一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應(yīng)用。所述微腔陣列質(zhì)譜靶板包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導(dǎo)電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導(dǎo)電層的一側(cè)設(shè)有與表面等離子體共振成像檢測(cè)區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開(kāi)口于所述導(dǎo)電層并排列成陣列。本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板可篩選和富集“一珠一物”多肽文庫(kù)中的陽(yáng)性靶標(biāo)，并將其直接進(jìn)行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進(jìn)行原位親和力鑒定，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽文庫(kù)的高效、高通量篩選和檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微陣列芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和在組合化學(xué)多肽文庫(kù)的篩選中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip)已發(fā)展成為當(dāng)今世界上最前沿的科技領(lǐng)域之一(Sens.Actutors, B, 1990, I, 244-248.)。微芯片技術(shù)是把化學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域所涉及的前處理、加樣、反應(yīng)、分離、分析等基本操作單元集成或基本集成到方寸大小的芯片之上，以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室各種功能的技術(shù)平臺(tái)。
[0003]組合化合物庫(kù)的合成方法有液相組合合成和固相組合合成兩種。由于固相合成所得產(chǎn)物較易純化，可使用過(guò)量反應(yīng)試劑，較易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，成為最為廣泛的多肽文庫(kù)構(gòu)建方法。在固相合成過(guò)程中，通過(guò)對(duì)樹(shù)脂微珠的多次混合與均分，使每個(gè)樹(shù)脂微珠上帶有唯一一種隨機(jī)多肽序列，稱(chēng)之為“一珠一物”肽庫(kù)。如Lam等在Nature上首先報(bào)道了以聚苯乙烯樹(shù)脂珠為載體合成的“一珠一物”五肽庫(kù)，將受體蛋白偶聯(lián)至熒光素上，放入多肽固相化合物庫(kù)中，通過(guò)可結(jié)合受體蛋白的多肽微珠顏色變化尋找親和多肽序列。在傳統(tǒng)方法中，需要將篩選后的數(shù)百萬(wàn)個(gè)樹(shù)脂微珠置于顯微鏡下，用微鑷將產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的陽(yáng)性微珠挑出，并逐個(gè)分配至相應(yīng)的裂解容器中進(jìn)行測(cè)序和鑒定。整個(gè)過(guò)程都需要人工完成，十分耗時(shí)費(fèi)力。
[0004]常見(jiàn)的生物芯片是指一種不含微通道，沒(méi)有流體流動(dòng)，以生物分子間靜態(tài)雜交和高密度點(diǎn)陣為特征的芯片。這種芯片先于微流控芯片問(wèn)世，專(zhuān)一地應(yīng)用于某些生物領(lǐng)域。狹義上的生物芯片即指微點(diǎn)陣芯片。微點(diǎn)陣生物芯片往往在一層基片上加工出一系列面積非常小的活性區(qū)域，生物分子可以固定于表面。利用固定的生物分子與樣品中被分析物的特異性結(jié)合可對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。微點(diǎn)陣芯片往往集成了若干相同的操作單元，其最顯著的特征是高通量，可以利用微點(diǎn)陣芯片的這一特點(diǎn)進(jìn)行高通量多肽篩選與檢測(cè)。
