方向。
[0005]US5359681專利描述了一類光纖傳感器，包括傳輸型傳感器和終端反射型傳感器，其中傳輸型傳感器仍然需要液流輸送系統(tǒng)，而終端反射型SPR傳感器則可將光纖傳感探針插入試管中的液體進(jìn)行測(cè)量而無需液流輸送系統(tǒng)。但是這種基于多模光纖的探針式SPR傳感器雖然可直接在試管中測(cè)量但也存在一些缺陷，例如，由于光在光纖傳感探針中的多模傳輸以及未去除s偏振光，與棱鏡耦合的臺(tái)式SPR相比，其共振峰寬而低，從而造成的信噪比降低。另一方面，在圓形光纖表面拋光和鍍膜均需要特殊的拋光工藝和專用的鍍膜裝置從而使SPR傳感探頭制備工藝復(fù)雜，成本較高。這些缺陷限制了這類便攜式SPR裝置的廣泛應(yīng)用。單模光纖可保持激發(fā)光的偏振態(tài)；只耦合單一反射角的光纖進(jìn)入光纖SPR傳感器，能得到反射本底較弱的較尖銳的SPR共振峰。CN 101769857專利描述了一種基于單模光纖的SPR方案。目前光纖SPR傳感器所存在的問題是:多模光纖SPR的靈敏度和信噪比不高，諧振波長(zhǎng)具有彌散性；而單模光纖芯徑尺寸小，耦合光較弱。另外，光纖SPR傳感探針制備工藝也比平面?zhèn)鞲衅瑥?fù)雜。為了克服上述問題，出現(xiàn)了不用光纖，而是用光學(xué)玻璃棒加工的傳感器探頭(Takuo Akimoto, Analytica Chimica Acta 610 (2008) 119 - 124),但需要分束鏡，反射光只有不到二分之一的光強(qiáng)進(jìn)入光譜儀，信號(hào)損失一半以上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器及其制備和檢測(cè)方法，該生物傳感器制備成本低，工藝簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)便攜式、插入式的SPR測(cè)量時(shí)，在進(jìn)行SPR測(cè)試時(shí)其信噪比與檢測(cè)靈敏度與棱鏡耦合的臺(tái)式SPR儀器相同。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器包括橫截面為矩形的條狀光學(xué)玻璃，且條狀光學(xué)玻璃頂部為入射端，底部為反射端，且作為反射端的底部鍍有金屬內(nèi)反射膜，條狀光學(xué)玻璃底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)面上鍍有納米鉻膜，納米鉻膜上鍍有金膜，金膜的表面還自組裝有生物分子敏感層，生物分子敏感層是將組裝在金膜表面的11-巰基烷二酸單分子層用EDC/NHS活化，然后再與生物探針結(jié)合得到的；
[0008]所述的條狀光學(xué)玻璃的入射光路上設(shè)有平行光管，出射光路上依次設(shè)有偏振片、光纖準(zhǔn)直器以及與光纖準(zhǔn)直器通過多模光纖連接的光纖光譜儀；
[0009]其中，平行光管用于提供波長(zhǎng)在400?740nm的平行光束；平行光束從條狀光學(xué)玻璃的頂端入射，在條狀光學(xué)玻璃中經(jīng)多次內(nèi)反射而入射至金膜產(chǎn)生SPR共振；偏振片用于濾去從條狀光學(xué)玻璃出射的反射光中的s偏振光,保留P偏振光；光纖準(zhǔn)直器用于接收P偏振光并產(chǎn)生準(zhǔn)直光，光纖光譜儀用于測(cè)量SPR共振譜。
[0010]所述的條狀光學(xué)玻璃是由K9或B270光學(xué)玻璃裁切而成。
[0011]所述的金屬內(nèi)反射膜的厚度為200?250nm，納米鉻膜的厚度為2nm，金膜的厚度為 45 ?50nmo
[0012]所述的金屬內(nèi)反射膜為鋁膜。
