一種用于被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)的綜合評(píng)判方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種判斷被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)方法，具體方法包括：被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)注射抗原后(1)肉眼觀察注射抗原后的大鼠一般癥狀表現(xiàn)；(2)計(jì)算大鼠在注射抗原后的足趾腫脹度；(3)取血觀察大鼠血液及生化指標(biāo)；(4)處死大鼠，觀察大鼠背部皮膚是否出現(xiàn)藍(lán)斑，并檢測(cè)大鼠皮膚、足趾、雙耳以及血液的OD值。
【專利說明】一種用于被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)的綜合評(píng)判方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種評(píng)價(jià)過敏反應(yīng)發(fā)生與否的方法，具體的說是一種通過多個(gè)指標(biāo)的 變化來全面綜合考察過敏反應(yīng)發(fā)生與否的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 中藥注射劑是我國獨(dú)創(chuàng)的現(xiàn)代新劑型，具有生物利用度高、起效快、作用強(qiáng)且廣 泛、療效突出、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療。隨著中藥注射劑的廣泛使用 有關(guān)其不良反應(yīng)的報(bào)告亦相繼增多，雖然中藥注射劑上報(bào)的不良反應(yīng)涉及多個(gè)系統(tǒng)，但最 常見的是過敏反應(yīng)。有數(shù)據(jù)表明，中藥注射劑在臨床使用中出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)的頻率明顯 高于其他中藥劑型，其中過敏性休克就占22. 8%。過敏反應(yīng)輕則僅表現(xiàn)為皮疹，重則引起 過敏性休克而致死亡。臨床上中藥注射劑引起的I型（速發(fā)型）過敏反應(yīng)，多發(fā)病急，危害 大，可迅速出現(xiàn)皮膚潮紅、瘙癢、腹痛甚至過敏性休克等嚴(yán)重癥狀，更甚者會(huì)因搶救不及時(shí) 而出現(xiàn)死亡。鑒于其高發(fā)生率和高危險(xiǎn)性，I型過敏反應(yīng)成為中藥注射劑所致過敏反應(yīng)中 最常見、危害最大、最受關(guān)注的一種不良反應(yīng)。而過敏反應(yīng)可能造成的休克及死亡已引發(fā)了 人們對(duì)中藥注射劑安全性問題的疑慮和臨床用藥的信任危機(jī)。因此，中藥注射劑必須安全、 有效、質(zhì)量可控，但由于中藥的多組份、多靶點(diǎn)，給藥物安全性評(píng)價(jià)帶來許多困難。
[0003] 被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)是經(jīng)典的I型變態(tài)反應(yīng)性疾病的常用動(dòng)物模型，其原理為 受試物致敏動(dòng)物血清給予正常動(dòng)物皮內(nèi)，IgE的F端與皮膚的肥大細(xì)胞表面的特異受體結(jié) 合，形成IgE的復(fù)合物，使肥大細(xì)胞致敏。當(dāng)抗原攻擊時(shí)，抗原與肥大細(xì)胞表面的IgE的Fab 端結(jié)合，導(dǎo)致IgE分子結(jié)構(gòu)的改變，引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放過敏介質(zhì)組胺、慢性物質(zhì)等， 使血管的通透性增加，使靜脈注射抗原的同時(shí)注入伊文思藍(lán)燃料在該皮膚滲出著色。傳統(tǒng) 的被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)主要觀察指標(biāo)為根據(jù)局部皮膚藍(lán)染范圍或程度，可判定血管通透性變 化的大小，繼而判定過敏反應(yīng)的程度。但該指標(biāo)精確度較差，對(duì)呈現(xiàn)散在性藍(lán)斑時(shí)很難精 確，且假陰性率較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)目前常用的用于判斷被動(dòng)皮膚過敏過敏反應(yīng) 發(fā)生的評(píng)判方法精確度不足，假陰性率較高的缺點(diǎn)，提供一種能夠比較準(zhǔn)確的判定臨床前 藥理實(shí)驗(yàn)中藥物是否能夠引起動(dòng)物發(fā)生被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)的評(píng)判方法。運(yùn)用此方法，通過 臨床前藥理實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虮容^準(zhǔn)確的判斷藥物是否能夠引起動(dòng)物發(fā)生過敏反應(yīng)。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種用于被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)的綜合評(píng)判方法，包括如下步驟：
[0007] 1、被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)抗血清的制備：雄性BN大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試 藥物組。各組分別于第1、3、5日致敏，共三次，每組動(dòng)物每次皮下給予相對(duì)應(yīng)藥物的臨床 常用劑量。每組均于末次致敏后第12天進(jìn)行激發(fā)，并分別在激發(fā)前取血，3000r/min離心 15min后取上清液，-20°C冷凍保存，備用。