[0005]微點(diǎn)陣芯片體系對(duì)于高通量肽庫(kù)篩選具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。然而，這些微點(diǎn)陣芯片平臺(tái)仍然存在不足，主要表現(xiàn)在:基于微點(diǎn)陣芯片肽庫(kù)篩選的通量一般不超過(guò)104，篩選容量有限；微點(diǎn)陣肽庫(kù)制備和篩選過(guò)程需要電敏、光敏等特殊的試劑和極為復(fù)雜的軟件、硬件平臺(tái)，造價(jià)昂貴。而目前的微流控芯片只能將高通量肽庫(kù)篩選本身在線(xiàn)完成，而更為重要的測(cè)序和鑒定則要離線(xiàn)完成，篩選效率偏低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種微腔陣列質(zhì)譜靶板及其制作方法和在組合化學(xué)多肽文庫(kù)的篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板可篩選和富集“一珠一物”多肽文庫(kù)中的陽(yáng)性靶標(biāo)，并將其直接進(jìn)行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進(jìn)行原位親和力鑒定，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽文庫(kù)的高效、高通量篩選和檢測(cè)。
[0007]在第一方面，本發(fā)明提供一種微腔陣列質(zhì)譜靶板，包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導(dǎo)電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導(dǎo)電層的一側(cè)設(shè)有與表面等離子體共振成像檢測(cè)區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開(kāi)口于所述導(dǎo)電層并排列成陣列。
[0008]本發(fā)明中，所述微腔的形狀可以人為設(shè)計(jì)，例如可以設(shè)計(jì)成半球形、圓柱體形、正方體形或棱臺(tái)形，所述棱臺(tái)形如正四棱臺(tái)形或正六棱臺(tái)形，優(yōu)選為正方體形或棱臺(tái)形。
[0009]本發(fā)明中，作為正方體形或棱臺(tái)形的微腔的邊長(zhǎng)寬度優(yōu)選為30?300微米，例如40微米、50微米、80微米、120微米、150微米、180微米、250微米、280微米或290微米；深度優(yōu)選為30?300微米，例如40微米、50微米、80微米、120微米、150微米、180微米、250微米、280微米或290微米。
[0010]本發(fā)明中，每個(gè)微腔僅能容納一個(gè)多肽微珠；其中，所述多肽微珠的粒徑優(yōu)選為100?300微米，例如110微米、120微米、150微米、180微米、200微米、230微米、250微米或270微米，更優(yōu)選為120?250微米，特別優(yōu)選為150?180微米。
[0011]本發(fā)明中，所述微腔區(qū)域的微腔個(gè)數(shù)優(yōu)選為4?900個(gè)，例如4個(gè)、9個(gè)、16個(gè)、25個(gè)、36個(gè)、64個(gè)、144個(gè)、225個(gè)、400個(gè)、625個(gè)或784個(gè)。優(yōu)選地，所述微腔排列成正方形陣列。
[0012]本發(fā)明中，所述微腔區(qū)域的面積優(yōu)選為0.5?4cm2,例如0.54cm2>0.58cm2、
0.62cm2、0.78cm2、0.82cm2、0.90cm2、1.20cm2、1.50cm2、1.80cm2、1.96cm2、2.04cm2、2.58cm2、2.82cm2、3.32cm2 >3.64cm2 >3.78cm2 或 3.98cm2。
[0013]本發(fā)明中，所述基片的材料優(yōu)選為硅。優(yōu)選地，所述基片的厚度為200微米?I毫米，例如210微米、240微米、270微米、330微米、350微米、500微米、700微米、820微米、880微米、920微米或970微米。
[0014]本發(fā)明中，所述粘附層的材料優(yōu)選為鈦。優(yōu)選地，所述粘附層的厚度為10?100納米，例如12納米、15納米、17納米、22納米、24納米、28納米、40納米、70納米、88納米、92納米、95納米或98納米。
[0015]本發(fā)明中，所述導(dǎo)電層的材料優(yōu)選為金、銀或鉬，更優(yōu)選為銀。優(yōu)選地，所述導(dǎo)電層的厚度為100?500納米，例如120納米、130納米、150納米、170納米、210納米、250納米、280納米、320納米、380納米、410納米、450納米、470納米、480納米或498納米。