[0013]一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0014]I)將光學(xué)玻璃裁切成條狀光學(xué)玻璃，然后將條狀光學(xué)玻璃拋光成光學(xué)平面，利用真空鍍膜機(jī)在條狀光學(xué)玻璃的底端=部鍍上金屬內(nèi)反射膜；接著在條狀光學(xué)玻璃底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)面鍍上鉻膜，在鉻膜上鍍金膜；
[0015]2)將條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分浸入由體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水組成的溶液中進(jìn)行表面處理，然后浸入11-巰基烷二酸的乙醇溶液使條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分表面組裝11-巰基烷二酸單分子層；
[0016]3)將條狀光學(xué)玻璃組裝有l(wèi)l-巰基烷二酸單分子層的部分浸入EDC/NHS溶液中于室溫條件下活化，接著向活化后的11-巰基烷二酸單分子層上滴加生物探針溶液進(jìn)行溫育使生物探針與活化后的11-巰基烷二酸單分子層結(jié)合以得到生物分子敏感層，然后沖洗干凈，接著用BSA水溶液封閉，最后再次沖洗；
[0017]4)在條狀光學(xué)玻璃的入射光路上安裝平行光管，出射光路上依次安裝偏振片、光纖準(zhǔn)直器以及光纖光譜儀，且光纖準(zhǔn)直器與光纖光譜儀利用多模光纖連接。
[0018]所述的步驟2)中11-巰基烷二酸的乙醇溶液的質(zhì)量濃度為5?10%，步驟3)中的EDC/sulfo-NHS水溶液是由體積比為1:1的EDC水溶液和sulfo-NHS水溶液混合而成的，且EDC水溶液的濃度為0.4mol/L, sulfo-NHS水溶液的濃度為0.lmol/L ；BSA水溶液的質(zhì)量濃度為I?5% ;步驟3)中沖洗采用pH值=7.4的PBS緩沖液。
[0019]一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0020]I)將條狀光學(xué)玻璃固定有生物探針的部分浸入待測(cè)溶液中；
[0021]2)平行光管發(fā)出平行光束，平行光束從條狀光學(xué)玻璃的入射端進(jìn)入，在探條狀光學(xué)玻璃內(nèi)經(jīng)過多次反射后傳輸?shù)浇饘賰?nèi)反射膜以激發(fā)SPR共振，接著平行光束被金屬內(nèi)反射膜反射，反射光從入射端出射后經(jīng)偏振片濾去s偏振光，保留P偏振光，接著通過光纖準(zhǔn)直器以及多模光纖然后用光纖光譜儀測(cè)量反射光譜，得到SPR共振譜。
[0022]所述的步驟2)中進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃的入射端時(shí)的平行光束與條狀光學(xué)玻璃的入射端法線夾角在25°?40°，出射時(shí)的反射光與進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃入射端時(shí)的平行光束沿條狀光學(xué)玻璃入射端法線對(duì)稱。
[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0024]本發(fā)明生物傳感器采用了橫截面為矩形的條狀光學(xué)玻璃，從整個(gè)生物傳感器的表面呈細(xì)長(zhǎng)矩形，且其傳感面(即頂端側(cè)壁)是靠近頂端的平面，所以易于鍍制平面納米金膜，所以，本發(fā)明在對(duì)條狀光學(xué)玻璃進(jìn)行鍍膜時(shí)，制備工藝簡(jiǎn)單，成本較低，而不像光纖式SPR傳感器探頭，在圓形光纖表面拋光和鍍膜均需要特殊的拋光工藝和專用的鍍膜裝置。
