檢測神經細胞電生理信號的傳感器及制作方法和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測神經細胞電生理信號的傳感器及制作方法和檢測方法。所述傳感器包括基板、培養(yǎng)腔壁、石墨烯膜、源電極、漏電極和參比電極，所述基板與培養(yǎng)腔壁無縫封接圍成培養(yǎng)腔，所述培養(yǎng)腔內的基板上附著有石墨烯膜，所述石墨烯膜經化學修飾能使神經細胞在其上生長，所述源電極和漏電極分別與所述石墨烯膜電連接且分別與所述基板固定連接，所述參比電極置于所述培養(yǎng)腔內。利用本發(fā)明的傳感器檢測神經細胞電生理信號能夠大幅提高信噪比和空間分辨率。
【專利說明】檢測神經細胞電生理信號的傳感器及制作方法和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物儀器工程【技術領域】，具體地，涉及一種檢測神經細胞電生理信號的傳感器及所述傳感器的制造方法，以及使用所述傳感器檢測神經細胞電生理信號的方法。
【背景技術】
[0002]場效應晶體管是一種通過電場效應控制電流的電子元件，具有柵極(gate)、源極(source)和漏極(drain)三個端子，通過施加于柵極的電壓所產生的電場來控制連接源極和漏極的溝道中流通的電流大小。傳統(tǒng)場效應晶體管的溝道由重摻雜的硅構成。
[0003]隨著納米科技的發(fā)展，各種新型低維納米材料，例如硅納米線(SiNW)、碳納米管(CNT)和石墨烯(graphene)等，以其獨特的性質(如表面效應、體積效應和量子尺寸效應等)引起了人們的廣泛關注。與傳統(tǒng)材料相比，納米材料具有更小的尺寸、更高的比表面積、更優(yōu)良的電學性質和更好的生物相容性等。當傳統(tǒng)場效應晶體管的溝道由納米材料來替代，即構成了納米材料場效應晶體管，例如硅納米線場效應晶體管(SiNW-場效應晶體管)、碳納米管場效應晶體管(CNT-場效應晶體管)和石墨烯場效應晶體管(Gra-場效應晶體管)等。
[0004]石墨烯是一種新興的碳納米材料，具有電導率高、機械強度大和電化學穩(wěn)定等優(yōu)異的物理化學性能，使其在高靈敏度檢測領域具有獨特的應用優(yōu)勢，引起了人們極大的關注。石墨烯是單層原子構成的平面二維晶體，每個原子都在表面上，外界環(huán)境的變化都將直接影響構成石墨烯的所有碳原子，使其對界面的響應極其靈敏，同時獨特的結構使其具有出色的檢測靈敏性。目前已開發(fā)的基于石墨烯的高靈敏一氧化氮(NO)氣體檢測芯片，具有單個NO分子的高探測靈敏度，表明石墨烯作為檢測芯片敏感元件具有巨大的潛力。
[0005]神經電學信號的分析是目前神經信息學研究的主要內容之一。現在比較常用的裝置是微電極陣列傳感器(Micro-Electrode Array, MEA)。MEA由嵌在基底物質上的微電極組成。微電極主要由金屬材料，例如鉬、金、鈦氮氧化物和銦錫氧化物等組成。微電極在基底物質上排列成陣列。
[0006]雖然用微電極陣列傳感器可以很好地檢測到神經細胞發(fā)放的電學信號，但得到的噪音水平反比于微電極尺寸的大小，當微電極尺寸減小到一定尺寸的時候，其噪音的水平將大大超過其信號的大小，從而分辨不出真實的信號。因此用此方法來檢測神經細胞的空間分辨率并不高。

【發(fā)明內容】

[0007]為進一步提高檢測神經細胞的空間分辨率和信噪比，本發(fā)明提供一種檢測神經細胞電生理信號的傳感器及所述傳感器的制造方法，以及使用所述傳感器檢測神經細胞電生理信號的方法。
[0008]本發(fā)明的發(fā)明人將石墨烯制成石墨烯場效應晶體管的石墨烯傳感元件，一方面利用石墨烯的高靈敏度來提高信號的大小，另外一方面場效應晶體管并不受限于接觸電阻，檢測單元可以做的更小，因此可以利用本發(fā)明的傳感器進一步提高檢測神經細胞的信噪比和空間分辨率。
[0009]為實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一下技術方案:
[0010]在第一方面,本發(fā)明提供一種檢測神經細胞電生理信號的傳感器，包括基板、培養(yǎng)腔壁、石墨烯膜、源電極、漏電極和參比電極，所述基板與培養(yǎng)腔壁無縫封接圍成培養(yǎng)腔，所述培養(yǎng)腔內的基板上附著有石墨烯膜，所述石墨烯膜經化學修飾能使神經細胞在其上生長，所述源電極和漏電極分別與所述石墨烯膜電連接且分別與所述基板固定連接，所述參比電極置于所述培養(yǎng)腔內。
[0011]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述化學修飾為多聚賴氨酸和/或層粘連蛋白修飾。
[0012]優(yōu)選地，所述化學修飾為多聚賴氨酸和/或層粘連蛋白的非共價鍵修飾。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述基板包括硅片基層和二氧化硅面層，所述石墨烯膜附著在所述二氧化硅面層上。
[0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述石墨烯膜的石墨烯層數為一至二層。
[0015]優(yōu)選地，所述石墨烯膜的面積為1-200 μ m2,例如2 μ m2、5 μ m2、8 μ m2、10 μ m2、15ym2、20ym2、30ym2、50ym2、80ym2、100ym2、120ym2、140ym2、150ym2、175ym2、185 μ m2、190 μ m2、195 μ m2，優(yōu)選為 10-100 μ m2，更優(yōu)選為 20-30 μ m2。
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述源電極與漏電極之間的距離為500-5000nm，600nm、800nm、lOOOnm、1200nm、1500nm、2000nm、2500nm、2800nm、3200nm、3500nm、4000nm、4200nm、4500nm、4800nm，優(yōu)選為 750_4000nm，更優(yōu)選為 1000_3000nm。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述源電極和漏電極各自獨立地為金屬電極。
[0018]優(yōu)選地，所述金屬電極的材料為鉬、金和/或鉻，可以是一種金屬材料，也可以是兩種以上材料的合金。
[0019]優(yōu)選地，所述金屬電極的厚度為0.03-0.15 μ m，例如0.04μπι、0.05μπι、0.06 μ m、
0.08 μ m、0.10 μ m、0.11 μ m、0.12 μ m、0.13 μ m、0.14 μ m、0.15 μ m。
[0020]優(yōu)選地，所述參比電極為Ag/AgCl電極。
[0021]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述培養(yǎng)腔壁的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0022]在第二方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的檢測神經細胞電生理信號的傳感器的制造方法，包括以下步驟:
[0023]( I)在基板上附著上石墨稀月旲；
[0024](2)在附著了石墨烯膜的基板上形成源電極和漏電極，所述源電極和漏電極分別與所述石墨烯膜電連接且分別與所述基板固定連接；
[0025](3)將所述附著了石墨烯膜并形成了源電極和漏電極的基板與培養(yǎng)腔壁無縫封接圍成培養(yǎng)腔，使得所述石墨烯膜、源電極和漏電極均位于所述培養(yǎng)腔內；
[0026](4)對所述石墨烯膜進行化學修飾，以使神經細胞在其上生長。
[0027]在第三方面，本發(fā)明提供一種檢測神經細胞電生理信號的方法，包括以下步驟:
[0028](I)在如第一方面所述的檢測神經細胞電生理信號的傳感器的培養(yǎng)腔內培養(yǎng)神經細胞，使神經細胞與石墨烯膜緊密接觸；
[0029](2)在所述源電極和漏電極之間施加恒定的通道電壓，當神經細胞的膜電位發(fā)生變化時，流過所述石墨烯膜的電流產生變化，通過檢測所述石墨烯膜上電流的變化來測量神經細胞的膜電位變化。