[0016]在第二方面，本發(fā)明提供一種制作第一方面所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板的方法，所述方法采用目前比較成熟的光刻技術(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)第一方面對(duì)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板特征的描述，設(shè)計(jì)出待制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板的規(guī)格和尺寸，然后用光刻技術(shù)實(shí)現(xiàn)其制作。
[0017]具體地，所述方法可以包括如下步驟:
[0018](I)打印預(yù)先設(shè)計(jì)的微腔陣列圖，形成掩膜；
[0019](2)利用光刻膠將所述掩膜轉(zhuǎn)移到基片上；
[0020](3)通過(guò)曝光、顯影和去膠得到微腔陣列圖；
[0021](4)蝕刻所述基片，并去除剩余的光刻膠和氧化層，得到微腔陣列；
[0022](5)分別濺射粘附層和導(dǎo)電層；
[0023](6)按照預(yù)先設(shè)計(jì)的規(guī)格劃片得到所述微腔陣列質(zhì)譜靶板。
[0024]在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了一種以硅片為基片的微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作方法，包括如下步驟:
[0025](I)掩膜設(shè)計(jì):繪制芯片設(shè)計(jì)圖(可以利用L-edit或Adobe illustrator等軟件繪制)，用激光排照機(jī)打印掩膜(其具有高分辨率);
[0026](2)甩膠:將硅片置于甩膠機(jī)上，在硅片中央滴加光刻膠(適量)，將甩膠機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)為600?2000r/min進(jìn)行旋涂，旋涂時(shí)間為10?80s ；
[0027](3)前烘:在加熱平臺(tái)上以5?10°C /min的速率由室溫升至75?105°C，在最高溫度保持5?15min，之后緩慢降至室溫；
[0028](4)曝光:紫外曝光，時(shí)間為10?30s ；
[0029](5)后烘:在加熱平臺(tái)上以5?10°C /min的速率由室溫升至75?105°C，在最高溫度保持5?15min，之后緩慢降至室溫；
[0030](6)顯影:將硅片在顯影液(廠家配套)中浸泡10?50s并輕輕搖晃，使照到光的部分溶解；
[0031](7)堅(jiān)膜:在100?120°C，硬烤堅(jiān)膜20?40min，使光刻膠能堅(jiān)固的依附在硅片
表面；
[0032](8)去底膠:在刻蝕之前用氧等離子體轟擊硅片表面3?5min，以去除在顯影過(guò)程中被顯影液洗掉的區(qū)域殘留的一層底膠；
[0033](9)干法刻蝕:采用Bosch工藝進(jìn)行刻蝕(Plasmalab Systeml00ICP180),參數(shù)設(shè)置:沉積/刻蝕時(shí)間:7_9s ;氣體壓強(qiáng):30-40mT ;上電極射頻功率:700-750w ;下電極射頻功率:5-15w ;載片臺(tái)溫度:30-45°C ;沉積氣體=C4F8 ;刻蝕氣體=SF6 ；
[0034](10)去膠:把硅片放入發(fā)煙硝酸中，超聲清洗20?30min，去除剩余的光刻膠；
[0035](11)去除氧化層:在濺射金屬之前，用氬等離子體轟擊硅片表面(功率:800w，時(shí)間:3min)，去除表面氧化層，以提高金屬與硅片的粘附性；
[0036](12)濺射:將硅片放入金屬濺射儀，抽真空，分別濺射鈦?zhàn)鳛檎掣綄右约盀R射金、銀或鉬等作為導(dǎo)電層；
[0037](13)劃片:將硅片放入劃片機(jī)中，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的規(guī)格將整片硅片劃成相應(yīng)規(guī)格，以適合質(zhì)譜儀靶托。
[0038]需要說(shuō)明的是，上述具體實(shí)施方案只是一種優(yōu)選實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)其具有的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和具體需要，調(diào)整相應(yīng)的步驟、工藝和參數(shù)。
