一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測雙酚a的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）檢測環(huán)境激素中BPA的方法，屬于分析化學領(lǐng)域，是采用有機熒光染料FAM作為FRET的供體分子、TAMRA作為FRET的受體分子，利用BPA適配體與BPA特異性結(jié)合的原理，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)檢測BPA的含量。該方法在BPA濃度為1.0×10-10-1.0×10-8mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性，最低檢測限可達7.0×10-11mol/L，其檢測限大大低于國家衛(wèi)生標準中對碳酸酯樹脂和成型品中酚溶出量的要求，可準確測定水壺、水杯、奶瓶、食品容器等橡塑制品中BPA的含量。
【專利說明】一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測雙酚A的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 突光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，簡稱FRET)是處 于激發(fā)態(tài)的供體分子通過遠程偶極作用將自身能力轉(zhuǎn)移給近距離的處于基態(tài)的受體分子 的非輻射過程。受體分鐘必須能吸收供體發(fā)射波長處的能量，故受體分子的激發(fā)波長必須 與供體分子的發(fā)射波長重疊。自 F5rster(F0rster T. Annals of Physics, 1948，2:55) 首次闡述了 FRET的機制以來，F(xiàn)RET廣泛應(yīng)用于核酸研究、蛋白質(zhì)研究、細胞研究、免疫測定 等領(lǐng)域。
[0003] 核酸適配體（aptamer)，來源于拉丁文"aptus"，簡稱適配體，又稱核酸適體或核 酸適配子，是一段由25-80個RNA或DNA堿基組成的寡核苷酸片段。適配體可以與目標物 通過適應(yīng)性折疊相結(jié)合，形成發(fā)卡（hairpin)、假結(jié)（pseudoknot)、凸環(huán)（bulge)、G-四鏈 體（G-quartet)等特殊的三維結(jié)構(gòu)。自從 1990 年 Tuerk 等（Tuerk C·，Gold L. Science 1990，249，505)首次利用指數(shù)富集系統(tǒng)進化的體外篩選技術(shù)（SELEX)篩選出噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA型適配體以來，適配體的研究工作得到了快速發(fā)展。僅1999年，NeXstar Pharmaceuticals公司和Colorado大學就篩選出超過100種的適配體。Ellington小組已 經(jīng)創(chuàng)建了一個適配體數(shù)據(jù)庫，里面包含了適配體的詳細信息。
[0004] 雙酚4化18?1^11〇14，簡稱8?4)全名2,2-二（4-羥基苯基）丙烷，用于合成聚碳 酸酯和環(huán)氧樹脂等材料，也可用作酚醛樹脂、可塑性聚酯、抗氧劑及聚氯乙烯的穩(wěn)定劑，被 廣泛用于制造嬰兒奶瓶、廚房用具及醫(yī)療設(shè)備。已有研究表明，BPA有模擬雌激素的效果，是 一種環(huán)境激素，可通過包裝材料進入食品和飲料中，導致人體內(nèi)分泌失調(diào)，威脅胎兒和兒童 健康，還可能與癌癥和新陳代謝紊亂導致的肥胖有關(guān)。因此，建立一種操作簡便、靈敏度高 的BPA檢測方法是十分必要的。本發(fā)明利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，采用有機熒光染料羥 基熒光素（FAM)作為FRET的供體分子、羧基四甲基羅丹明（TAMRA)作為FRET的受體分子， 利用BPA適配體與BPA特異性結(jié)合的原理，可準確測定樣品中BPA的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，該檢測方法 對BPA的檢測靈敏度高、特異性好，在1. OX OX 10_8 mol/L濃度范圍內(nèi)對BPA的檢 測呈現(xiàn)良好的線性，最低檢測限為7. OX 10_n mol/L，可實現(xiàn)BPA的快速、準確測定。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，是基于BPA適配體與BPA特異性結(jié)合的 原理，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的含量； 包括以下步驟： 1) 將DNA以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，加入50 mmol/L、pH值為7· 4的BR緩 沖液中充分振蕩5-10 min，放入4°C冰箱備用； 2) 將步驟1)中的DNA加入到50 mmol/L、pH值為7. 4的BR緩沖液中，再加入Dl、T1 和T2,雜交反應(yīng)2 h ; 3) 檢測步驟2)反應(yīng)后溶液的熒光信號，記為初始熒光信號值匕； 4) 向步驟3)檢測后的溶液中加入待測溶液，特異性結(jié)合10 h ; 5) 檢測步驟4)反應(yīng)后溶液的熒光信號,記為反應(yīng)熒光信號值F ; 6) 根據(jù)BPA濃度與熒光強度變化值的線性方程計算出BPA的濃度，進而得出待測溶液 中BPA的含量。
