自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系及其制備方法。本發(fā)明提供的制備方法，包括如下步驟：(1)利用激酶制備激酶球；(2)按照如下1)或2)的步驟分別制備激酶球-微管復合物或激酶球-驅(qū)動蛋白復合物；(3)按照如下1)或2)的步驟即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系；1)將所述激酶球-微管復合物、酪蛋白和驅(qū)動蛋白進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系；2)將激酶球-驅(qū)動蛋白復合物和微管進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系。本發(fā)明的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系能夠自供給能量，無需額外加入ATP，尤其有利于封閉的納米器件體系。
【專利說明】自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生命在于運動，機體的一切活動，從肌肉收縮、細胞內(nèi)部的物質(zhì)運輸、遺傳物質(zhì)(DNA)的復制、一直到細胞的分裂等，追蹤到分子水平，都是源于具有馬達功能的蛋白質(zhì)大分子做功推動的結(jié)果，因此它們稱為分子馬達或馬達蛋白。在目前馬達蛋白的研究中，以驅(qū)動蛋白(kinesin)的研究最為廣泛。kinesin以ATP為能量來源,沿著微管(microtubule)運動。鑒于這種馬達分子運動的強健性和高效性，在構(gòu)筑微米或納米級尺度上的活性仿生體系時，驅(qū)動蛋白kinesin成為一種理想的驅(qū)動部件，吸引了越來越多科學家的興趣。最近的研究把它們成功地應用到了一些體外人造的器件中，并實現(xiàn)了它們在體外作為納米機器人的構(gòu)想。例如微管裝載微球的運動、表面成像、分子自組裝、生物傳感器、操縱DNA鏈段以及蛋白組裝體的粒度分選等。在這些納米器件的構(gòu)筑中，能量ATP的供給是至關(guān)重要的。一些研究者通過紫外光、電場或微流控技術(shù)等，成功實現(xiàn)了 kinesin-microtubule運輸體系中ATP的供給,但是紫外光和電場會對kinesin和microtubule蛋白造成損傷,活性降低，并且不能實現(xiàn)能量的持續(xù)供給；而微流控技術(shù)則需要反復更換ATP緩沖液來實現(xiàn)能量的持續(xù)供給，操作步驟繁瑣。更值得一提的是，由于kinesin運動的同時將ATP轉(zhuǎn)化成ADP，體系中的ADP的濃度逐漸升高，對kinesin的活性有抑制的作用。因此，隨著ATP的消耗，體系中的ADP的濃度越來越高,kinesin在microtubule表面的運動速度越來越低,運動長度也減少。因此，需要制備一種ATP再生系統(tǒng)，緩沖ATP的濃度，保證ATP的濃度在一定的范圍內(nèi)，從而為kinesin-microtubule運輸體系持續(xù)提供能量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系及其制備方法，本發(fā)明運輸體系可將體系中產(chǎn)生的ADP轉(zhuǎn)化成ATP，實現(xiàn)ATP的再生，從而緩沖ATP的濃度，保證ATP的持續(xù)供給。
[0004]本發(fā)明所提供的自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系的制備方法，包括如下步驟:
[0005](I)利用激酶制備激酶球，所述激酶球為激酶微米球或激酶納米球；
[0006](2)按照如下I)或2)的步驟分別制備激酶球-微管復合物或激酶球-驅(qū)動蛋白復合物:
[0007]I)將所述激酶球分散到鏈霉親和素的水溶液中進行吸附，得到鏈霉親和素修飾的激酶球，將所述鏈霉親和素修飾的激酶球分散到生物素修飾的微管水溶液中，即得到所述激酶球-微管復合物；
[0008]2)將所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl緩沖溶液中，靜置后繼續(xù)加入至驅(qū)動蛋白的水溶液中，即得到所述激酶球-驅(qū)動蛋白復合物；[0009](3)按照如下I)或2)的步驟即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系；
[0010]I)將所述激酶球-微管復合物、酪蛋白和驅(qū)動蛋白(kinesin)進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系；
[0011]2)將所述激酶球-驅(qū)動蛋白復合物和微管進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系。
[0012]2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述激酶微米球的粒徑為4~Iym,具體可為 l~3.6ym、lym、2ymj|^3.6ym;
[0013]所述激酶納米球的粒徑為800~200nm。
