丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒基于膠體金免疫比濁法，包括試劑R2，所述試劑R2為含有標(biāo)記了丙型肝炎病毒核心抗原抗體的金納米顆粒的溶液，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.1nm，所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比為50：20–60。還本發(fā)明還提供該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，反應(yīng)迅速，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，反應(yīng)后不產(chǎn)生沉淀，便于生化儀的清洗，延長(zhǎng)了生化儀的使用壽命。
【專(zhuān)利說(shuō)明】丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒及其制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及一種基于膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒及其制備。
【背景技術(shù)】
[0002]丙型肝炎病毒(HCV)是誘發(fā)丙型肝炎的罪魁禍?zhǔn)祝渫ㄟ^(guò)血液傳播。全世界約有
1.7億感染了 HCV，其中中國(guó)有不下3800萬(wàn)的感染者，這個(gè)數(shù)字還在上升。與乙肝相比，丙肝更容易轉(zhuǎn)成慢性，約有70%的丙肝患者發(fā)展成慢性肝炎，20%發(fā)展成肝硬化，12%發(fā)展成肝癌，危害嚴(yán)重。因此，目前，慢性丙肝除了干擾素有確切的療效外，尚沒(méi)有其它有效的治療方法，而且疫苗的研制在短期內(nèi)難有突破性的進(jìn)展，因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)于丙肝患者有十分重要的意義。
[0003]現(xiàn)在常規(guī)檢測(cè)HCV的技術(shù)主要是抗體檢測(cè)和RNA檢測(cè)，各有缺陷。自1989年，HCV抗體診斷試劑確診出第一例HCV陽(yáng)性感染者以來(lái)，抗體診斷試劑已經(jīng)發(fā)展到了第四代，盡管檢測(cè)靈敏度在不斷提高，但是窗口期(即從病毒感染起直到可以檢測(cè)出該病毒標(biāo)志物之前的時(shí)期)仍然存在，并成為輸血安全的重大威脅之一?？贵w檢測(cè)也不能區(qū)分感染活動(dòng)期患者和病情康復(fù)者，不能用于患者的療效監(jiān)測(cè)；RNA檢測(cè)分為定性和定量?jī)煞N，HCV RNA檢測(cè)直接檢測(cè)HCV病毒是否存在，其基本原理是轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。雖然RNA檢測(cè)可以早期診斷HCV感染，而且特異性好靈敏度高，但該方法在設(shè)備和技術(shù)上要求較高，且人員需要專(zhuān)職培訓(xùn)，操作繁瑣，假陽(yáng)性高，因此難以在常規(guī)工作和基層實(shí)驗(yàn)室中推廣，限制了其應(yīng)用a
[0004]HCV病毒核心抗原是HCV基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白之一，氨基酸序列十分保守，有研究表明其在血清中的滴度與HCV RNA水平密切地相關(guān)，而核心抗原與RNA動(dòng)力學(xué)變化密切相關(guān)，因此可做為病程進(jìn)展或抗病毒治療的療效監(jiān)測(cè)的指標(biāo)。HCV核心抗原的檢測(cè)是一新型的檢測(cè)方法，研究始于上世紀(jì)九十年代中期，應(yīng)用最廣泛的是酶免疫方法和化學(xué)發(fā)光法。美國(guó)Ortho公司已經(jīng)推出了雙抗體夾心 > 法定性和定量檢測(cè)血清樣品中總的或游離的HCV核心抗原ELISA試劑盒，于2004年已經(jīng)在歐洲上市，中國(guó)僅有湖南景達(dá)制藥有限公司于2005年推出的核心抗原的ELISA檢測(cè)試劑盒。中國(guó)專(zhuān)利CN101419238L公開(kāi)了一種基于化學(xué)發(fā)光法的酶聯(lián)免疫試劑盒，但該方法操作也較為繁瑣，且靈敏度低，因此，發(fā)明一種既操作簡(jiǎn)便乂靈敏度高的試盒具有非常重要的臨床意義。
[0005]丙型肝炎病毒核心抗原的常用檢測(cè)有免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附法等。由于酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)耗時(shí)且操作復(fù)雜，已經(jīng)不能滿足大型醫(yī)院快速定量檢測(cè)的要求，而免疫比濁法隨著全自動(dòng)生化儀的普及，已經(jīng)發(fā)展出來(lái)多種快速免疫比濁檢測(cè)技術(shù)。