[0008] 2、被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)：SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試藥物組，每組8只。大 鼠背部中線兩側(cè)距背脊約1.5cm處剃毛，面積約4X4cm，用豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)制備 的各組抗血清原液及用生理鹽水1:1倍稀釋液，分別皮內(nèi)給于各組大鼠去毛各點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn) 0. lmL。每只動(dòng)物皮內(nèi)注射抗血清24h后，足趾儀量取各組大鼠的右后肢足趾容積，各組動(dòng) 物尾靜脈注射相對(duì)應(yīng)抗原（含0. 5%的伊文斯藍(lán)），每只1. OmL。30min后，
[0009] (a)肉眼觀察給予對(duì)應(yīng)抗原后大鼠的一般癥狀；
[0010] (b)足趾儀再次量取各動(dòng)物的右后肢足趾容積，計(jì)算動(dòng)物的右后肢足趾的腫脹度 [=(注射后足趾容積-注射前足趾容積）/注射前足趾容積X 100% ];
[0011] (C)動(dòng)物眼眶取血（注射不含0.5%的伊文思藍(lán)的抗原），抗凝血液檢測(cè)血液常 規(guī)指標(biāo)（白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體 積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)），3000r/min離心15min后取上清 液，用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)，用日本Hitachi7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌酶四項(xiàng)：谷 草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、乳酸脫氫酶（LDH)、α-羥丁酸脫氫酶（HBDH)、肌酸激酶（CK);腎功能四 項(xiàng)：血糖（GLU)、尿素（UREA)、肌酐（Cr)、尿酸（UA);肝功能七項(xiàng)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、谷草 轉(zhuǎn)氨酶（AST)、總蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、球蛋白（GLOB)、堿性磷酸酶（ALP)、乳酸脫氫酶 (LDH)；
[0012] (d)處死動(dòng)物，翻轉(zhuǎn)動(dòng)物背部皮膚，并觀察皮膚內(nèi)側(cè)有無藍(lán)斑（>5mm)并量取藍(lán)斑 直徑；
[0013] (e)剪取動(dòng)物的右側(cè)后足，背部皮膚，雙耳，剪碎后分別加入丙酮：生理鹽水（體積 比7:3)溶液5-6ml，侵泡24h后離心，取上清液，630nm處檢測(cè)0D值。
[0014] 有益效果：本方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0015] 1、評(píng)價(jià)指標(biāo)比較全面，能夠較準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)被動(dòng)過敏反應(yīng)的發(fā)生與否，避免單個(gè)指 標(biāo)導(dǎo)致的假陰性的發(fā)生。
[0016] 2、通過多指標(biāo)的綜合，可以判斷過敏發(fā)應(yīng)發(fā)生的嚴(yán)重程度。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0018] 實(shí)施例1 :
[0019] 一種用于被動(dòng)過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的評(píng)判方法，步驟如下：
[0020] 1、被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)抗血清的制備：雄性BN大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試 藥物組。各組分別于第1、3、5日致敏，共三次，每組動(dòng)物每次皮下給予相對(duì)應(yīng)藥物的臨床 常用劑量。每組均于末次致敏后第12天進(jìn)行激發(fā)，并分別在激發(fā)前取血，3000r/min離心 15min后取上清液，-20°C冷凍保存，備用。
[0021] 2、被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)：SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試藥物組，每組8只。大 鼠背部中線兩側(cè)距背脊約1.5cm處剃毛，面積約4X4cm，用豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)制備 的各組抗血清原液及用生理鹽水1:1倍稀釋液，分別皮內(nèi)給于各組大鼠去毛各點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn) 0. lmL。每只動(dòng)物皮內(nèi)注射抗血清24h后，足趾儀量取各組大鼠的右后肢足趾容積,各組動(dòng) 物尾靜脈注射相對(duì)應(yīng)抗原（含0. 5%的伊文斯藍(lán)），每只1. OmL。30min后，
[0022] (a)肉眼觀察給予對(duì)應(yīng)抗原后大鼠的一般癥狀；
[0023] (b)足趾儀再次量取各動(dòng)物的右后肢足趾容積，計(jì)算動(dòng)物的右后肢足趾的腫脹度 [=(注射后足趾容積-注射前足趾容積）/注射前足趾容積X 100% ];
