一種精密度好線性相關(guān)性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種精密度好線性相關(guān)性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，包括體積比為3:1的試劑R1和試劑R2，其組分分別為：試劑R1由PIPES(哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩沖液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉試劑、乙醇胺組成；試劑R2由PIPES緩沖液、結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白組成；本發(fā)明提供的檢測試劑盒靈敏度和線性相關(guān)性要優(yōu)于現(xiàn)有的檢測試劑盒。
【專利說明】一種精密度好線性相關(guān)性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種精密度好線性相關(guān)性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，屬體外診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]肌鈣蛋白是調(diào)節(jié)橫紋肌和心肌收縮相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。肌鈣蛋白由肌鈣蛋白T(TnT)、肌鈣蛋白I (TnI)及肌鈣蛋白C(TnC)三種亞單位所組成。其中，TnI是肌原纖維AFP酶的抑制性亞單位，分子量18kD。肌鈣蛋白I包繞著TnC的中央螺旋，成為Ca2+結(jié)合位點的組成部分。三種亞單位組合與原肌球蛋白一起構(gòu)成復(fù)合體，調(diào)節(jié)肌細胞的收縮力和速度。心肌I丐蛋白I (cardiactroponinl, CTnI)是惟一的不同于骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的肌I丐蛋白I。心肌鈣蛋白I在N端具有一個附加的31個氨基酸順序，使CTnI具有心肌的特異性，因而被廣泛地研究作為心肌損傷的敏感的和特異的血清標志物。
急性心肌梗死病人CTn動態(tài)變化曲線和CK-MB很相近,急性心肌梗死后4?8h在血清中高于決定值，出現(xiàn)晚于肌紅蛋白，但其升高持續(xù)時間(窗口期)長，CTn 一旦升高往往持續(xù)4?1d,甚至可達3周。和CK-MB比較，正常人血清中幾乎測不到CTn，因而它對急性心肌梗死有較高的分辨能力。CTn是心肌特有的，具有在血中出現(xiàn)時間早、敏感度高、特異性強和診斷窗口期長等特點，是診斷急性心肌梗死的理想指標。此外，CTnT還可用于評估溶栓療法的成功與否，觀察冠狀動脈是否復(fù)通，研究表明，用CTnT評估復(fù)通90min時優(yōu)于CK-MB和肌紅蛋白，如果結(jié)合其他診斷AMI指標，如12導(dǎo)聯(lián)心電圖的S-T段變化，效果更好。
目前已知的測定肌鈣蛋白的方法有電化學(xué)發(fā)光免疫檢測法(ECLIA)、酶聯(lián)免疫法吸收法、酶聯(lián)熒光分析法(ELFA)，但由于具有操作繁瑣、耗時長、過度浪費資源的缺點，不適于常規(guī)檢驗。目前比較常用的是膠體金免疫層析法，但此方法敏感性不好，重復(fù)性不好，只能用于定性檢測，對于臨床病人的療效觀察有局限性。膠乳顆粒增強比濁法是目前較準確，穩(wěn)定的檢測方法。其原理是當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原反應(yīng)凝集時，改變反應(yīng)液的透光性能，但也存在著靈敏度不高的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種乳膠包被的肌鈣蛋白檢測試劑盒。該試劑盒應(yīng)用于全自動生化分析儀上，結(jié)果準確性強，靈敏度較高便于大規(guī)模推廣。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒包括體積比為3:1的試劑Rl和試劑R2，其組分分別為:
試劑Rl:
PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩沖液聚乙二醇200-220mmol/L
疊氮鈉5-10 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉試劑 1-5 mmol/L 乙醇胺 2-3 mmol/L ；
試劑R2:
PIPES緩沖液
結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200-220mmol/L 吐溫-205%
疊氮鈉l-5mmol/
乙二胺四乙酸鈉0.5-3 mmol/L
牛血清白蛋白l_5mmol/L。
[0005]本試劑盒的制備方法及操作步驟如下:
(a)按下列比例配制好試劑
試劑 Rl:PIPES 緩沖液、200-220mmol/L 聚乙二醇、5-10 mmol/L 疊氮鈉、1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉、2-3 mmol/L乙醇胺；
試劑R2 =PIPES緩沖液，200-220mmol/L結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球5% (v/v)吐溫-20、l_5mmol/L疊氮鈉、0.5-3 mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白。
[0006](b)將Rl、R2試劑與待測樣本按一定比例混合；
(c)用全自動生化分析儀500nm條件下測定吸光度的變化；
Cd)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中肌鈣蛋白的濃度。