[0030]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述源電極和漏電極之間施加的通道電壓為10_70mV，例如 12mV、15mV、18mV、22mV、25mV、30mV、40mV、50mV、55mV、58mV、60mV、65mV、68mV，優(yōu)選為30-60mV。
[0031]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明利用石墨烯制成石墨烯場效應晶體管的石墨烯傳感元件，由于石墨烯具有高靈敏度，利用本發(fā)明的傳感器檢測神經細胞電生理信號的信噪比和空間分辨率大幅提高。實驗證實，利用本發(fā)明的傳感器檢測神經細胞電生理信號的信噪比在5倍以上，相比現有技術的微電極陣列傳感器有很大的提高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構成對本發(fā)明的限制。附圖中:
[0033]圖1為本發(fā)明在基板上附著石墨烯膜的工藝流程圖。
[0034]圖2為本發(fā)明在基板上形成源電極和漏電極的工藝流程圖。
[0035]圖3為本發(fā)明的附著了石墨烯膜的基板的橫切面示意圖。
[0036]圖4為本發(fā)明的用光刻膠掩蔽了的基板的橫切面不意圖。
[0037]圖5為本發(fā)明的曝光并顯影后的基板的橫切面示意圖，顯示了形成電極的區(qū)域。
[0038]圖6為本發(fā)明的形成了源電極和漏電極的基板的橫切面示意圖。
[0039]圖7為本發(fā)明的形成了源電極和漏電極并去除了光刻膠的基板的橫切面示意圖。
[0040]圖8為本發(fā)明的設置了培養(yǎng)腔并在培養(yǎng)腔中注入了液體的傳感器的橫切面示意圖。
[0041]圖9為本發(fā)明的傳感器的俯視示意圖，不包括參比電極。
[0042]圖10為本發(fā)明的傳感元件的光學顯微鏡照片。
[0043]圖11為本發(fā)明的傳感器的橫切面示意圖，包括參比電極Ag/AgCl。
[0044]圖12為本發(fā)明的傳感元件中的電流隨著參比電極電壓Vgate的變化圖。
[0045]圖13為本發(fā)明的傳感元件中的電流隨著液體樣本的pH值不同而改變的關系結果圖。
[0046]圖14為本發(fā)明的傳感元件與被測量神經細胞的細胞膜形成緊密接觸的示意圖。
[0047]圖15為用本發(fā)明的傳感元件檢測到的小鼠的海馬區(qū)神經細胞動作電位的結果圖。
[0048]附圖標記說明:
[0049]1-石墨烯膜
[0050]2-基板的面層
[0051]3-基板的基層
[0052]4-光刻膠
[0053]5-形成源電極的區(qū)域
[0054]6-形成漏電極的區(qū)域
[0055]7-源電極
[0056]8-漏電極[0057]9-培養(yǎng)腔壁【具體實施方式】
[0058]下面對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0059]本發(fā)明的傳感器包括芯片單元和培養(yǎng)腔壁。其中，芯片單元包括傳感元件和參比電極。所述傳感元件包括基板以及固定于所述基板上的源電極和漏電極，且源電極和漏電極之間電連接有石墨烯膜。
[0060]其中，所述傳感元件可以作為場效應管化學生物傳感器的元件。
[0061]優(yōu)先情況下，所述傳感元件通過如下步驟的方法制得:(1)在基板上附著石墨烯膜；(2)在附著了石墨烯膜的基板上形成電極，所述電極包括源電極和漏電極，且在源電極和石墨烯膜之間以及在漏電極和石墨烯膜之間形成接觸電連接。
[0062]其中，所述石墨烯膜可以為常規(guī)使用的石墨烯膜，例如通過機械剝離的方法得到的石墨烯膜，也可以用化學氣相沉積法生長的石墨烯膜。
[0063]其中，在基板上附著石墨烯膜的操作可以通過將石墨烯膜在基板上按壓的方式實現。
[0064]其中，可以基于干涉效應在光學顯微鏡下對基板上的石墨烯膜進行定位并標記其邊界，還可以利用拉曼光譜和原子力顯微鏡對其層數進行進一步鑒定。