[0006]乳膠增強(qiáng)免疫透射比濁法的基本原理是，首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)的抗原時(shí)，抗原抗體結(jié)合而出現(xiàn)乳膠凝集。單個(gè)乳膠顆粒的大小在入射波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò)，當(dāng)兩個(gè)以上的乳膠顆粒凝集時(shí)，可阻礙光線透過(guò)，使得透射光減少，其減少程度與抗原的量成正比。此法提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，得到了廣泛的應(yīng)用。然而，乳膠增強(qiáng)免疫比濁法反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生沉淀，不利于生化儀的清洗，干擾試驗(yàn)結(jié)果，且乳膠制造成本較高，導(dǎo)致免疫比濁試劑盒價(jià)格和檢測(cè)成本偏高。因此又出現(xiàn)了納米顆粒增強(qiáng)的免疫比濁法,如專(zhuān)利CN101680890便公開(kāi)了一種通過(guò)比濁法測(cè)量人抑半骯氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測(cè)定方法和試劑組合，以及中國(guó)專(zhuān)利CN101819208中公開(kāi)了一種利用微球免疫比濁法檢測(cè)腦鈉肽試劑盒。專(zhuān)利CN101680890中具體公開(kāi)了，表面修飾了抗體的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、環(huán)氧樹(shù)脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它們相應(yīng)的共聚物制成的粒徑在80-105nm的有機(jī)高分子膠體納米顆粒。
[0007]本發(fā)明研究表明，許多納米顆粒此范圍之內(nèi)并不滿足試驗(yàn)的要求，比如:氧化鐵等磁性納米顆粒在40nm以上時(shí)由于順磁性和比重等因素而容易聚沉無(wú)法達(dá)到應(yīng)有的穩(wěn)定性；金納米顆粒在粒徑80-150nm的范圍內(nèi)穩(wěn)定性太差而不合適等。根據(jù)中國(guó)專(zhuān)利CN102749454的教導(dǎo)，本發(fā)明以直徑為35nm_60nm的膠體金顆粒進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，靈敏度較差，無(wú)法滿足臨床中對(duì)靈敏度小于Ing/mL的要求，和最低檢測(cè)限5ng/mL的要求，且線性范圍不覆蓋臨床中正常生理和病理情況的濃度區(qū)間，因此常常造成假陰性的結(jié)果；同時(shí)還存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)(平衡時(shí)間5-10min)，無(wú)法達(dá)到快速檢驗(yàn)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的錯(cuò)誤教導(dǎo)，解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明提供一種基于膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒。該試劑盒線性范圍寬、靈敏度高，制造成本低，反應(yīng)后不產(chǎn)生沉淀，方便生化儀清洗。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種基于膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括試劑R2，所述試劑R2為含有標(biāo)記了丙型肝炎病毒核心抗原抗體的金納米顆粒的溶液，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.lnm,優(yōu)選67.2nm_72.4nm ;所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比在50:20 - 60，優(yōu)選50:40-60。
[0010]具體來(lái)講，所述試劑R2為PH值5.0-9.5，優(yōu)選6.0-8.5的溶液。
[0011]進(jìn)一步地，所述試劑R2還含有促凝劑、穩(wěn)定劑、蔗糖和甘油，其中，促凝劑為重量體積比0.4%以內(nèi)的PEG20000，穩(wěn)定劑為重量體積比2%以內(nèi)的BSA，蔗糖的重量體積比為20%以下，甘油的重量體積比為20%以下。
[0012]作為優(yōu)選，上述R2為含有粒徑為72.4± 1.5nm且標(biāo)記了丙型肝炎病毒核心抗原的金納米顆粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5% BSA和重量體積比5%甘油的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液，其中，金納米顆粒和抗體的重量比為50:40-60。
[0013]更進(jìn)一步地，所述基于膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒還包括起緩沖和穩(wěn)定作用的試劑R1，所述試劑Rl為含有重量體積比0.2% BSA、重量體積比0.1%的NaN3和重量體積比0.05% Tween20的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液。在本發(fā)明的試劑盒中，發(fā)明點(diǎn)主要在試劑R2，試劑Rl也可以使用現(xiàn)有免疫比濁法中檢測(cè)試劑盒的試劑R1。