[0025]SPR測(cè)試時(shí)，本發(fā)明制得的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器從其條狀光學(xué)玻璃的底部端面入射的光束為多波長(zhǎng)平行光束，該平行光束經(jīng)條狀光學(xué)玻璃面多次反射后，入射于金膜而激發(fā)表面等離子體共振(SPR)，由于光線的入射角是單一的，從而在原理上保證了該SPR測(cè)試系統(tǒng)與棱鏡耦合的臺(tái)式波長(zhǎng)共振型SPR儀器具有相同的靈敏度。另外，本發(fā)明SPR測(cè)試系統(tǒng)中在出射光路中插入偏振片，只有P偏振光進(jìn)入光纖光譜儀，因而從原理上具有與臺(tái)式SPR相同的信噪比。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的示意圖；
[0027]圖2為本發(fā)明條狀光學(xué)玻璃及鉻膜、金膜以及生物分子敏感層的位置關(guān)系示意圖；
[0028]圖3為帶有金屬內(nèi)反射膜、鉻膜、金膜的條狀光學(xué)玻璃在丙三醇-水溶液中的SPR共振曲線；其中，a為去離子水，b為質(zhì)量濃度為2.5%的丙三醇-水溶液，c為質(zhì)量濃度為5%的丙三醇-水溶液，d為質(zhì)量濃度為10%的丙三醇-水溶液，f為質(zhì)量濃度為20%的丙三醇-水溶液；
[0029]圖4為SPR共振峰波長(zhǎng)移動(dòng)δ λ與溶液折射率的關(guān)系曲線；其中，a為帶有金屬內(nèi)反射膜、鉻膜、金膜的條狀光學(xué)玻璃在丙三醇-水溶液的得到的結(jié)果，b為經(jīng)典的棱鏡耦合式實(shí)驗(yàn)裝置的測(cè)量結(jié)果；
[0030]圖5:本發(fā)明便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器在不同待測(cè)溶液中的動(dòng)態(tài)曲線；
[0031]其中，1、平行光管，2、條狀光學(xué)玻璃,3、偏振片,4、光纖準(zhǔn)直器,5、多模光纖,6、光纖光譜儀，7、金屬內(nèi)反射膜，8、生物探針。

【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033]參見圖1和圖2，本發(fā)明探入式表面等離子體共振生物傳感器2包括橫截面為矩形的條狀光學(xué)玻璃，且條狀光學(xué)玻璃底部為入射端，頂部為反射端，作為反射端的頂部鍍有金屬內(nèi)反射膜7，條狀光學(xué)玻璃頂部的側(cè)壁上鍍有鉻膜，納米鉻膜薄上鍍有金膜，金膜的表面還自組裝有生物分子敏感層，生物分子敏感層是將組裝在金膜表面的11-巰基烷二酸單分子層用EDC/NHS活化，然后再與生物探針8結(jié)合得到的；其中，條狀光學(xué)玻璃是由K9或B270光學(xué)玻璃裁切而成，金屬內(nèi)反射膜7的厚度為200?250nm，鉻膜的厚度為2nm，金膜的厚度為45?50nm，鉻膜和金膜的長(zhǎng)度均為4?5nm。金屬內(nèi)反射膜7優(yōu)選為鋁膜。
[0034]所述的條狀光學(xué)玻璃2的入射光路上設(shè)有平行光管I,出射光路上依次設(shè)有偏振片3、光纖準(zhǔn)直器(4)以及與光纖準(zhǔn)直器4通過多模光纖5連接的光纖光譜儀6 ;且平行光管I采用鹵鎢燈做光源；光纖光譜儀6采用AvaSpec 2408光纖光譜儀；