[0065]根據本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)選情況下，步驟(I)中，基板包括基層和附著在基層上的面層，且將石墨烯膜附著在基板的面層上；基層為硅片，面層為二氧化硅層。在該優(yōu)選情況下，基板可以直接通過將硅片進行氧化的方式制備，還易于進行基于干涉效應在光學顯微鏡下對基板上的石墨烯膜進行定位并標記其邊界。
[0066]根據本發(fā)明的方法，其中，優(yōu)先情況下，在步驟(2)中，具體是在基板上形成源電極的區(qū)域形成源電極，所述形成源電極的區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；在基板上形成漏電極的區(qū)域形成漏電極，所述形成漏電極的區(qū)域包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域；所述源電極和漏電極之間的距離為500-5000nm，優(yōu)選為750_4000nm，更優(yōu)選為1000_3000nm。其中，源電極和漏電極之間的距離是指相鄰的源電極和漏電極之間最接近的兩點之間的距離。
[0067]其中，優(yōu)選情況下，在基板上形成源電極的區(qū)域或形成漏電極的區(qū)域中，被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域的面積比為0.2-3:1，優(yōu)選為0.5-1.5:1，更優(yōu)選為 0.8-1.2:1。
[0068]其中，在基板上，被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域可以通過光學顯微鏡觀察來確定其邊界并定位。在石墨烯膜覆蓋的區(qū)域的邊界處可以選擇包括被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域作為在基板上形成源電極的區(qū)域或形成漏電極的區(qū)域。選定在基板上形成源(或漏)電極的區(qū)域后，可以通過常規(guī)的電子束曝光的方式暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域，然后通過熱蒸鍍或電子束蒸鍍來形成源(或漏)電極。還可以在形成電極后用有機溶劑去除掩蔽物。其中，源電極和漏電極可以為場效應化學生物傳感器領域中常規(guī)使用的電極，例如可以為通過熱蒸鍍或電子束蒸鍍得到的金屬電極，金屬電極的材料可以為鉬、金和鉻中的至少一種，電極的厚度可以為0.03 μ m-0.15 μ m。源電極和漏電極分別與基板之間設置有用于固定的連接。例如通過熱蒸鍍或電子束蒸鍍得到的金屬電極，由于形成電極的區(qū)域包括了被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域，一方面被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與石墨烯膜之間的電連接，另一方面未被石墨烯膜覆蓋的區(qū)域形成了電極與基板之間用于固定的連接。
[0069]根據本發(fā)明的方法，其中芯片單元和培養(yǎng)腔壁之間實現無縫封接。一種優(yōu)選的實施方式可以是:首先將聚二甲基硅氧烷(PDMS)與SYLGARD184有機硅彈體按照質量比10:1的比例混合均勻，倒入IOcm2的培養(yǎng)皿中，使得PDMS和培養(yǎng)皿的上表面齊平，然后在60°C固化4-5個小時；然后把固化好的PDMS從培養(yǎng)皿中取出，在其中間切一個邊長為1.5X1.5cm、深度為Icm的培養(yǎng)腔。接著把培養(yǎng)腔用氧等離子體進行處理，處理參數為功率10-200W，氧氣流量為10-150SCCm，時間為10_120s。然后把處理后的培養(yǎng)腔后固定在基板上，保證傳感器單元(源電極、漏電極和石墨烯膜)在培養(yǎng)腔內，四周再用PDMS進行無縫封接。
[0070]根據本發(fā)明的方法，把加工好的傳感器芯片用去離子水清除殘留有害物質，接著把傳感器芯片浸泡在濃度為75%的乙醇中進行滅菌，時間為2-10h，優(yōu)選為3h。