[0014]上述試劑R2通過(guò)如下方法制備:
[0015]制備金納米顆粒；
[0016]將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒，得偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液；
[0017]偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液中加入穩(wěn)定劑和促凝劑；[0018]2800rpm 離心 2 小時(shí)；
[0019]離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5% BSA和重量體積比5%甘油，pH值7.2的磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整濃度至OD54tlnm為0.2。
[0020]抗體的活性容易受到蛋白酶的分解、高溫變性、滲透壓等影響，可加入穩(wěn)定劑來(lái)穩(wěn)定抗體的結(jié)構(gòu)和活性。所述穩(wěn)定劑可以是蛋白質(zhì)、PEG、糖和可溶性的堿金屬和堿土金屬的無(wú)機(jī)鹽中的一種或多種；其中，所述蛋白質(zhì)優(yōu)選牛血清白蛋白(BSA)或明膠；所述糖可以是單糖、二糖或者多糖，其中，單糖優(yōu)選甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖；二糖優(yōu)選乳糖和/或蔗糖；多糖優(yōu)選海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一種或多種；所述無(wú)機(jī)鹽優(yōu)選齒素堿金屬和堿土金屬的無(wú)機(jī)鹽，更優(yōu)選氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣中的一種或多種。
[0021]本發(fā)明的試劑盒中，試劑R2還可以加入促凝劑，以增加抗原抗體反應(yīng)速率。
[0022]本發(fā)明所提供試劑盒中R2可以是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和HEPES緩沖液中的一種或多種緩沖液體系；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液體系。
[0023]本發(fā)明至少實(shí)現(xiàn)了如下有益效果:
[0024]本發(fā)明試劑盒具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間短，顯色反應(yīng)時(shí)間小于30s，平衡時(shí)間小于2min，可用于檢測(cè)血清或血漿中丙型肝炎病毒核心抗原含量，適用于臨床全自動(dòng)生化分析儀。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)丙型肝炎病毒核心抗原的靈敏度可以達(dá)到20ng/L，檢測(cè)線性范圍達(dá)0.0?20.0ug/L。
[0025]本發(fā)明試劑盒反應(yīng)后不產(chǎn)生沉淀，便于生化儀的清洗，延長(zhǎng)了生化儀的使用壽命。
[0026]本發(fā)明的試劑盒采用膠體金標(biāo)記抗體，降低了膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒的制造成本，具有較大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1:本發(fā)明實(shí)施例1-7檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]圖2:本發(fā)明實(shí)施例9-15檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下，將詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施例，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更詳細(xì)地理解本發(fā)明。
[0030]金納米顆粒以類(lèi)似膠體狀態(tài)存在，又稱膠體金。
[0031]本發(fā)明所提供基于膠體金免疫比濁法的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒中，試劑Rl可以使用現(xiàn)有技術(shù)中免疫比濁法檢測(cè)試劑盒中的試劑R1，即已有的商用品。具體來(lái)講，試劑Rl可以是含有0.2% BSA (w/v)作為穩(wěn)定劑、0.1 % NaN3 (w/v)作為防腐劑和0.05%Tween20 (w/v)作為促凝劑的，50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)，是一種促使抗原位點(diǎn)暴露促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)的緩存液。
[0032]以下各實(shí)施例僅制備試劑R2。
[0033]實(shí)施例1
[0034]本實(shí)施例試劑R2的制備分為三步，首先制備膠體金溶液，然后將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒上，最后和緩沖鹽、促凝劑和防腐劑等混溶成完整的體系。[0035]具體過(guò)程如下:
[0036]I) 50nm的膠體金的制備按如下步驟:
[0037]在清洗干凈的IOOOml圓底燒瓶中放入磁力攪拌子I枚，加入500ml超純水；
[0038]加入5ml濃度為1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速攪拌，并加熱至溶液沸騰，然后迅速將6ml濃度為1% (w/v)檸檬酸鈉溶液快速加入到燒瓶中，保持加熱和劇烈攪拌lOmin，溶液顏色先變黑色，然后逐漸變紫紅色；
[0039]關(guān)閉加熱開(kāi)關(guān)并繼續(xù)攪拌lOmin，然后停止攪拌冷卻至室溫，用超純水恢復(fù)到原體積 500ml ；
[0040]使用透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒的大小，對(duì)1000粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后直徑約為50.4±1.2nm,超濾除掉小分子后備用。
[0041]2)將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒上，具體過(guò)程如下:
[0042]將待標(biāo)記的抗體移入透析袋內(nèi)，在IOmM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中透析，以除去抗體溶液中的其他小分子物質(zhì)；
[0043]透析后的抗體轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，15000rpm離心60min，收集上清；
[0044]在紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)上測(cè)量溶液OD26tol吸收值，計(jì)算出溶液中抗體的濃度，并用IOmM磷酸鹽緩沖液將抗體稀釋至lmg/ml(w/v)；
[0045]取10支1.5毫升的離心管，加入I毫升制備好的膠體金溶液；
[0046]用10 %的碳酸鉀溶液將離心管內(nèi)的膠體金溶液調(diào)至pH9 ；
[0047]將l、2、4、8、10、20、40、60、80、100ul的抗體分別加到上述10支離心管中，震蕩30分鐘，此時(shí)每支試管中金納米顆粒和抗體的質(zhì)量比分別為50:1,50:2,50:4,50:8、50:10、50:20,50:40,50:60、50:80、50:100 ；
[0048]向上述溶液中加入IOOul濃度為10%的NaCl溶液，混勻，靜置2h后觀察各管，發(fā)現(xiàn)在金納米顆粒和抗體的質(zhì)量比達(dá)到50:100時(shí)，有顏色改變和少量的沉淀析出，這表明當(dāng)比例達(dá)50:100時(shí),是標(biāo)記蛋白的最大需求量,金納米顆粒和抗體的質(zhì)量比小于50:100無(wú)顏色改變和無(wú)沉淀析出，；
[0049]根據(jù)以上結(jié)果，將500ml膠體金溶液加入三角瓶中，邊攪拌邊用10%的碳酸鉀調(diào)整溶液的PH值至9 ;
[0050]將小于50ml的抗體加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌30分鐘，在此過(guò)程中抗體同納米顆粒在庫(kù)侖力和范德華力的作用下，突破膠體顆粒表面的水化層實(shí)現(xiàn)接觸，在靜電力和范德瓦爾德力的相互作用，膠體顆粒同蛋白質(zhì)分子實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)；
[0051]3)試劑R2的配制按如下步驟進(jìn)行:
[0052]在偶聯(lián)后的膠體金溶液中加入一定量的BSA作為穩(wěn)定劑，終濃度為1% (w/v)，攪拌5min使之完全溶解；
[0053]在上述溶液中加入一定量的PEG20000，終濃度為0.2% (w/v)，攪拌10分鐘；
[0054]將上述溶液移至離心管中，用2800rpm離心2h，棄上清，保留沉淀；
[0055]用濃度為20%蔗糖作為穩(wěn)定劑、0.2% PEG20000作為促凝劑、0.5% BSA作為穩(wěn)定劑、和5%甘油作為穩(wěn)定劑的IOmmol的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)重懸沉淀物，調(diào)整濃度至OD540nm 為 0.2 ;
[0056]得到R2溶液，分裝備用。[0057]實(shí)施例2
[0058]實(shí)施例2與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例2制備的膠體金顆粒粒徑為55nm。
[0059]制備55nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.6ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為56.2±1.5nm。
[0060]實(shí)施例3
[0061]實(shí)施例3與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例3制備的膠體金顆粒粒徑為62.2nm。
[0062]制備62.2nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.4ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為62.2±1.lnm。
[0063]實(shí)施例4