[0039]在第三方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板在組合化學(xué)多肽文庫(kù)的篩選中的應(yīng)用。
[0040]本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板的一個(gè)具體應(yīng)用情形如下:通過(guò)“混合裂分”合成組合化學(xué)多肽文庫(kù)，庫(kù)容量可為IO3?106，選用Fmoc合成策略使得只有在堿性溶液六氫吡啶條件下才能將氨基保護(hù)基脫除，從而進(jìn)行固相多肽合成循環(huán)，C-端首位偶聯(lián)甲硫氨酸可以使得使多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)脫除(使用三氟乙酸)的同時(shí)而不與固相載體裂解，用于肽珠富集和篩選，在N-端偶聯(lián)半胱氨酸；而使用特異性識(shí)別甲硫氨酸的試劑溴化氰(CNBr)則可將多肽從微珠上裂解成為游離肽，從而進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定；選取目標(biāo)蛋白，利用生物素標(biāo)記試劑使得目標(biāo)蛋白具有生物素信號(hào)；選取磁性微珠，粒徑在0.1?5微米之間,在磁性微珠表面標(biāo)記親和素或鏈霉親和素；將多肽微珠、目標(biāo)蛋白與磁性微珠進(jìn)行相互作用，通過(guò)親和素或鏈霉親和素與生物素之間的特異性高親和相互作用，陽(yáng)性多肽微珠被上述磁性微珠包裹而具有磁性可被磁場(chǎng)富集；被富集后的陽(yáng)性多肽微珠懸浮于溶液中，逐滴加入至所述微腔陣列芯片中；通過(guò)輕刮使得陽(yáng)性肽珠進(jìn)入所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的微腔之中，保證每個(gè)微腔只能容納一個(gè)陽(yáng)性多肽微珠；在上述微腔陣列質(zhì)譜靶板原位加入多肽裂解液(或通過(guò)紫外光裂解)；將上述微腔陣列質(zhì)譜靶板導(dǎo)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)；將上述微腔陣列質(zhì)譜靶板與表面等離子體共振成像金片面對(duì)面貼合，使得一部分多肽轉(zhuǎn)移至表面等離子體共振成像金片上來(lái)，通過(guò)半胱氨酸的巰基與金表面特異性共價(jià)相連，從而可進(jìn)行表面等離子共振成像檢測(cè)。
[0041]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的微腔陣列質(zhì)譜靶板能夠?qū)﹃?yáng)性肽珠自動(dòng)化逐個(gè)捕獲，避免了傳統(tǒng)方法中多次分選、多次轉(zhuǎn)移造成的肽庫(kù)信息缺失。在集成微流控分選和微點(diǎn)陣捕獲的基礎(chǔ)上，將分布有陽(yáng)性肽珠的微腔陣列質(zhì)譜靶板進(jìn)行原位基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定和分析；并可與表面等離子體共振成像聯(lián)用，進(jìn)行原位親和力鑒定，實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽文庫(kù)的高效、高通量篩選和檢測(cè)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板結(jié)構(gòu)示意圖。
[0043]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板捕獲區(qū)域(微腔區(qū)域)的設(shè)計(jì)規(guī)格平面示意圖。
[0044]圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中利用微腔陣列質(zhì)譜靶板對(duì)多肽微珠進(jìn)行捕獲的示意圖。
[0045]圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中微腔陣列質(zhì)譜靶板(按照實(shí)施例1制作)與表面等離子共振成像芯片通過(guò)接觸而進(jìn)行陣列復(fù)制以及進(jìn)行表面等離子共振成像檢測(cè)的情景示意圖。
[0046]圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中通過(guò)高通量肽庫(kù)篩選獲得陽(yáng)性多肽的質(zhì)譜圖。