[0071]根據本發(fā)明的方法，為了實現神經細胞在石墨烯膜上生長，需要對石墨烯膜進行相應的修飾。典型但非限定性的修飾的實例比如:用多聚賴氨酸或層粘連蛋白中的至少一種對石墨烯膜表面進行非共價鍵修飾，其中，多聚賴氨酸修飾的工藝參數為:多聚賴氨酸濃度為lmg/ml-20mg/ml，反應時間為1-2小時，修飾溫度為37°C，pH值為?.4 ;層粘連蛋白的修飾參數為:層粘連蛋白濃度為lmg/ml-10mg/ml，修飾時間為1-2小時，修飾溫度為37°C，pH值為7.4。修飾工藝完畢后，采用滅菌的磷酸鹽(PBS)緩沖液沖洗。
[0072]本發(fā)明提供的檢測神經細胞電生理信號的方法，包括以下步驟:
[0073](I)在本發(fā)明所述的檢測神經細胞電生理信號的傳感器的培養(yǎng)腔內培養(yǎng)神經細胞，使神經細胞與石墨烯膜緊密接觸；
[0074](2)在所述源電極和漏電極之間施加恒定的通道電壓，當神經細胞的膜電位發(fā)生變化時，流過所述石墨烯膜的電流產生變化，通過檢測所述石墨烯膜上電流的變化來測量神經細胞的膜電位變化。
[0075]根據本發(fā)明的方法，其中，分離和培養(yǎng)海馬區(qū)的神經細胞?？梢詤⒄瘴墨IStefanieK, Gary B.Culturing hippocampal neurons.Nature protocol, 2006，1，2406-2415 中的方法進行。分離和培養(yǎng)其它神經細胞可以按照本領域公知的技術手段進行。所述動物可以為常規(guī)的實驗動物，如兩棲動物、鳥類或哺乳動物，包括但不限于蟾蜍、雞、小鼠、大鼠、犬、兔和猴。
[0076]根據本發(fā)明的方法，其中，源電極和漏電極之間的電壓可以為10_70mV，優(yōu)選為30-60mV。
[0077]下面將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，掃描電子顯微鏡購自日本日立公司型號S-4800，電學性質的測試儀為購自美國AXON公司型號Axopatch200B電學測試系統(tǒng)，所用試劑均為商購的分析純試劑。
[0078]制備實施例1
[0079]參考圖1-11，本實施例用來說明根據本發(fā)明的方法中制備傳感元件的步驟，即制備懸浮石墨烯場效應器件的步驟。[0080](I)參考圖 1，按照文獻 Li X Sj Cai W W，An J H，et al.Large-areasynthesisof high-quality and uniform graphene films on copper foils.Science, 2009, 324:1312 - 1314中的方法通過化學氣相沉淀的方法在銅基底(大小為4cmX8cm,厚度為100 μ m)上生長石墨稀。在有石墨稀的銅片上旋涂一層300nm厚的光刻膠(PMMA950K，購自德國ALLRESIST公司)，120°C下烘烤使溶劑完全揮發(fā)；將旋涂有光刻膠的銅片放入銅刻蝕液(含lmol/L三氯化鐵和lmol/L鹽酸的溶液)中刻蝕至銅反應完全；得到附著在光刻膠上的石墨烯膜。
[0081](2)參考圖1-3，將具有280nm厚熱氧化Si02的硅片(大小為3cmX3cm，厚度為0.52cm,購自美國sillicon Valley Microelectrics)作為基板，即基層3為娃片，面層2為二氧化硅層的基板。將附著在光刻膠上的石墨烯膜轉移到基板上，并按壓使石墨烯膜與基板緊密接觸；然后通過光刻膠溶解液(丙酮)將石墨烯膜表面的光刻膠溶解掉，保留石墨烯膜在基板上，得到附著有石墨烯膜I的基板(圖3)?；诟缮嫘诠鈱W顯微鏡下予以定位并標記邊界，以用于確定形成電極的區(qū)域。
[0082](3)參考圖4和圖5，在附著有石墨烯膜I的基板上形成源電極和漏電極。具體地，在附著有石墨烯膜I的基板表面旋凃一層300nm厚的光刻膠(PMMA950K，購自德國ALLRESIST公司)，180°C下烘烤至溶劑揮發(fā)完全。根據光學顯微鏡下標記的石墨烯膜I的邊界，確定形成源電極的區(qū)域5和形成漏電極的區(qū)域6，形成源(或漏)電極(寬度為2 μ m的條形電極)的區(qū)域中被石墨烯膜I覆蓋的區(qū)域和未被石墨烯膜I覆蓋的區(qū)域的面積比為1:1，用電子束曝光機對形成源(或漏)電極的區(qū)域進行曝光，在顯影液(4-甲基-2-戊酮和異丙醇按1:5的體積比混合的混合液)中顯影IOmin,異丙醇中定影IOmin后,用氮氣吹干；由此暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域。