[0064]實(shí)施例4與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例4制備的膠體金顆粒粒徑為67nm。
[0065]制備67nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.2ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為67.2±1.5nm。
[0066]實(shí)施例5
[0067]實(shí)施例5與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例5制備的膠體金顆粒粒徑為72nm。
[0068]制備72nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.1ml0透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為72.4±1.5nm。
[0069]實(shí)施例6
[0070]實(shí)施例6與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例6制備的膠體金顆粒粒徑為79nm。
[0071]制備79nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為4.9ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為79.l±1.6nm。
[0072]實(shí)施例7
[0073]實(shí)施例7與實(shí)施例1的差別僅在于，通過(guò)調(diào)整所加入還原劑的量，使得實(shí)施例7制備的膠體金顆粒粒徑為83nm。
[0074]制備83nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為4.7ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為83.5±1.6nm。
[0075]實(shí)施例8
[0076]基于膠體金免疫比濁的丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒的臨床使用效果測(cè)定:
[0077](I)本發(fā)明試劑盒的測(cè)試條件及參數(shù)如下
[0078]a)測(cè)定步驟:先加入240ul試劑R1，然后加入3ul樣本，37°C孵育5min后加入60ul試劑R2，在540nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度，三秒后讀取第一點(diǎn)數(shù)據(jù)，反應(yīng)5分鐘后讀取另一點(diǎn)，得到吸光度值的差值。
[0079]b)計(jì)算方法:6點(diǎn)定標(biāo)法，以樣條函數(shù)為計(jì)算模式。根據(jù)吸光度與參考血清的值做工作曲線，樣品含量可根據(jù)其吸光度值在工作曲線上算出。[0080](2)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0081]通過(guò)本發(fā)明的方法，采用日立7180型自動(dòng)分析儀檢測(cè)6種不同含量的丙型肝炎病毒核心抗原參考品，根據(jù)結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線，X軸表示丙型肝炎病毒核心抗原的含量，Y軸表示吸光度差值。
[0082](3)通過(guò)上述的方法對(duì)上述實(shí)施例中制備的7個(gè)試劑盒測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析最優(yōu)粒徑。結(jié)果如下:
[0083]金納米顆粒大小為50.4nm 時(shí)，y = -0.000003x+l.5906，R2 = 0.4855 ；
[0084]金納米顆粒大小為56.2nm 時(shí)，y = -0.00003x+l.6006，R2 = 0.8164 ；
[0085]金納米顆粒大小為62.2nm 時(shí)，y = -0.0005x+l.647，R2 = 0.9709 ；
[0086]金納米顆粒大小為67.2nm 時(shí)，y = -0.0005x+l.6663，R2 = 0.9635 ；
[0087]金納米顆粒大小為72.4nm 時(shí)，y = -0.0005x+l.5893，R2 = 0.9914 ；
[0088]金納米顆粒大小為79.1nm 時(shí)，y = -0.0005x+l.6713，R2 = 0.9453 ；
[0089]金納米顆粒大小為83.5nm 時(shí)，y = -0.0005x+l.1475，R2 = 0.595。
[0090](4)對(duì)上述結(jié)果，進(jìn)行靈敏度、線性相關(guān)系數(shù)、線性范圍和穩(wěn)定性分析。
[0091]靈敏度定義為測(cè)試體系對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)試值的差異，差異越大表明約靈敏，沒(méi)有差異則表明體系過(guò)于穩(wěn)定，不能引起比濁改變。靈敏度可以通過(guò)擬合后的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的絕對(duì)值表征。
[0092]線性相關(guān)系數(shù)即相關(guān)性方程的R值，表明試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果和擬合曲線的重合度，R值越高，表明線性越好。
