測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，包括以下步驟：將處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2′,7′-二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉得混合液，將混合液孵育、過濾，過濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸液中氧化型二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。該發(fā)明具有操作條件簡(jiǎn)單、易于實(shí)施、能夠準(zhǔn)確直觀的測(cè)定處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用領(lǐng)域和廢水處理領(lǐng)域，尤其涉及一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)下，重金屬和有機(jī)污染物對(duì)環(huán)境的危害已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問題。在目前廢水處理領(lǐng)域，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)能夠利用黃孢原毛平革菌去除廢水中的重金屬和有機(jī)物，然而廢水中的污染物對(duì)菌體產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用以及菌體本身對(duì)廢水的一個(gè)耐受性也值得我
們關(guān)注。
[0003]現(xiàn)有活性氧水平的檢測(cè)方法主要集中用于動(dòng)植物等高等生物體內(nèi)活性氧的檢測(cè)，其使用的檢測(cè)方法基本為流式細(xì)胞術(shù)，但流式細(xì)胞儀價(jià)格高昂，檢測(cè)費(fèi)用高，儀器操作復(fù)雜，且不宜批量檢測(cè)。在現(xiàn)有的2' ,1' -二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)熒光探針技術(shù)中，會(huì)存在探針載入細(xì)胞失敗，以及細(xì)胞外殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針沒有被洗凈，導(dǎo)致背景值較高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確直觀、操作簡(jiǎn)單、易于實(shí)施的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌體內(nèi)活性氧水平的方法，包括以下步驟:將處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌球清洗后，加入液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2' , I' - 二氯二氫突光黃雙乙酸鈉得混合液，將混合液孵育、過濾，過濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸液中氧化型二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。
[0007]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，
[0008]所述液體培養(yǎng)基中菌體的濕重為4g?Sg，所述混合液中2' ,V - 二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉的摩爾濃度為2 ii M?10 ii M。
[0009]所述液體培養(yǎng)基為Kirk液體培養(yǎng)基。
[0010]所述孵育的條件為室溫、避光孵育，孵育時(shí)間為0.5h?1.5h。
[0011]所述超聲破碎的溫度為0°C?4°C，功率為400w?600w，總超聲破碎時(shí)間為4min?6min,單次超聲持續(xù)3s?4s,單次超聲間隔8s?9s。
[0012]本發(fā)明中黃孢原毛平革菌菌懸液的制備步驟包括:將黃孢原毛平革菌孢子粉末懸浮于無菌水中制成孢子懸液，并調(diào)節(jié)濁度值為60%，即每毫升孢子懸液中含2.5X IO6個(gè)孢子，再將孢子懸液接種到Kirk液體培養(yǎng)基中于35 °C?39 °C, 140r/min?160r/min條件下，振蕩培養(yǎng)60h?72h，得黃孢原毛平革菌菌懸液。
[0013]本發(fā)明中黃孢原毛平革菌菌球處理廢水的步驟包括:將黃孢原毛平革菌菌懸液中的菌球加入至pH6.0?7.0的鎘廢水或二氯酚廢水中，于35°C?39°C，140r/min?160r/min條件下處理12h，過濾廢水，回收菌球，黃孢原毛平革菌菌懸液中菌球的干重質(zhì)量與廢水的體積比為0.3: lg/L?0.5: lg/L。
[0014]活性氧(ROS)是具有高度反應(yīng)性的小分子，包括超氧陰離子(02_)、羥基自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等；其存在于人類和生物體內(nèi)并源于氧。ROS能夠通過與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子反應(yīng)而改變細(xì)胞的功能，其通常作為不同代謝途徑的副產(chǎn)物存在于生物系統(tǒng)中。它們還在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫系統(tǒng)細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用，過量的ROS會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成很大損害。