[0083](4)參考圖6，在高真空條件下，按照文獻(《薄膜制備技術基礎》，麻蒔立男(日本)著，陳國榮譯，化學工業(yè)出版社，2009)中的方法，利用電子束蒸鍍機在樣品(即暴露形成電極的基板區(qū)域而掩蔽不形成電極的基板區(qū)域的基板)上依次蒸鍍5nm厚的Cr和50nm厚Au,獲得電極，分別作為源電極7和漏電極8待用。
[0084](5)參考圖7，去除蒸鍍好電極的樣品上的光刻膠，被石墨烯膜I覆蓋的區(qū)域形成了電極與石墨烯膜I之間的電連接，未被石墨烯膜I覆蓋的區(qū)域形成了電極與基板之間用于固定的連接，源電極7和漏電極8之間的距離為2000nm。
[0085](6)參考圖8和圖9，在形成了電極的基板上，以設置有石墨烯膜I和電極的基板面為底面，用PDMS圍成側壁(培養(yǎng)腔壁9)以形成培養(yǎng)腔(邊長為1.5X1.5cm，深度為1cm)，以使當該培養(yǎng)腔封存液體時，石墨烯膜I完全浸泡于液體中。
[0086]結構基本上如圖10所示的元件即為本實施例制備的傳感元件。利用光學顯微鏡觀察其微觀結構，如圖10所示:中間連接的為石墨烯(Graphene)，四根連接線為源(或漏)電極，材料為鉻金(Cr/Au)。
[0087]測試實施例1
[0088]本實施例用來說明傳感元件的電學性能。
[0089]參考圖11，使用制備實施例1制備的傳感元件，將石墨烯膜兩端的兩個Cr/Au電極分別作為源電極和漏電極，Ag/AgCl電極作為參比電極(即溶液柵電極(Vgate))，從而組裝成為傳感器。[0090]將漏電極接地，在源電極上加固定的電壓Vsd (0.01-0.1V)，測量源電極和漏電極之間的電流Isd隨柵電極電壓Vgate的變化關系，以表征石墨烯膜的電子輸運性質。圖12所示的Isd-Vgate曲線的空穴支和電子支明顯不對稱，狄拉克點(最低點)相對本征的石墨烯在Vgate軸上出現了平移，表明石墨烯受到其貼覆的Si/Si02基底的摻雜影響。
[0091]測試實施例2
[0092]本實施例用來說明傳感元件的電學性能和在測量溶液中化學物質的變化中的應用。
[0093]參考圖11，使用制備實施例1制備的傳感元件，將石墨烯膜兩端的兩個Cr/Au電極分別作為源電極和漏電極，Ag/AgCl電極作為參比電極(即溶液柵電極(Vgate))，從而組裝成為傳感器。
[0094]通過溶液中的參比電極Ag/AgCl施加電壓，同時在源電極和漏電極(Cr/Au電極)之間施加恒定的通道電壓。向儲液池(即培養(yǎng)腔)中加入樣本溶液，樣本溶液中帶電離子濃度及種類的變化會改變石墨烯表面的電荷濃度，從而改變石墨烯場效應管的電流。通過檢測石墨烯電流的變化，可以檢測到溶液中化學物質的變化。
[0095]基于上述檢測原理，將石墨烯場效應器件用于檢測溶液pH的變化。向培養(yǎng)腔中依此加入不同pH值(pH分別為6、7、8和9)的pH值校準液(購自美國Sigma公司)，由于不同PH值的待測樣本溶液中帶電離子濃度及種類的變化會改變石墨烯膜表面的電荷濃度，進而改變石墨烯場效應管的電流。如圖13所示，檢測到石墨烯場效應管的電導值發(fā)生相應的變化，反應極為迅速且靈敏，不同PH值間變化呈階梯狀。
[0096]實施例1
[0097]通過在石墨烯膜兩端的源電極和漏電極之間施加恒定的通道電壓，在此電壓下石墨烯納米帶中產生一個恒定的電流。細胞或組織與器件中石墨烯膜形成緊密接觸(如圖14所示)，當細胞的膜電位發(fā)生變化時，這個微小的電壓對通過源電極和漏電極施加在石墨烯膜上的電勢產生影響，進而使流過石墨烯膜的電流產生相應的變化，通過檢測這一電流變化進而實現對細胞膜上的動作電位變化的測量。