[0014]上述的制備方法中，步驟(1)中，可利用模板法、共沉淀法、層層自組裝、乳液法或鹽析法制備所述激酶球；
[0015]所述激酶可為肌酸激酶、丙酮酸激酶或磷酸甘油酸激酶，可以催化ADP和相應底物產(chǎn)生ATP的酶。
[0016]上述的制備方法中，步驟(1)中，在制備所述激酶球的過程中添加聚電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、藥物或次氮基三乙酸，從而裝載不同的物質(zhì)。
[0017]上述的制備方法中，步驟(1)中，在所述激酶球的表面連接聚電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、藥物或次氮基三乙酸。 [0018]上述的制備方法中，所述生物素修飾的微管為購自Cytoskeleton有限公司的商品目錄號分別為T333P的商品。
[0019]上述的制備方法中，步驟(2)1)中，在將所述激酶球分散到鏈霉親和素的水溶液中進行吸附之前，所述方法還包括將激酶球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽水溶液中的步驟。
[0020]上述的制備方法中，步驟(2)2)中，在將所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl緩沖溶液中之前，所述方法還包括將所述激酶球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽水溶液中的步驟。
[0021]本發(fā)明還進一步提供了由上述方法制備得到的自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系，所述微管-驅(qū)動蛋白運輸體系還包括激酶底物和ADP。
[0022]在本發(fā)明提供的自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系中，所述激酶球與所述微管或所述驅(qū)動蛋白通過靜電作用、共價鍵、氫鍵或其他特異性識別作用連接在一起，形成復合物。
[0023]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0024](I)本發(fā)明的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系能夠自供給能量，無需額外加入ATP，尤其有利于封閉的納米器件體系。
[0025](2)本發(fā)明中的激酶球不僅可以為微管-驅(qū)動蛋白運輸體系持續(xù)提供能量，還能作為載體運輸不同的物質(zhì)。
[0026](3)本發(fā)明中的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系能夠?qū)崿F(xiàn)局部控制(即只有在有激酶球的區(qū)域，微管可以運動，沒有激酶球的區(qū)域，微管不能運動)微管-驅(qū)動蛋白運輸體系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明實施例1制備的肌酸激酶微球的掃描電子顯微圖(圖1 (a))和激光共聚焦顯微圖(圖1(b))。[0028]圖2為實施例1中MT-CPK微球復合物在kinesin修飾的表面上滑動時，ATP濃度隨時間變化曲線圖。
[0029]圖3為實施例1中MT-CPK微球復合物在kinesin修飾的表面上滑動時，微管運動的速度-時間關(guān)系曲線。
[0030]圖4為實施例1制備的微管-肌酸激酶微球復合物在驅(qū)動蛋白修飾的表面上運動的激光共聚焦顯微圖。
【具體實施方式】
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033]下述實施例中，所用的流體池是按照如下方法制備的:
[0034]普通流體池由載玻片，蓋玻片和雙面膠組成(Scotch3M，0.1mm厚)。載玻片和蓋玻片先在飽和KOH溶液中超聲IOmin,然后用乙醇和去離子水清洗,再用液氮吹干。如無特殊說明，實驗用的都是普通流體池。
[0035]硅烷化的流體池的制備方法與以上面制備普通流體池的方法一樣，只是需要預先將載玻片和蓋玻片進行硅烷化處理。制備氨基硅烷化的蓋玻片:將20μ I的3-氨丙基三乙氧基硅烷(5wt%)的丙酮溶液滴加在干凈的載玻片上，立即加蓋另一個干凈的載玻片。5min后，清水沖洗載玻片，液氮吹干載玻片。這樣就得到了兩片氨基硅烷化的蓋玻片。用上述2片蓋玻片制備流體池。
[0036]下述實施例中，所用的羅丹明標記的生物素修飾的微管的制備方法為:羅丹明標記的微管、生物素修飾的微管和未修飾的微管(體積比1:1:2)混合好后分散于4mMMgCl2、ImM GTP (三磷酸鳥苷)和5wt% DMSO的BRB80緩沖液中，總蛋白濃度為2.5mg/ml ;然后放入370C的水浴中孵育30min后，加入4 μ L的含20 μ M taxol (紫杉醇)的BRB80緩沖液中，即可得到羅丹明標記的生物素修飾的微管。
[0037]其中，羅丹明標記的微管、生物素修飾的微管和未修飾的微管均購自Cytoskeleton有限公司，商品目錄號分別為TL590M、T333P和TL238。