[0015]氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。氧化應(yīng)激本身是難以被抓住并在體內(nèi)進(jìn)行測(cè)定的現(xiàn)象，因此，只能通過間接方法來測(cè)定它們的水平。
[0016]2/ ,1' -二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)是活性氧的特異探針，它本身不發(fā)熒光，可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，被胞內(nèi)的酯酶分解為無熒光的還原型二氯熒光素(DCFH)而保留在胞內(nèi)，各類ROS會(huì)氧化DCFH為發(fā)強(qiáng)綠色熒光的氧化型二氯熒光素(DCF)，DCFH被氧化成DCF的量(或熒光強(qiáng)度)與自由基的含量成正比，即細(xì)胞內(nèi)DCF的量(或熒光強(qiáng)度)能直接反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)自由基的含量，因此利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)胞內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞的ROS水平。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為:
[0018]1.本發(fā)明將活性氧水平的檢測(cè)方法從動(dòng)植物領(lǐng)域擴(kuò)展到了白腐真菌領(lǐng)域，能夠直觀、準(zhǔn)確的對(duì)廢水處理后受污染物脅迫的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平進(jìn)行表征，操作條件簡(jiǎn)單且容易實(shí)施。
[0019]2.本發(fā)明將處理廢水回收后的菌球經(jīng)去離子水清洗后加入培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，再向混合液中加入2' ,1' - 二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉。通過繼續(xù)培養(yǎng)可以使DCFH-DA順利地通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)過濾洗凈后的細(xì)胞外幾乎沒有殘余的探針，不會(huì)產(chǎn)生誤差。并且使用超聲破碎，大大提高了白腐真菌的破碎效率，能夠快速可靠地檢測(cè)其胞內(nèi)活性氧的水平。
[0020]3.本發(fā)明所使用的黃孢原毛平革菌菌球是由孢子粉末加入液體培養(yǎng)基中制備而成，制備工藝簡(jiǎn)單，易于擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)用性強(qiáng)。
[0021]4.本發(fā)明除了可以測(cè)定處理廢水后的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)的活性氧水平，同樣可以測(cè)定未處理廢水的黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)的活性氧水平，甚至包括其他白腐真菌。并且通過本發(fā)明檢測(cè)處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)DCF的熒光強(qiáng)度，可以得出黃孢原毛平革菌處理廢水的最佳濃度，能為重金屬和有機(jī)污染物對(duì)黃孢原毛平革菌產(chǎn)生的氧化應(yīng)激的毒性機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。本發(fā)明對(duì)于進(jìn)一步研究黃孢原毛平革菌在處理重金屬和難降解有機(jī)污染物等異生物質(zhì)時(shí)，菌體內(nèi)特殊抗氧化系統(tǒng)的變化具有重要意義，本發(fā)明也對(duì)白腐真菌在環(huán)境生物治理上的應(yīng)用具有促進(jìn)作用。
[0022]本發(fā)明采用的菌種為黃孢原毛平革菌(BKM-F1767)購自位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC ATTC24725，優(yōu)選采用該菌株，但不限于此?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1?4中各組黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)氧化型二氯熒光素在熒光分光光度計(jì)下DCF的發(fā)射光譜圖；
[0024]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1?4中各組黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)氧化型二氯熒光素在熒光分光光度計(jì)下DCF的熒光強(qiáng)度柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合說明書附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]本發(fā)明采用的菌種為黃孢原毛平革菌(BKM-F1767)購自位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC ATTC24725，優(yōu)選采用該菌株，但不限于此。
[0027]實(shí)施例1:
[0028]測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，包括以下步驟:
[0029](I)生長(zhǎng)階段:將黃孢原毛平革菌孢子粉末從斜面培養(yǎng)基上刮下，于無菌水中制成孢子懸液，將孢子懸液裝入測(cè)量瓶中，用濁度儀調(diào)試孢子懸液濁度值為60%，每毫升孢子懸液中含2.5 X IO6個(gè)孢子；再將孢子懸液接種到錐形瓶中的Kirk液體培養(yǎng)基，500mL錐形瓶中裝有Kirk液體培養(yǎng)基200mL，于恒溫振蕩箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，培養(yǎng)時(shí)間為60h，即得到黃孢原毛平革菌菌懸液。
[0030](2)廢水處理階段:將上述黃孢原毛平革菌菌懸液中的菌球加入至5mg/L的自配鎘廢水中，每升廢水中的黃孢原毛平革菌菌球的質(zhì)量以干重量計(jì)為0.4g，調(diào)節(jié)廢水的酸堿度至pH值至6.5，于37°C、150r/min條件下進(jìn)行振蕩反應(yīng)12h，完成對(duì)廢水中鎘的吸附，反應(yīng)后過濾廢水，回收菌球。
[0031](3)熒光分析:將上述回收后的菌球經(jīng)去離子水清洗后，用電子天平稱取濕重為6g的菌體，然后將其加入到200mL的Kirk液體培養(yǎng)基得混合液并繼續(xù)培養(yǎng)，再向混合液中加入0.2mL濃度為5mM的2' ,7' - 二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉，最后混合液中2' ,7' -二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉濃度為5 PM。在室溫條件下，于避光的搖床中孵育Ih后，過濾回收菌球，再于4°C下對(duì)回收的菌球進(jìn)行超聲破碎，超聲破碎功率為500W，每超聲破碎3s即休息8s，總超聲破碎時(shí)間為5min，再離心，提取上懸液，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定上懸液中DCF的熒光強(qiáng)度，即完成對(duì)菌體內(nèi)ROS水平的測(cè)定。
[0032]測(cè)定結(jié)果如表I所示。
[0033]實(shí)施例2:
[0034]測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，包括以下步驟:
[0035](I)生長(zhǎng)階段:本步驟與實(shí)施例1的步驟(I)相同；
[0036](2)吸附降解階段:將本實(shí)施例步驟(I)制備的黃孢原毛平革菌菌懸液中的菌球加入至20mg/L自配二氯酚廢水中，每升廢水中的黃孢原毛平革菌菌球的質(zhì)量以干重量計(jì)為0.4g，調(diào)節(jié)廢水的酸堿度至pH值至6.5，于37°C、150r/min條件下進(jìn)行振蕩反應(yīng)12h，完成對(duì)廢水中二氯酚的降解，反應(yīng)后過濾廢水，回收菌球。
[0037](3)熒光分析:本步驟與實(shí)施例1的步驟(3)相同。
[0038]測(cè)定結(jié)果如表I所示。[0039]采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定黃孢原毛平革菌菌體外的DCF熒光強(qiáng)度，并作為背景值；對(duì)照樣即采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定沒有處理廢水的黃孢原毛平革菌菌球內(nèi)的DCF熒光強(qiáng)度，菌球的處理步驟與實(shí)施例1步驟(1)和步驟(3) —致。
[0040]表1處理自配廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)ROS水平的測(cè)定結(jié)果
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于包括以下步驟:將處理廢水后的黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)菌球清洗后，加入液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，再向培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基中加入2' , I' -二氯二氫突光黃雙乙酸鈉得混合液，將混合液孵育、過濾，過濾后得到的菌球經(jīng)超聲破碎、離心后，提取上懸液，最后測(cè)定上懸液中氧化型二氯熒光素的熒光強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于:所述液體培養(yǎng)基中菌體的濕重為4g?Sg，所述混合液中2' ,V -二氯二氫熒光黃雙乙酸鈉的摩爾濃度為2 ii M?10 ii M。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于:所述液體培養(yǎng)基為Kirk液體培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于:所述孵育的條件為室溫、避光孵育，孵育時(shí)間為0.5h?1.5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的測(cè)定處理廢水后黃孢原毛平革菌菌體內(nèi)活性氧水平的方法，其特征在于:所述超聲破碎的溫度為0°C?4°C，功率為400w?600w，總超聲破碎時(shí)間為4min?6min,單次超聲持續(xù)3s?4s,單次超聲間隔8s?9s。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103808703SQ201410068774
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月27日
【發(fā)明者】杜堅(jiān)堅(jiān), 陳桂秋, 曾光明, 牛秋雅, 張企華, 黃健, 易斌, 陳安偉, 尚翠, 周穎 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)