[0098]基于上述檢測原理，將石墨烯場效應器件(即實施例1的傳感元件)用于檢測神經細胞膜電位的變化。參照文獻Stefanie K, Gary B.Culturing hippocampalneurons.Natureprotocol, 2006, I, 2406-2415中的方法，將消化好的小鼠海馬區(qū)神經細胞置于石墨烯場效應器件的培養(yǎng)腔中(培養(yǎng)腔中有細胞培養(yǎng)液DMEM)。經過2周的培養(yǎng)，神經細胞經過分化后與石墨烯膜形成接觸，如圖14所示。與石墨烯膜接觸的神經細胞可以自發(fā)產生電信號，石墨烯場效應管能夠記錄到對應的神經細胞的動作電位，所檢測到的電勢在ImV左右，信噪比在5倍以上，如圖15所示，相比于微電極陣列傳感器所測到的信噪比有很大的提高。
[0099]以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0100]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0101]此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內容。
【權利要求】
1.一種檢測神經細胞電生理信號的傳感器，包括基板、培養(yǎng)腔壁、石墨烯膜、源電極、漏電極和參比電極，所述基板與培養(yǎng)腔壁無縫封接圍成培養(yǎng)腔，所述培養(yǎng)腔內的基板上附著有石墨烯膜，所述石墨烯膜經化學修飾能使神經細胞在其上生長，所述源電極和漏電極分別與所述石墨烯膜電連接且分別與所述基板固定連接，所述參比電極置于所述培養(yǎng)腔內。
2.根據權利要求1所述的傳感器，其特征在于，所述化學修飾為多聚賴氨酸和/或層粘連蛋白修飾； 優(yōu)選地，所述化學修飾為多聚賴氨酸和/或層粘連蛋白的非共價鍵修飾。
3.根據權利要求1或2所述的傳感器，其特征在于，所述基板包括硅片基層和二氧化硅面層，所述石墨烯膜附著在所述二氧化硅面層上。
4.根據權利要求1-3任一項所述的傳感器，其特征在于，所述石墨烯膜的石墨烯層數為一至二層； 優(yōu)選地，所述石墨烯膜的面積為1-200 μ m2,優(yōu)選為10-100 μ m2,更優(yōu)選為20-30 μ m2。
5.根據權利要求1-4任一項所述的傳感器，其特征在于，所述源電極與漏電極之間的距離為 500-5000nm，優(yōu)選為 750-4000nm，更優(yōu)選為 1000-3000nm。
6.根據權利要求1-5任一項所述的傳感器，其特征在于，所述源電極和漏電極各自獨立地為金屬電極； 優(yōu)選地，所述金屬電極的材料為鉬、金和/或鉻； 優(yōu)選地，所述金屬電極的厚度為0.03-0.15 μ m ; 優(yōu)選地，所述參比電極為Ag/AgCl電極。
7.根據權利要求1-6任一項所述的傳感器，其特征在于，所述培養(yǎng)腔壁的材料為聚二甲基硅氧烷。
8.—種權利要求1-7任一項所述的檢測神經細胞電生理信號的傳感器的制造方法，包括以下步驟: (1)在基板上附著上石墨烯膜； (2)在附著了石墨烯膜的基板上形成源電極和漏電極，所述源電極和漏電極分別與所述石墨烯膜電連接且分別與所述基板固定連接； (3)將所述附著了石墨烯膜并形成了源電極和漏電極的基板與培養(yǎng)腔壁無縫封接圍成培養(yǎng)腔，使得所述石墨烯膜、源電極和漏電極均位于所述培養(yǎng)腔內； (4)對所述石墨烯膜進行化學修飾，以使神經細胞在其上生長。
9.一種檢測神經細胞電生理信號的方法，包括以下步驟: (1)在如權利要求1-7任一項所述的檢測神經細胞電生理信號的傳感器的培養(yǎng)腔內培養(yǎng)神經細胞，使神經細胞與石墨烯膜緊密接觸； (2)在所述源電極和漏電極之間施加恒定的通道電壓，當神經細胞的膜電位發(fā)生變化時，流過所述石墨烯膜的電流產生變化，通過檢測所述石墨烯膜上電流的變化來測量神經細胞的膜電位變化。
10.根據權利要求9所述的檢測神經細胞電生理信號的方法，其特征在于，所述源電極和漏電極之間施加的通道電壓為10-70mV，優(yōu)選為30-60mV。
【文檔編號】G01N27/403GK103901089SQ201410152771
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權日:2014年4月16日
【發(fā)明者】周俏羽, 方英 申請人:國家納米科學中心