[0007] 步驟2)加入DNA后，BR緩沖液中DNA的濃度為1. 0X 10_7 mol/L。
[0008] 步驟 2)所述 D1 為 BPA 適配體探針，其序列為：5' - TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTG GATTTTTTATTTCTGGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3' （SEQ ID N0:1)。
[0009] 步驟2)所述T1為BPA適配體互補鏈1探針，其序列為： 5' -FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3' （SEQ ID N0:2)。
[0010] 步驟2)所述T2為BPA適配體互補鏈2探針，其序列為： 5'-TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3' （SEQ ID N0:3)。
[0011] 突光信號檢測所用突光分光光度儀的設(shè)定參數(shù)為：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長 為500 - 650 nm，入射狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，光電倍增管電壓為700 V。
[0012] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點為： (1)本發(fā)明的操作步驟簡單、特異性強、靈敏度高、成本低，實用性強，對BPA的最低檢 測限為7. 0ΧΚΓ11 mol/L，大大低于國家衛(wèi)生標準中對碳酸酯樹脂和成型品中酚溶出量的 要求，可準確測定樣品中BPA的含量。
[0013] (2)本發(fā)明所建立基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的熒光分析檢測方法，操作簡 便、檢測限低，能夠?qū)崿F(xiàn)水壺、水杯、奶瓶、食品容器等橡塑制品中BPA的在線檢測，且對檢 測物質(zhì)不造成破壞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測雙酚A的原理圖。
[0015] 圖2為本發(fā)明各反應(yīng)溶液熒光譜圖。
[0016] 圖3為本發(fā)明實施例標準溶液的工作曲線。

【具體實施方式】
[0017] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0018] 本實施例所需儀器及試劑溶液如下：Fluorescence spectrophotometer (型號規(guī) 格：cary eclipse ;設(shè)備編號：EL02065703, Varian美國），精密酸度計(上海大普儀器有限 公司），三孔電熱恒溫水槽(上海一恒科學儀器有限公司），石英比色皿(江蘇金壇市新航儀 器廠）；BPA、DNA (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。
[0019] BPA 適配體探針 D1 的序列：5' - TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTTTTTATTTCTGGG GTTCAGTTCTTTTTTGT-3,； BPA 適配體互補鏈 1 探針 T1 的序列：5' - FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3 ; BPA 適配體互補鏈 2 探針 T2 的序列：5' -TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3'。
[0020] 一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，是基于BPA適配體與BPA特異性結(jié) 合的原理，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的含量；包括以下步驟： 1) 將DNA以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，慢慢打開管蓋，加入50 mmol/L、pH值 為7. 4的BR緩沖溶液后再蓋上管蓋，充分振蕩10 min后，放入4°C冰箱備用； 2) 將 5μ L 6· 0ΧΚΓ6 mol/L 步驟 1)中的 DNA力口入至IJ 300μ L 50 mmol/L、pH值為 7. 