[0047]圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中通過(guò)高通量肽庫(kù)篩選獲得陽(yáng)性多肽與蛋白之間的相互作用的表面等離子體共振曲線(xiàn)圖。
[0048]附圖標(biāo)記說(shuō)明:
[0049]1-微腔陣列質(zhì)譜靶板，2-基片，3-粘附層，4-導(dǎo)電層，5-微腔，6_校正微腔，7_陽(yáng)性肽珠，8-表面等離子體共振成像芯片，9-反應(yīng)腔室，10-復(fù)制陣列，11-入射光源，12-濾光片，13-棱鏡，14-出射光，15-檢測(cè)器。
【具體實(shí)施方式】
[0050]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0051]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購(gòu)買(mǎi)得到的。
[0052]實(shí)施例1:微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作
[0053]如圖1所示，本實(shí)施例提供的微腔陣列質(zhì)譜靶板1，包括基片2、在所述基片2上形成的粘附層3和在所述粘附層3上形成的導(dǎo)電層4，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板I的有導(dǎo)電層4的一側(cè)設(shè)有與表面等離子體共振成像檢測(cè)區(qū)域相一致的微腔區(qū)域(圖1中的陣列所在的區(qū)域)，所述微腔區(qū)域位置的基片2上蝕刻有微腔5，所述微腔5開(kāi)口于所述導(dǎo)電層4并排列成陣列。為校正需要，還可包括標(biāo)準(zhǔn)樣品校正微腔6。[0054]如圖2所示，微腔5設(shè)計(jì)為正方體(圖中示出微腔5的俯視圖)，其邊長(zhǎng)為250 μ m，相鄰微腔5之間的距離也是250 μ m。上述規(guī)格的微腔陣列質(zhì)譜靶板的微腔區(qū)域與表面等離子體共振成像檢測(cè)區(qū)域正好吻合。
[0055]本實(shí)施例通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)具有上述特征的微腔陣列質(zhì)譜靶板的制作:
[0056](I)掩膜設(shè)計(jì):利用Adobe illustrator軟件繪制芯片設(shè)計(jì)圖,用激光排照機(jī)打印高分辨率光掩膜；
[0057](2)甩膠:將4寸硅片置于甩膠機(jī)上，用滴管在硅片中央滴加適量AZ1640光刻膠，根據(jù)光刻膠使用手冊(cè)，將甩膠機(jī)前后兩個(gè)轉(zhuǎn)速設(shè)為600r/min、40s和2000r/min、40s進(jìn)行旋涂;
[0058](3)前烘:實(shí)驗(yàn)中在加熱平臺(tái)上以5°C /min的速率由室溫升至95°C，在95°C保持15min，之后緩慢降至室溫；
[0059](4)曝光:紫外曝光，時(shí)間為30s ；
[0060](5)后烘:實(shí)驗(yàn)中在加熱平臺(tái)上以5°C /min的速率由室溫升至95°C，在95°C保持lOmin，之后緩慢降至室溫；
[0061](6)顯影:將硅片在廠家配套的顯影液中浸泡約40s并輕輕搖晃，使照到光的部分溶解；
[0062](7)堅(jiān)膜:在120°C，30min硬烤堅(jiān)膜，使光刻膠能堅(jiān)固的依附在硅片表面；
[0063](8)去底膠:在顯影過(guò)程中，被顯影液洗掉的區(qū)域會(huì)殘留一層很薄的底膠；在刻蝕之前用氧等離子體轟擊硅片表面3min去除底膠；
[0064](9)干法刻蝕:采用Bosch工藝進(jìn)行刻蝕(Plasmalab Systeml00ICP180),參數(shù)設(shè)置:沉積/刻蝕時(shí)間:7s ;氣體壓強(qiáng):30mT ;上電極射頻功率:700w ;下電極射頻功率:10w ；載片臺(tái)溫度:35°C (氦氣背冷輔助冷卻)；沉積氣體(C4F8) /刻蝕氣體(SF6)；
[0065](10)去膠:把硅片放入盛有發(fā)煙硝酸的燒杯中，超聲清洗30min，去除剩余光刻膠；
[0066](11)去除氧化層:在濺射金屬之前，為提高金屬與硅片的粘附性，用氬等離子體轟擊硅片表面(功率:800w，時(shí)間:3min)，去除表面氧化層；
[0067](12)濺射:將硅片放入金屬濺射儀，抽真空，濺射鈦?zhàn)鳛檎掣綄?，并濺射銀作為導(dǎo)電層；