[0035]其中，平行光管I用于提供波長(zhǎng)在400?740nm的6mm的平行光束；從條狀光學(xué)玻璃2的頂端入射，在條狀光學(xué)玻璃2中經(jīng)多次內(nèi)反射而入射至金膜產(chǎn)生SPR共振；偏振片3用于接收探入式表面等離子體共振生物傳感器2發(fā)出的反射光并濾去其中s偏振光，保留P偏振光；光纖準(zhǔn)直器4用于接收來自偏振片3的P偏振光并產(chǎn)生準(zhǔn)直光,光纖光譜儀6用于產(chǎn)生SPR共振譜。
[0036]本發(fā)明探入式表面等離子體共振生物傳感器2的制備方法包括以下步驟:
[0037]I)將K9或B270光學(xué)玻璃裁切成條狀光學(xué)玻璃，幾何尺寸為60mmX4mmX2mm，然后將條狀光學(xué)玻璃拋光成光學(xué)平面，然后利用真空鍍膜機(jī)在條狀光學(xué)玻璃的底部鍍上厚度在200?250nm的金屬內(nèi)反射膜7 ;接著在條狀光學(xué)玻璃底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)壁鍍上厚度為2nm的鉻膜，在鉻膜上鍍厚度為45?50nm的金膜；
[0038]2)將條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分浸入由體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水組成的溶液中進(jìn)行表面處理，取出后用大量去離子水沖洗并氮?dú)獯蹈?；且濃硫酸的質(zhì)量濃度為98%，雙氧水的質(zhì)量濃度為30% ;然后浸入質(zhì)量濃度為5?10%的11-巰基烷二酸的乙醇溶液12小時(shí)使條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分表面組裝11-巰基烷二酸單分子層，取出組裝有11-巰基烷二酸單分子層的條狀光學(xué)玻璃鍍依次用乙醇和去離子水沖洗并用氮?dú)獯蹈桑?br> [0039]3)將條狀光學(xué)玻璃組裝有l(wèi)l-巰基烷二酸單分子層的部分浸入EDC/NHS溶液中于室溫條件下活化30分鐘，接著向活化后的11-巰基烷二酸單分子層上滴加生物探針溶液進(jìn)行溫育使生物探針與活化后的11-巰基烷二酸單分子層結(jié)合以得到生物分子敏感層，然后用pH值=7.4的PBS緩沖液沖洗干凈，接著用質(zhì)量濃度為I?5 %的BSA水溶液封閉，最后再次用PH值=7.4的PBS緩沖液沖洗；其中，EDC/sulfo-NHS水溶液是由體積比為1:1的EDC水溶液和sulfo-NHS水溶液混合而成的，且EDC水溶液的濃度為0.4mol/L, suIfo-NHS水溶液的濃度為0.lmol/L ；
[0040]4)在條狀光學(xué)玻璃2的入射光路上安裝平行光管1，出射光路上依次安裝偏振片
3、光纖準(zhǔn)直器4以及光纖光譜儀6，且光纖準(zhǔn)直器4與光纖光譜儀6利用多模光纖5連接。
[0041]本發(fā)明的生物探針不僅可以是已有的生物探針還可以是自己合成的，本發(fā)明所采用的生物探針是CLEN-BSA合成抗原，其為實(shí)驗(yàn)室制備，合成方法如下:
[0042]I)稱取已純化的5mg鹽酸克倫特羅溶于ImL lmol/L預(yù)冷的鹽酸溶液，然后向其中加500 μ L的去離子水調(diào)節(jié)pH值等于0.5，得到鹽酸克倫特羅溶液；
[0043]2)在4°C下向鹽酸克倫特羅溶液中連續(xù)緩慢加入60 μ L 0.2mol的NaNO2 (分三次加入，每次20 μ L,每次間隔20s)并于4°C低速攪拌lh，此時(shí)用碘化鉀淀粉試紙檢驗(yàn)，試紙變?yōu)樯钭仙?，得到偶氮后的CL。
[0044]3)將30mg BSA溶于Iml pH值=9.5的碳酸鹽緩沖液(0.lmol/L)中，將偶氮后的CL慢慢滴入BSA溶液中，期間用lmol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值，使pH值維持在9.0?