[0038]下述實施例中，所用的驅(qū)動蛋白是按照如下方法制備的:全長黑腹果蠅C端組氨酸標記的kinesin重鏈以及輕鏈的kinesin質(zhì)粒在大腸桿菌Escherichia coli (購自于中美泰和生物技術(shù)有限公司)中表達。然后用鎳一氨基三乙酸瓊脂糖樹脂(nickel-nitrilotriacetic acid agarose resin, N1-NTA)柱和憐酸纖維素柱提純表達的蛋白。
[0039]實施例1、制備微管-驅(qū)動蛋白運輸體系
[0040](I)制備肌酸激酶(CPK)微球
[0041 ] 取Na2CO3水液和CPK水溶液于圓底燒瓶中，隨后一次性快速加入等體積的CaCl2水溶液于燒瓶中，立即攪拌20s，靜置約2min，取沉淀物離心，3次水洗，得到CPK微球。
[0042]上述制備的CPK微球的掃描電子顯微圖如圖1(a)所示，激光共聚焦顯微圖如圖1 (b)所示，由該圖可知，本實施例制備的CPK微球的粒徑為3.6 μ m。
[0043](2)制備微管-肌酸激酶(MT-CPK)微球復合物
[0044]將步驟(I)制備的肌酸激酶微球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)水溶液中，吸附30min后，離心，水洗三次。再將得到的微球分散到50 μ M鏈霉親和素的水溶液中，吸附30min，離心，水洗三次。將鏈霉親和素修飾的肌酸激酶微球分散液逐滴加入到羅丹明標記的生物素修飾的微管水溶液中，室溫下輕搖30min，得到MT-CPK微球復合物。
[0045](3)MT-CPK微球復合物在kinesin修飾的表面上的滑動
[0046]首先，將酪蛋白(lmg/mL)溶液注入流體池中，吸附5min。然后將kinesin水溶液(20nM)注入流體池中，吸附5min。
[0047]然后，在MT-CPK微球復合物的分散液中添加ADP、磷酸肌酸(CP)和除氧劑，除氧劑中各成分的濃度為:20mM的葡萄糖、0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的過氧化氫酶和0.5wt% β -巰基乙醇。將上述分散液緩慢注入流體池中。
[0048]將流體池用硅膠密封起來，移至共聚焦顯微鏡下觀察。記錄下MT-CPK微球復合物隨時間的運動圖像，如圖4所示，由該圖可知，隨著時間的推移，MT-CPK微球復合物可以成功地在kinesin修飾的表面上滑動，滑動速度為62nm/s。
[0049]上述運動過程中，ATP濃度隨時間的變化曲線如圖2所示，由該圖可知，隨著反應時間的增加，ATP的濃度逐漸增多。
[0050]上述運動過程中，微管運動的速度與時間的關(guān)系曲線如圖3所示，由該圖可知，隨著反應時間的增加，微管在kinesin修飾的表面上的滑動速度越來越快，也證明了隨著反應時間的增加，ATP濃度也在增加。
[0051]實施例2、制備微管-驅(qū)動蛋白運輸體系
[0052]本實施例的步驟和參數(shù)與實施例1中基本相同，區(qū)別在于:在制備肌酸激酶微球時，在Na2CO3水溶液或CaCl2水溶液中加入了藥物模型(異硫氰酸熒光素_葡聚糖(FITC-Dextran))，共沉淀得到了肌酸激酶-藥物復合微球。因此，本實施例中制備的復合微球不僅可以為微管-驅(qū)動蛋白運輸體系持續(xù)提供ATP，還能作為載體運輸藥物或其他物質(zhì)。
[0053]實施例3、制備微管-驅(qū)動蛋白運輸體系
[0054](I)制備丙酮酸激酶(Pyruvate kinase, PK)微膠囊
[0055]首先，將粒徑為2 μ m的碳酸錳粒子分散到含有0.1M氯化鈉的PAH溶液中，振蕩吸附30min后，離心分離，充分洗滌后，再分散到含有0.1M氯化鈉的4mg/mL PK的Tris-HCl緩沖溶液(pH = 7.5)中吸附30min，離心分離，水洗3次。至此完成一個組裝周期。依次重復吸附PAH、PK的操作，直到所需的層數(shù)。其中作為模板的碳酸錳粒子可以用0.1M的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液溶除。最后將組裝好的微膠囊離心、洗滌3次后，得到(PAH/PK)nPAH微膠囊，粒徑為2 μ m。
[0056](2)制備微管-丙酮酸激酶(MT-PK)微膠囊復合物
[0057]將得到的(PAH/PK)nPAH微膠囊分散到50 μ M鏈霉親和素的水溶液中，吸附30min，離心，水洗三次。將鏈霉親和素修飾的(PAH/PK)nPAH微膠囊分散液逐滴加入到羅丹明標記的生物素修飾的微管溶液中，室溫下輕搖30min，得到MT-PK微膠囊復合物。
[0058](3)MT-PK微膠囊復合物在kinesin修飾的表面上的滑動
[0059]首先，將酪蛋白(lmg/mL)溶液注入流體池中，吸附5min。然后將kinesin溶液(20nM)注入流體池中，吸附5min。在MT-PK微膠囊復合物的分散液中添加ADP、磷酸烯醇式丙酮酸和除氧劑，除氧劑的各成分的濃度為:20mM的葡萄糖、0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的過氧化氫酶和0.5wt% β-巰基乙醇。將上述分散液緩慢注入流體池中。
[0060]將流體池用硅膠密封起來，移至共聚焦顯微鏡下觀察。記錄下MT-PK微膠囊復合物隨時間的運動圖像，由圖像可觀察到隨著時間的推移，MT-PK微膠囊復合物成功地在kinesin修飾的表面上滑動，滑動速度為87nm/s。
[0061]實施例4、制備微管-驅(qū)動蛋白運輸體系
[0062](I)制備磷酸甘油酸激酶(PGK)微球