[0093]線性范圍即測(cè)試對(duì)應(yīng)的結(jié)果中呈線性關(guān)系的區(qū)間，線性范圍寬有利于測(cè)試更大范圍濃度的樣品。
[0094]穩(wěn)定性是指在該體系中膠體金穩(wěn)定存在、不發(fā)生團(tuán)聚或沉淀的程度，一般來(lái)講顆粒越大越容易聚沉，引起濁度的改變，顆粒越小越穩(wěn)定，對(duì)待測(cè)試劑濃度變化不敏感，即靈敏度差。將待測(cè)試劑放置在40°C的環(huán)境中，以穩(wěn)定性時(shí)間的時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)表示穩(wěn)定性的好壞，測(cè)試時(shí)間是12月。
[0095]通過(guò)上述四個(gè)參數(shù)的對(duì)比，我們可以從中選出最適合的粒徑范圍，將各種金顆粒尺寸條件下的結(jié)果匯總于表I。
[0096]表I
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種丙型肝炎病毒核心抗原檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒基于膠體金免疫比濁法，包括試劑R2，所述試劑R2為含有標(biāo)記了丙型肝炎病毒核心抗原抗體的金納米顆粒的溶液，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.lnm,所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比為50:20 - 60。
2.權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為67.2nm-72.4nm。
3.權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒和抗體質(zhì)量比為50:40-60。
4.權(quán)利要求2或3任意一項(xiàng)所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為PH值5.0-9.5的溶液。
5.權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為PH值6.0-8.5的溶液。
6.權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2還含有促凝劑、穩(wěn)定劑、蔗糖和甘油，其中，所述穩(wěn)定劑為蛋白質(zhì)、PEG、糖和可溶性的堿金屬和堿土金屬的無(wú)機(jī)鹽中的一種或多種；所述蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白或明膠；所述糖為單糖、二糖或者多糖；所述無(wú)機(jī)鹽為鹵素堿金屬和堿土金屬的無(wú)機(jī)鹽；試劑R2為是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和HEPES緩沖液中的一種或多種的組合。
7.權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述促凝劑為重量體積比0.4%以內(nèi)的PEG20000,所述穩(wěn)定劑為重量體積比2 %以內(nèi)的牛血清白蛋白，所述蔗糖的重量體積比為20%以下，所述甘油的重量體積比為20%以下。
8.權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為含有粒徑為72.4± 1.5nm且標(biāo)記了丙型肝炎病毒核心抗原抗體的金納米顆粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2%PEG20000、重量體積比0.5% BSA和重量體積比5%甘油，pH7.2的磷酸鹽緩沖液，其中，金納米顆粒和抗體的重量比為50:40-60。
9.權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括試劑R1，所述試劑Rl為含有重量體積比0.2 % BSA、重量體積比0.1 %的NaN3和重量體積比0.05 % Tween20的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液。
10.制備權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述試劑盒的方法，其特征在于，所述方法包括: 制備金納米顆粒； 將抗體偶聯(lián)到金納米顆粒，得偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液； 偶聯(lián)抗體的納米金顆粒溶液中加入穩(wěn)定劑和促凝劑； 2800rpm離心2小時(shí)； 離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5%BSA和重量體積比5%甘油，pH值7.2的磷酸鹽緩沖液重懸，調(diào)整濃度至OD54tol為0.2。
【文檔編號(hào)】G01N33/576GK103995120SQ201410193592
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月8日
【發(fā)明者】侯淑霞, 王萬(wàn)霞 申請(qǐng)人:北京玖佳宜科技有限公司