9.5之間，在避光條件下繼續(xù)攪拌3h，接著在4°C冰箱中用PBS水溶液(0.01mol/L，pH值=
7.2?7.4)連續(xù)透析2d，多次換液，分裝，_20°C保存，即得到CLEN-BSA合成抗原。
[0045]一種基于上述便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0046]I)將探入式表面等離子體共振生物傳感器2固定有生物探針的部分浸入待測(cè)溶液中；
[0047]2)平行光管I發(fā)出6mm的平行光束，平行光束從探入式表面等離子體共振生物傳感器2中條狀光學(xué)玻璃的入射端進(jìn)入探入式表面等離子體共振生物傳感器2中，在探入式表面等離子體共振生物傳感器2經(jīng)過多次反射后傳輸?shù)浇饘賰?nèi)反射膜7以激發(fā)SPR共振，接著平行光束被金屬內(nèi)反射膜7反射，反射光從入射端出射后經(jīng)偏振片3濾去s偏振光，保留P偏振光，接著通過光纖準(zhǔn)直器4以及多模光纖然5后用光纖光譜儀6測(cè)量反射光譜，得到SPR共振譜；其中，進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃的入射端時(shí)的平行光束與條狀光學(xué)玻璃的入射端法線夾角在25°?40°，出射時(shí)的反射光與進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃入射端時(shí)的平行光束沿條狀光學(xué)玻璃入射端法線對(duì)稱，這樣能夠使發(fā)射光從入射端出射后向另一方向出射，從而完全進(jìn)入光譜儀而不是像光纖反射式傳感器那樣，反射光沿光纖向光源方向傳輸，通過光纖分路器只能利用反射光的二分之一能量。
[0048]為了對(duì)本發(fā)明基于探入式表面等離子體共振生物傳感器2的檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，本發(fā)明給出了一個(gè)探入式表面等離子體共振生物傳感器的制備方法的實(shí)施例:
[0049]I)將B270光學(xué)玻璃裁切成條狀光學(xué)玻璃2，幾何尺寸為60mmX4mmX2mm，然后將條狀光學(xué)玻璃拋光成光學(xué)平面，然后利用真空鍍膜機(jī)在條狀光學(xué)玻璃的底部鍍上厚度在200?250nm的金屬內(nèi)反射膜7 ;接著在條狀光學(xué)玻璃底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)壁鍍上厚度為2nm的鉻膜，在鉻膜上鍍厚度為45?50nm的金膜；
[0050]2)將條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分浸入由體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水組成的溶液中進(jìn)行表面處理，取出后用大量去離子水沖洗并氮?dú)獯蹈?；且濃硫酸的質(zhì)量濃度為98%，雙氧水的質(zhì)量濃度為30% ;然后浸入質(zhì)量濃度為5%的11-巰基烷二酸的乙醇溶液12小時(shí)使條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分表面組裝11-巰基烷二酸單分子層，取出組裝有11-巰基烷二酸單分子層的條狀光學(xué)玻璃鍍依次用乙醇和去離子水沖洗并用氮?dú)獯蹈桑?br> [0051]3)將條狀光學(xué)玻璃組裝有l(wèi)l-巰基烷二酸單分子層的部分浸入EDC/NHS溶液中于室溫條件下活化30分鐘；用加樣器向活化后的11-巰基烷二酸單分子層上滴加33.3mg/L的生物探針?biāo)芤河?7°C溫育I小時(shí)使生物探針與活化后的11-巰基烷二酸單分子層結(jié)合以得到生物分子敏感層，然后用PH值=7.4的PBS緩沖液沖洗干凈，接著用質(zhì)量濃度為I %的BSA溶液封閉，最后再次用pH值=7.4的PBS緩沖液沖洗，得到探入式表面等離子體共振生物傳感器2 ;其中，EDC/sulfo-NHS水溶液是由體積比為1:1的EDC水溶液和sulfo-NHS水溶液混合而成的，且EDC水溶液的濃度為0.4mol/L, sulfo-NHS水溶液的濃度為0.1mol/L ；
[0052]4)在條狀光學(xué)玻璃2的入射光路上安裝平行光管1，出射光路上依次安裝偏振片
3、光纖準(zhǔn)直器4以及光纖光譜儀6，且光纖準(zhǔn)直器4與光纖光譜儀6利用多模光纖5連接。