[0024] (c)動(dòng)物眼眶取血（注射不含0.5%的伊文思藍(lán)的抗原），抗凝血液檢測(cè)血液常 規(guī)指標(biāo)（白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體 積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)），3000r/min離心15min后取上清 液，用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)，用日本Hitachi7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌酶四項(xiàng)：谷 草轉(zhuǎn)氨酶（AST)、乳酸脫氫酶（LDH)、α-羥丁酸脫氫酶（HBDH)、肌酸激酶（CK);腎功能四 項(xiàng)：血糖（GLU)、尿素（UREA)、肌酐（Cr)、尿酸（UA);肝功能七項(xiàng)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)、谷草 轉(zhuǎn)氨酶（AST)、總蛋白（TP)、白蛋白（ALB)、球蛋白（GLOB)、堿性磷酸酶（ALP)、乳酸脫氫酶 (LDH)；
[0025] (d)處死動(dòng)物，翻轉(zhuǎn)動(dòng)物背部皮膚，并觀察皮膚內(nèi)側(cè)有無藍(lán)斑（>5mm)并量取藍(lán)斑 直徑；
[0026] (e)剪取動(dòng)物的右側(cè)后足，背部皮膚，雙耳，剪碎后分別加入丙酮：生理鹽水（體積 比7:3)溶液5-6ml，侵泡24h后離心，取上清液，630nm處檢測(cè)0D值。
[0027] 3、試驗(yàn)結(jié)果
[0028] (1)動(dòng)物出現(xiàn)的一般癥狀：各組給予相應(yīng)抗原后，動(dòng)物表現(xiàn)：
[0029] 對(duì)照組：各動(dòng)物正常
[0030] 卵蛋白組：各動(dòng)物出現(xiàn)靜臥、打噴嚏、撓鼻、四肢水腫等現(xiàn)象。
[0031] (2)對(duì)足趾腫脹度的影響：與對(duì)照組比較，卵蛋白組實(shí)驗(yàn)前足趾容積無顯著差異 (P>0. 05)，給予對(duì)應(yīng)抗原后，卵蛋白組的足趾容積明顯腫脹，值高于對(duì)照組（P〈0. 05)。
[0032] 結(jié)果見表1。
[0033] 表1對(duì)大鼠足趾腫脹度的影響（η = 8， 土S)
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)的綜合評(píng)判方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)試驗(yàn)抗血清的制備：雄性BN大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試藥 物組；各組分別于第1、3、5日致敏，共三次，每組動(dòng)物每次皮下給予相對(duì)應(yīng)藥物的臨床常用 劑量；每組均于末次致敏后第12天進(jìn)行激發(fā)，并分別在激發(fā)前取血，3000r/min離心15min 后取上清液，_20°C冷凍保存，備用； (2) 被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)：SD大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、受試藥物組，每組8只；大鼠背 部中線兩側(cè)距背脊約1. 5cm處剃毛，面積約4X4cm，用豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)制備的各組 抗血清原液及用生理鹽水1:1倍稀釋液，分別皮內(nèi)給于各組大鼠去毛各點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)〇. lmL ; 每只動(dòng)物皮內(nèi)注射抗血清24h后，足趾儀量取各組大鼠的右后肢足趾容積，各組動(dòng)物尾靜 脈注射相對(duì)應(yīng)抗原，含0. 5%的伊文斯藍(lán)，每只1. OmL ;30min后， (a) 肉眼觀察給予對(duì)應(yīng)抗原后大鼠的一般癥狀； (b) 足趾儀再次量取各動(dòng)物的右后肢足趾容積，按如下公式計(jì)算動(dòng)物的右后肢足趾的 腫脹度： 動(dòng)物的右后肢足趾的腫脹度=(注射后足趾容積-注射前足趾容積）/注射前足趾容 積 X100% ; (C)動(dòng)物眼眶取血，注射不含0. 5 %的伊文思藍(lán)的抗原，抗凝血液檢測(cè)血液常規(guī)指標(biāo)， 包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、 平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度和血小板計(jì)數(shù)，3000r/min離心15min后取上清液， 用于檢測(cè)血液生化指標(biāo)，用日本Hitachi7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌酶四項(xiàng)：谷草轉(zhuǎn) 氨酶、乳酸脫氫酶、α -羥丁酸脫氫酶、肌酸激酶；腎功能四項(xiàng)：血糖、尿素、肌酐、尿酸；肝功 能七項(xiàng)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶； (d) 處死動(dòng)物，翻轉(zhuǎn)動(dòng)物背部皮膚，并觀察皮膚內(nèi)側(cè)有無>5mm藍(lán)斑并量取藍(lán)斑直徑； (e) 剪取動(dòng)物的右側(cè)后足，背部皮膚，雙耳，剪碎后分別加入丙酮和生理鹽水按體積比 7:3的混合液5?6ml，侵泡24h后離心，取上清液，630nm處檢測(cè)0D值。
【文檔編號(hào)】G01N33/48GK104062412SQ201410306749
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】蔣寶平, 余黎, 許立, 田磊 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)