[0068](13)劃片:將硅片放入劃片機(jī)中，按照設(shè)計(jì)將硅片劃成75毫米X25毫米的兩片。
[0069]實(shí)施例2:利用實(shí)施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板進(jìn)行多肽文庫(kù)的篩選
[0070](I)多肽文庫(kù)的構(gòu)建
[0071]選取血凝素蛋白九肽片段HA作為模型多肽(序列為YPYDVPDYA)。選取HA抗體AHA作為能與之特異結(jié)合的受體蛋白，建立包含HA的模型八肽文庫(kù)。肽庫(kù)構(gòu)建方法采用氨基修飾的TentaGel (溶脹粒徑可為200微米)樹(shù)脂作為固相載體，在合成首個(gè)氨基酸之前，在C-端首位偶聯(lián)甲硫氨酸。利用Fmoc合成策略進(jìn)行混合均分合成，選取構(gòu)成HA九肽的四種氨基酸Y、P、D、V作為反應(yīng)單元，經(jīng)過(guò)六輪合成，構(gòu)建庫(kù)容量為46的肽庫(kù)，多肽以“一珠一物，，隨機(jī)均勻分布，合成冗余量為3倍，即微珠數(shù)量約為IO5個(gè)。
[0072](a)稱(chēng)取80mg Tentagel-S-NH2樹(shù)脂，按照固相多肽合成程序循環(huán),依次加入160mgMet、Ala、Tyr> Asp進(jìn)行反應(yīng)四個(gè)循環(huán)；[0073](b)待反應(yīng)完成后,把樹(shù)脂均分為4份，向每管分別加入40mg Tyr> Pro、Asp、Val與等量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)進(jìn)行偶聯(lián)，待偶聯(lián)完畢后，把4管樹(shù)脂混合，脫保護(hù)；再把樹(shù)脂均分為4份；
[0074](C)重復(fù)5次步驟b;
[0075](d)經(jīng)過(guò)脫保護(hù)和收縮步驟，真空抽干，得到偶聯(lián)有肽庫(kù)的干燥樹(shù)脂備用。
[0076](2)蛋白的前處理
[0077]通過(guò)以下步驟進(jìn)行蛋白的前處理:
[0078](a)準(zhǔn)備標(biāo)記緩沖液和磷酸緩沖液(PBS)各L 5mL ；
[0079](b)擰緊取下過(guò)濾柱的底部并松開(kāi)蓋子；
[0080](c)將每個(gè)過(guò)濾柱放入一個(gè)1.5mL離心管中離心(1500g，Imin)；
[0081](d)取出過(guò)濾柱，倒掉離心管中的廢液(不要扔掉收集管)；
[0082](e)標(biāo)記過(guò)濾柱中樹(shù)脂斜面所在位置；
[0083](f)在過(guò)濾柱蓋子上分別標(biāo)記A和B ;
[0084](g)加入300yL標(biāo)記緩沖液(ρΗ=8.0)到A柱中，300yL PBS到B柱中;
[0085](h)將柱子放入收集管中離心(1500g, lmin),去除收集液并重復(fù)洗2次；
[0086](i)洗脫完后將A柱轉(zhuǎn)入一新的收集管中；
[0087](j)用標(biāo)記緩沖液溶解蛋白樣品至總體積100 μ L倒入A柱中離心(1500g, 2min),把濾過(guò)液體收集到離心管，標(biāo)記為A。
[0088](k)倒掉B柱濾過(guò)液，再向B柱加入300 μ L PBS，保持樹(shù)脂濕潤(rùn)備用。
[0089](3) 二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度
[0090]通過(guò)以下步驟測(cè)定蛋白濃度:
[0091](a)取5mL二喹啉甲酸定量試劑盒(Pierce)中試劑A至15mL離心管中再加100 μ LBCA試劑B混合得到工作液；
[0092](b)取10 μ L AHA樣品，用去離子水稀釋至20 μ L，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)白蛋白依次稀釋成濃度分別為 2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0μ g/mL 的溶液，各取 20 μ L 滴加到酶標(biāo)板的孔中，每孔再滴加200 μ L工作液，37°C孵育30min ；
[0093](c)將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)白蛋白和AHA吸光度(波長(zhǎng):450nm)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將HA抗體吸光度(0.2864)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到AHA濃度(1.48mg/mL)。