[0053]基于該便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0054]I)以鹵鎢燈做光源，制作能夠發(fā)出直徑為6mm的平行光束的平行光管1，
[0055]2)將條狀光學(xué)玻璃2固定有生物探針的部分浸入不同的待測(cè)溶液中；平行光束從的入射端進(jìn)入探入式表面等離子體共振生物傳感器2中，在條狀光學(xué)玻璃2經(jīng)過多次反射后傳輸?shù)浇饘賰?nèi)反射膜7以激發(fā)SPR共振，接著平行光束被金屬內(nèi)反射膜7反射，反射光從入射端出射后經(jīng)偏振片3濾去s偏振光，保留P偏振光，接著通過光纖準(zhǔn)直器4以及多模光纖然5后用光纖光譜儀6測(cè)量反射光譜，得到SPR共振譜；由于不同的入射角度可使反射光有可能處于如下幾種狀態(tài):向光源方向反射、向與入射光方向?qū)ΨQ的方向反射，部分向光源方向，部分向?qū)ΨQ方向。而且不同的入射角度可使SPR共振峰處于不用波長(zhǎng)位置。因此，在平行光束從探入式表面等離子體共振生物傳感器2中條狀光學(xué)玻璃的入射端進(jìn)入探入式表面等離子體共振生物傳感器2中時(shí)，通過調(diào)整進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃的入射端時(shí)的平行光束與條狀光學(xué)玻璃的入射端法線夾角在25°?40°，使SPR共振波長(zhǎng)在600nm，保證這樣能夠使發(fā)射光從入射端出射后向另一方向出射，從而完全進(jìn)入光譜儀而不是像光纖反射式傳感器那樣，反射光沿光纖向光源方向傳輸，通過光纖分路器只能利用反射光的二分之一能量。
[0056]圖5給出了在EDC/sulfo-NHS水溶液、CLEN-BSA水溶液、block溶液以及ant1-CLEN(鹽酸克倫特羅)水溶液中的該SPR動(dòng)態(tài)曲線記錄了插入不同試管溶液時(shí)，敏感膜表面生物分子反應(yīng)過程。
[0057]為了驗(yàn)證不同的折射率得到共振波長(zhǎng)是不一樣的，本發(fā)明若金膜上沒有組裝生物分子敏感層，然后以此檢測(cè)不同濃度的丙三醇-水溶液(不同濃度的甘油)的SPR響應(yīng)，其結(jié)果見圖3，由圖3可以看出，不同濃度的丙三醇-水溶液的SPR相應(yīng)波長(zhǎng)不同。由于不同濃度的甘油溶液的折射率(η)是已知的，所以根據(jù)圖3a-圖3f這組SPR響應(yīng)曲線，得到不同濃度丙三醇-水溶液的共振波長(zhǎng)λ，能夠作出如圖4a的λ -η的關(guān)系曲線，對(duì)比圖4a和圖4b，同樣折射率的丙三醇-水溶液，采用帶有金屬內(nèi)反射膜、鉻膜、金膜的條狀光學(xué)玻璃的傳感器測(cè)定的SPR共振峰波長(zhǎng)移動(dòng)δ λ遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于采用經(jīng)典的棱鏡耦合式實(shí)驗(yàn)裝置的測(cè)量結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器，其特征在于:包括橫截面為矩形的條狀光學(xué)玻璃(2)，且條狀光學(xué)玻璃(2)頂部為入射端，底部為反射端，且作為反射端的底部鍍有金屬內(nèi)反射膜(7)，條狀光學(xué)玻璃(2)底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)面上鍍有納米鉻膜，納米鉻膜上鍍有金膜，金膜的表面還自組裝有生物分子敏感層，生物分子敏感層是將組裝在金膜表面的11-巰基烷二酸單分子層用EDC/NHS活化，然后再與生物探針(8)結(jié)合得到的； 所述的條狀光學(xué)玻璃(2)的入射光路上設(shè)有平行光管(I)，出射光路上依次設(shè)有偏振片(3)、光纖準(zhǔn)直器(4)以及與光纖準(zhǔn)直器(4)通過多模光纖(5)連接的光纖光譜儀(6)； 其中，平行光管(I)用于提供波長(zhǎng)在400?740nm的平行光束；平行光束從條狀光學(xué)玻璃(2)的頂端入射，在條狀光學(xué)玻璃(2)中經(jīng)多次內(nèi)反射而入射至金膜產(chǎn)生SPR共振；偏振片(3)用于濾去從條狀光學(xué)玻璃(2)出射的反射光中的s偏振光,保留P偏振光；光纖準(zhǔn)直器(4)用于接收P偏振光并產(chǎn)生準(zhǔn)直光，光纖光譜儀(6)用于測(cè)量SPR共振譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器，其特征在于:所述的條狀光學(xué)玻璃(2)是由K9或B270光學(xué)玻璃裁切而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器，其特征在于:所述的金屬內(nèi)反射膜(7)的厚度為200?250nm，納米鉻膜的厚度為2nm，金膜的厚度為45?50nmo