[0007]其中，所述結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒采用如下制備方法制備而成:配制 PH 值為 5.0 和 6.8 的 50mM 的 MES 緩沖溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH 值為 5.0 的 50mM MES 緩沖液:150nml0% 的微球:NHS: EDAC 為 70:10:15: 5，40°C恒溫振蕩器上活化40min, 15000rps離心15min,去掉上清液,收集離心沉淀。加入PH值為6.8的MES,使用水浴超聲儀超聲2min，離心，洗滌3次后，加入肌鈣蛋白抗體200ul，在振蕩器上偶聯(lián)1.5h，離心洗滌加入10%的封閉液100rpm搖床上封閉過夜。
[0008]全自動生化儀參數(shù)設(shè)置
(a)檢測溫度:37°C
(b)檢測波長:主波長為500nm;副波長設(shè)為O ;
(c)反應(yīng)時間:10分鐘。其中，孵育時間3分鐘，反應(yīng)時間100秒，檢測時間200秒。
[0009]3.檢測步驟
1.樣品(檢測的樣品包括蒸餾水、標準品和臨床樣本)加試劑I混勻，37°C孵育5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，37°C反應(yīng)5 min后，在500nm條件下檢測，讀取吸光度Al，ΔΑ = Al-AO0其中樣本用量6 μ?，試劑I用量225 μ?，試劑2用量75 μ?。
[0010]通過讀取的吸光度值計算出肌鈣蛋白的濃度。
[0011]本發(fā)明提供的檢測試劑盒，靈敏度高，相關(guān)性好。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明線性關(guān)系圖。

【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0014]實施例1 試劑Rl:
PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩沖液聚乙二醇200mmol/L
疊氮鈉8 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉試劑 4 mmol/L 乙醇胺 2 mmol/L ；
試劑R2:
PIPES緩沖液
結(jié)合有肌?丐蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200mmol/L 吐溫-205%
疊氮鈉3mmol/
乙二胺四乙酸鈉2 mmol/L
牛血清白蛋白3mmol/L。
[0015]采用全自動生化分析儀500nm條件下測定吸光度的變化:
全自動生化儀參數(shù)設(shè)置:
(a)檢測溫度:37°C
(b)檢測波長:主波長為500nm;副波長設(shè)為O ;
(c)反應(yīng)時間:10分鐘。其中，孵育時間3分鐘，反應(yīng)時間100秒，檢測時間200秒。
[0016]檢測步驟
樣品(檢測的樣品包括蒸餾水、標準品和臨床樣本)加試劑I混勻，37°c孵育5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，37°C反應(yīng)5 min后，在500nm條件下檢測，讀取吸光度Al，ΔΑ = Al-AO0其中樣本用量6 μL，試劑I用量225 μL，試劑2用量75 μL。
[0017]通過讀取的吸光度值計算出肌鈣蛋白的濃度。
[0018]實驗結(jié)果及分析
1、重復(fù)性實驗以產(chǎn)品標準要求選擇濃度為4.86ug /mL的定值樣本作為實驗樣本，用膠乳增強免疫透射比濁法先對此樣本重復(fù)測定20次，計算出均值、標準差和變異系數(shù)等相關(guān)數(shù)據(jù)見表1，為本發(fā)明試劑檢測結(jié)果；表2為對照試劑(北京九強生物技術(shù)有限公司提供)檢測結(jié)果.經(jīng)兩表的對照顯示，本發(fā)明試劑的重復(fù)性優(yōu)于市場上的對比試劑。
[0019]
表1本試劑重復(fù)性數(shù)據(jù)

【權(quán)利要求】
1.一種精密度好線性相關(guān)性強的肌鈣蛋白檢測試劑盒，其特征在于，包括體積比為3:1的試劑Rl和試劑R2，其組分分別為: 試劑Rl: PIPES (哌嗪-N，N-雙(2-乙磺酸))緩沖液 聚乙二醇200-220mmol/L 疊氮鈉5-10 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉試劑 1-5 mmol/L 乙醇胺 2-3 mmol /I, 試劑R2: PIPES緩沖液 結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒 200-220mmol/L 吐溫-205% 疊氮鈉l-5mmol/ 乙二胺四乙酸鈉0.5-3 mmol/L 牛血清白蛋白l-5mmol/L ; 所述結(jié)合有肌鈣蛋白單克隆抗體的微球顆粒采用如下制備方法制備而成: 配制 PH 值為 5.0 和 6.8 的 50mM 的 MES 緩沖溶液、150mg/mlNHS、50mg/ml EDAC，其中，PH 值為 5.0 的 50mM MES 緩沖液:150nml0% 的微球:NHS: EDAC 為 70:10:15: 5，40°C恒溫振蕩器上活化40min，15000rps離心15min，去掉上清液，收集離心沉淀；加入PH值為6.8的MES,使用水浴超聲儀超聲2min，離心，洗滌3次后，加入肌鈣蛋白抗體200ul，在振蕩器上偶聯(lián)1.5h，離心洗滌加入10%的封閉液100rpm搖床上封閉過夜。
【文檔編號】G01N21/31GK104181303SQ201410417576
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月22日
【發(fā)明者】甘宜梧, 葉麗華, 譚柏清, 李靜, 王綺 申請人:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司