[0094](4)蛋白的生物素標(biāo)記
[0095]通過(guò)以下步驟進(jìn)行蛋白的生物素標(biāo)記:
[0096](a) 100 μ L無(wú)水N，N- 二甲基甲酰胺懸浮溶解固體生物素粉末；
[0097](b)加入2.32 μ L生物素至90 μ L蛋白溶液中，室溫反應(yīng)2小時(shí)；
[0098](c)反應(yīng)結(jié)束前，將含有PBS的B柱與用水配平的A柱離心(1500g, lmin),棄濾過(guò)液；
[0099](d)在新收集管中將上一步蛋白反應(yīng)液加入B柱中，配平A柱離心(1500g, 2min),收集B柱濾過(guò)的蛋白樣品；
[0100](5)多肽微珠與蛋白和磁珠的相互作用
[0101]通過(guò)以下步驟進(jìn)行多肽微珠與蛋白和磁珠的相互作用
[0102](a )用PBS把肽庫(kù)微珠清洗3次；[0103](b )用5%的脫脂牛奶在混旋儀上對(duì)肽珠混合封閉(37 °C，2h );
[0104](c)用 PBS 清洗 3 次；
[0105](d)用溶于PBS的5%脫脂牛奶按1:1000稀釋生物素標(biāo)記的AHA，然后與陽(yáng)性HA肽珠在混旋儀上混合孵育^了！:，〗!!)；
[0106](e)用 PBS 清洗 3 次；
[0107](f)用過(guò)量鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠與肽庫(kù)微珠在混旋儀上混合孵育(37°C，lh)。
[0108](6)利用微腔陣列質(zhì)譜靶板進(jìn)行原位檢測(cè)
[0109]通過(guò)以下步驟利用實(shí)施例1制作的微腔陣列質(zhì)譜靶板進(jìn)行原位檢測(cè):[0110](a)用移液槍將篩選后的陽(yáng)性肽珠移至微腔陣列質(zhì)譜靶板左端，緩慢滑動(dòng)玻璃蓋片使陽(yáng)性肽珠掉入微腔陣列，用培養(yǎng)皿收集未掉入微腔中的陽(yáng)性肽珠，加入少量PBS，用移液槍吸取培養(yǎng)皿中的陽(yáng)性肽珠，重新移至微腔陣列質(zhì)譜靶板左端，重復(fù)上述過(guò)程，直至全部陽(yáng)性肽珠掉入微腔陣列中。如圖3所示，每個(gè)微腔5的大小設(shè)計(jì)成僅能容納一個(gè)陽(yáng)性肽珠7，因此眾多陽(yáng)性肽珠7在所述微腔陣列質(zhì)譜靶板I的陣列狀的微腔5內(nèi)形成陣列分布，便于高效、高通量地篩選、檢測(cè)和分析。
[0111](b)把微腔陣列質(zhì)譜祀板暴露在紫外燈下(波長(zhǎng):340nm,時(shí)間:5min),使一部分多肽從陽(yáng)性肽珠上裂解下來(lái)，用表面等離子體共振成像芯片輕輕蓋在上面，使被裂解下來(lái)的陽(yáng)性多肽粘到表面等離子體共振成像芯片表面。如圖4所示，微腔陣列質(zhì)譜靶板I上的微腔區(qū)域中的陽(yáng)性多肽被粘到表面等離子體共振成像芯片8的檢測(cè)區(qū)域(成為復(fù)制陣列10)；然后通過(guò)表面等離子體共振成像儀(包括入射光源11、濾光片12、棱鏡13、出射光14和檢測(cè)器15)進(jìn)行表面等離子體共振成像分析。
[0112](c)將微腔陣列質(zhì)譜靶板導(dǎo)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。
[0113](d)在質(zhì)譜的顯微觀察窗口中選取相應(yīng)的多肽微珠所處的微腔進(jìn)行原位質(zhì)譜檢測(cè)，獲得相應(yīng)質(zhì)譜譜圖。其中一個(gè)陽(yáng)性多肽微珠的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。
[0114](e)使用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)的TOF-TOF模式，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的檢測(cè)與鑒定，獲得相應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜譜圖。
[0115](7)表面等離子體共振成像檢測(cè)