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器，其特征在于:所述的金屬內(nèi)反射膜(9)為鋁膜。
5.—種如權(quán)利要求1?4中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將光學(xué)玻璃裁切成條狀光學(xué)玻璃(2)，然后將條狀光學(xué)玻璃拋光成光學(xué)平面，利用真空鍍膜機(jī)在條狀光學(xué)玻璃的底端=部鍍上金屬內(nèi)反射膜(7);接著在條狀光學(xué)玻璃底部相對(duì)的兩個(gè)側(cè)面鍍上鉻膜，在鉻膜上鍍金膜； 2)將條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分浸入由體積比為3:1的濃硫酸和雙氧水組成的溶液中進(jìn)行表面處理，然后浸入11-巰基烷二酸的乙醇溶液使條狀光學(xué)玻璃鍍有金膜的部分表面組裝11-巰基烷二酸單分子層； 3)將條狀光學(xué)玻璃組裝有11-巰基烷二酸單分子層的部分浸入EDC/NHS溶液中于室溫條件下活化，接著向活化后的11-巰基烷二酸單分子層上滴加生物探針溶液進(jìn)行溫育使生物探針與活化后的11-巰基烷二酸單分子層結(jié)合以得到生物分子敏感層，然后沖洗干凈，接著用BSA水溶液封閉，最后再次沖洗； 4)在條狀光學(xué)玻璃(2)的入射光路上安裝平行光管(I)，出射光路上依次安裝偏振片(3)、光纖準(zhǔn)直器(4)以及光纖光譜儀￠)，且光纖準(zhǔn)直器(4)與光纖光譜儀(6)利用多模光纖(5)連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的制備方法，其特征在于:所述的步驟2)中11-巰基烷二酸的乙醇溶液的質(zhì)量濃度為5?10%，步驟3)中的EDC/sulfo-NHS水溶液是由體積比為1:1的EDC水溶液和sulfo_NHS水溶液混合而成的，且EDC水溶液的濃度為0.4mol/L, suIfo-NHS水溶液的濃度為0.lmol/L ；BSA水溶液的質(zhì)量濃度為I?5% ;步驟3)中沖洗采用pH值=7.4的PBS緩沖液。
7.一種基于權(quán)利要求1所述的便攜探入式表面等離子體共振生物傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將條狀光學(xué)玻璃(2)固定有生物探針的部分浸入待測(cè)溶液中； 2)平行光管(I)發(fā)出平行光束，平行光束從條狀光學(xué)玻璃(2)的入射端進(jìn)入，在探條狀光學(xué)玻璃(2)內(nèi)經(jīng)過多次反射后傳輸?shù)浇饘賰?nèi)反射膜(7)以激發(fā)SPR共振，接著平行光束被金屬內(nèi)反射膜(7)反射，反射光從入射端出射后經(jīng)偏振片(3)濾去s偏振光，保留P偏振光，接著通過光纖準(zhǔn)直器以及多模光纖然后用光纖光譜儀測(cè)量反射光譜，得到SPR共振譜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的步驟2)中進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃的入射端時(shí)的平行光束與條狀光學(xué)玻璃的入射端法線夾角在25°?40°，出射時(shí)的反射光與進(jìn)入條狀光學(xué)玻璃入射端時(shí)的平行光束沿條狀光學(xué)玻璃入射端法線對(duì)稱。
【文檔編號(hào)】G01N21/55GK104198440SQ201410438052
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】方湘怡, 李俊鋒, 楊玉琮, 吳逸川, 姚曼文, 王林玉, 梁曉慧 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)