4 的BR緩沖液中，再分別加入5yL 6.0X10_6 mol/L的T1、T2和D1，雜交反應(yīng)2 h ; 3) 檢測步驟2)反應(yīng)后溶液的熒光信號，記為初始熒光信號值匕； 4) 用無水乙醇配制濃度為1. ΟΧ ΚΓ5 mol/L的BPA母液，再用二次水稀釋母液得到濃 度依次為 1. ΟΧΚΓ'5. ΟΧΚΓ'Ι. 0Χ1(Γ9、5· OXlO'l. 0ΧΚΓ8 mol/L 的 BPA 標準溶液； 5) 向步驟3)檢測后的溶液中分別加入步驟4)所配制的含BPA濃度為1. ΟΧ 1(Γ1(Ι、 5· ΟΧΚΓ'Ι. 0Χ1(Γ9、5· OXlO'l. 0Χ1(Γ8 mol/L 的標準溶液，特異性結(jié)合 10 h ; 6) 分別檢測步驟5)反應(yīng)后溶液的熒光信號，記為反應(yīng)熒光信號值F ; 7) 根據(jù)BPA濃度與熒光強度變化值繪制標準溶液工作曲線，得出線性方程； 8) 將待測樣品洗凈、晾干，按2ml/cm2的比例加入蒸餾水，100°C浸泡30min后冷卻至室 溫，補水至原浸泡體積作為待測溶液；測定待測溶液的熒光信號值后，根據(jù)步驟7)得出的 BPA濃度對數(shù)值與熒光強度變化值的線性方程計算出待測溶液中BPA的濃度，進而得出待 測樣品中BPA的含量。
[0021] 突光信號檢測所用突光分光光度儀的設(shè)定參數(shù)為：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長 為500 nm，入射狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，光電倍增管電壓為700 V。
[0022] 從圖2可以看出，當BPA適配體探針D1與BPA適配體互補鏈探針ΤΙ、T2結(jié)合后， 溶液熒光強度較低；當BPA與BPA適配體探針特異性結(jié)合反應(yīng)完全后，BPA適配體互補鏈探 針ΤΙ、T2游離出來，使熒光強度顯著增強，通過熒光分光光度計可準確測定其熒光信號值。
[0023] 從圖3可以看出，BPA濃度和熒光強度變化值的線性方程為： Δ F=0. 2493+0. 0203X, R=0.9986 ； 其中AF=F -FQ:FQ為T1、T2與D1雜交后580 nm下的熒光強度與520 nm下的熒光 強度之比，F(xiàn)為加入BPA反應(yīng)10 h后580 nm下的熒光強度與520 nm下的熒光強度之比，X 為BPA濃度的對數(shù)值，濃度單位為mol/L。
[0024] 利用本實施例的檢測方法對奶瓶和PC塑料瓶中BPA的含量進行測定，結(jié)果見表1。
[0025] 表1不同樣品中BPA含量的測定結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，是基于BPA適配體與BPA特異性結(jié)合 的原理，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測ΒΡΑ的含量；包括以下步驟： 1) 將DNA以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，加入50 mmol/L、pH值為7. 4的BR緩 沖液中充分振蕩5-10 min，放入4°C冰箱備用； 2) 將步驟1)中的DNA加入到50 mmol/L、pH值為7. 4的BR緩沖液中，再加入Dl、T1 和T2,雜交反應(yīng)2 h ; 3) 檢測步驟2)反應(yīng)后溶液的熒光信號，記為初始熒光信號值匕； 4) 向步驟3)檢測后的溶液中加入待測溶液，特異性結(jié)合10 h ; 5) 檢測步驟4)反應(yīng)后溶液的熒光信號,記為反應(yīng)熒光信號值F ; 6) 根據(jù)BPA濃度與熒光強度變化值的線性方程計算出BPA的濃度，進而得出待測溶液 中BPA的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，其特征在于：步驟2) 加入DNA后，BR緩沖液中DNA的濃度為1. ΟΧ ΚΓ7 mol/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，其特征在于：步驟2) 所述 D1 為 BPA 適配體探針，其序列為：5' -TGGTCGTTGGTCGTTCGCGTTTCTGGATTT TTTATTTCT GGGGTTCAGTTCTTTTTTGT-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，其特征在于：步驟2) 所述T1為BPA適配體互補鏈1探針，其序列為：5' - FAM-ATCCAGAAACGCGAACGA-3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，其特征在于：步驟2) 所述T2為BPA適配體互補鏈2探針，其序列為：5' -TAMRA-AACTGAACCCCAGAAAT-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測BPA的方法，其特征在于：熒光信 號檢測所用熒光分光光度儀的設(shè)定參數(shù)為：激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為500 - 650 nm， 入射狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為10 nm，光電倍增管電壓為700 V。
【文檔編號】G01N21/64GK104155278SQ201410430253
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】李小晶, 唐熙, 戴金蘭, 呂水源, 陳旻實, 盧麗君 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心