[0116]首先進(jìn)行芯片前處理:(a)孵育:在多肽被轉(zhuǎn)到到表面等離子體共振成像芯片上后，將表面等離子體共振成像芯片在4°C孵育過(guò)夜(12小時(shí))；(b)清洗:考慮到粘到表面等離子體共振成像芯片上的多肽是過(guò)量的，因此用10XPBS輕輕沖洗，然后將芯片依次放入盛有10XPBSUXPBS和去離子水(兩次)的培養(yǎng)皿在搖床上清洗IOmin ; (c)封閉:將芯片在5%牛奶的PBS溶液中封閉過(guò)夜(4°C，12小時(shí))；(d)重復(fù)步驟(b)的清洗步驟。
[0117]然后，(e)將芯片裝入表面等離子體共振成像儀進(jìn)行檢測(cè)；(f)配置IOM的磷酸作為洗脫液，分別配置 I XPBS,2 XPBS 以及 0.625mg/mL (0.004M)、1.25mg/mL (0.008M)、
2.5mg/mL (0.017M)、5mg/mL (0.033M)和 lOmg/mL (0.067M)溶于 PBS 的蛋白作為反應(yīng)試劑。樣品流速設(shè)為2 μ L/s,結(jié)合時(shí)間200s，解離時(shí)間200s。獲得圖6所示的陽(yáng)性多肽與蛋白之間的相互作用的表面等離子體共振曲線(xiàn)圖。
[0118] 申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴(lài)上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種微腔陣列質(zhì)譜靶板，包括基片、在所述基片上形成的粘附層和在所述粘附層上形成的導(dǎo)電層，所述微腔陣列質(zhì)譜靶板的有導(dǎo)電層的一側(cè)設(shè)有與表面等離子體共振成像檢測(cè)區(qū)域相一致的微腔區(qū)域，所述微腔區(qū)域位置的基片上蝕刻有微腔，所述微腔開(kāi)口于所述導(dǎo)電層并排列成陣列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔的形狀為正方體或棱臺(tái)形； 優(yōu)選地，所述微腔邊長(zhǎng)寬度為30?300微米、深度為30?300微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，每個(gè)微腔僅能容納一個(gè)多肽微珠； 優(yōu)選地，所述多肽微珠的粒徑為100?300微米，優(yōu)選120?250微米，更優(yōu)選150?180微米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔區(qū)域的微腔個(gè)數(shù)為4?900個(gè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述微腔區(qū)域的面積為0.5?4cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述基片的材料為硅； 優(yōu)選地，所述基片的厚度為200微米?I毫米。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述粘附層的材料為鈦； 優(yōu)選地，所述粘附層的厚度為10?100納米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板，其特征在于，所述導(dǎo)電層的材料為金、銀或鉬，優(yōu)選為銀； 優(yōu)選地，所述導(dǎo)電層的厚度為100?500納米。
9.一種制作權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板的方法，包括如下步驟: (1)打印預(yù)先設(shè)計(jì)的微腔陣列圖，形成掩膜； (2)利用光刻膠將所述掩膜轉(zhuǎn)移到基片上； (3)通過(guò)曝光、顯影和去膠得到微腔陣列圖； (4)蝕刻所述基片，并去除剩余的光刻膠和氧化層，得到微腔陣列； (5)分別濺射粘附層和導(dǎo)電層； (6)按照預(yù)先設(shè)計(jì)的規(guī)格劃片得到所述微腔陣列質(zhì)譜靶板。
10.一種權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的微腔陣列質(zhì)譜靶板在組合化學(xué)多肽文庫(kù)的篩選中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N27/64GK103868982SQ201410100307
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】王蔚芝, 李夢(mèng)林, 魏澤文, 胡志遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心