[0063]取Na2CO3水溶液和PGK水溶液于圓底燒瓶中，隨后一次性快速加入與Na2CO3水溶液和PGK水溶液等體積的CaCl2水溶液于燒瓶中，立即攪拌30s，靜置約2min，取沉淀物離心，多次水洗，得到PGK微球，粒徑為I μ m。
[0064](2)制備驅(qū)動蛋白-磷酸甘油酸激酶(Kinesin-PGK)微球復合物
[0065]將磷酸甘油酸激酶微球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽(PAH)溶液中，吸附30min后，離心，水洗三次。再將得到的微球分散到2mg/mL酪蛋白溶液的Tris-HCl緩沖溶液(pH =
7.2)中吸附30min，混合均勻，放在冰上靜置30min。之后加入同體積的40nMkinesin溶液，充分混合，在冰上靜置30min，得到Kinesin-PGK微球復合物。
[0066](3) Kinesin-PGK微球復合物在微管修飾的表面上的運動
[0067]向硅烷化的流體池中持續(xù)引入100μ I微管溶液，靜置15min。然后注入酪蛋白(0.5mg/ml)溶液，中和未連接微管的氨基功能團。在Kinesin-PGK微球復合物的分散液中加入添加ADP、1，3- 二磷酸甘油酸和除氧劑，除氧劑各組分的濃度為:20mM的葡萄糖、
0.02mg/mL的葡萄糖氧化酶、0.008mg/mL的過氧化氫酶和0.5wt% β -巰基乙醇。將上述分散液緩慢注入流體池中。
[0068]將流體池用娃膠密封起來,移至共聚焦顯微鏡下觀察并記錄。記錄下Kinesin-PGK微球復合物隨時間的運動圖像，由圖像可觀察到，隨著時間的推移，Kinesin-PGK微球復合物成功地在固定好的微管陣列上運動，運動速度為103nm/s。
【權(quán)利要求】
1.一種自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系的制備方法，包括如下步驟: (1)利用激酶制備激酶球，所述激酶球為激酶微米球或激酶納米球； (2)按照如下I)或2)的步驟分別制備激酶球-微管復合物或激酶球-驅(qū)動蛋白復合物: 1)將所述激酶球分散到鏈霉親和素的水溶液中進行吸附，得到鏈霉親和素修飾的激酶球，將所述鏈霉親和素修飾的激酶球分散到生物素修飾的微管水溶液中，即得到所述激酶球-微管復合物； 2)將所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl緩沖溶液中，靜置后繼續(xù)加入至驅(qū)動蛋白的水溶液中，即得到所述激酶球-驅(qū)動蛋白復合物； (3)按照如下I)或2)的步驟即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系； 1)將所述激酶球-微管復合物、酪蛋白和驅(qū)動蛋白進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系； 2)將所述激酶球-驅(qū)動蛋白復合物和微管進行混合即得到所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述激酶微米球的粒徑為4~Iμ m ; 所述激酶納米球的粒徑 為800~200nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，利用模板法、共沉淀法、層層自組裝、乳液法或鹽析法制備所述激酶球； 所述激酶為肌酸激酶、丙酮酸激酶或磷酸甘油酸激酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，在制備所述激酶球的過程中添加聚電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、藥物或次氮基三乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟⑴中，在所述激酶球的表面連接聚電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖、藥物或次氮基三乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)I)中，在將所述激酶球分散到鏈霉親和素的水溶液中進行吸附之前，所述方法還包括將激酶球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽水溶液中的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)2)中，在將所述激酶球分散到酪蛋白水溶液的Tris-HCl緩沖溶液中之前，所述方法還包括將所述激酶球分散到聚烯丙基銨鹽酸鹽水溶液中的步驟。
8.權(quán)利要求1-8中任一項所述方法制備的自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系。
9.權(quán)利要求8所述自供能量的微管-驅(qū)動蛋白運輸體系在制備納米器件中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104020298SQ201410261964
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】李峻柏, 賈怡, 李潔齡, 馮熙云, 董偉光 申請人:中國科學院化學研究所