一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，利用螺旋位相片將355nm波長激光整形成空心光束，其與532nm波長光合束后同時經(jīng)高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦照射到偶氮苯聚合物薄膜上。被355nm波長激光照射的偶氮苯薄膜對532nm波長激光有強(qiáng)吸收，在355nm波長光束的中間空心部分，532nm波長激光才會穿透偶氮苯聚合物薄膜，激發(fā)位于薄膜上面的熒光分子發(fā)光，樣品所發(fā)出的熒光被同一物鏡收集后被探測器接收。由于355nm光束聚焦后的空心部分尺度為亞波長量級，可在被測樣品上實(shí)現(xiàn)超衍射極限的激發(fā)光聚焦光斑，通過逐點(diǎn)掃描，可實(shí)現(xiàn)整個樣品的超衍射極限的熒光顯微成像。
【專利說明】一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯
微成像裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及超分辨光學(xué)成像領(lǐng)域，特別涉及一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置。
【背景技術(shù)】
[0002]顯微技術(shù)是人們了解微觀世界最直接的手段，光學(xué)顯微技術(shù)將微觀世界圖像直接呈現(xiàn)在我們眼前，是所有顯微技術(shù)中最直觀也是最常用的一種顯微技術(shù)，但是傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)受衍射極限的限制，分辨率只能到半個波長量級，這已經(jīng)無法滿足現(xiàn)今顯微的分辨要求。近年來一些超分辨顯微技術(shù)相繼被提出并走向成熟，這些超分辨顯微技術(shù)主要包括共聚焦顯微技術(shù)，掃描探針顯微技術(shù)，受激福射突光淬滅顯微技術(shù)，隨機(jī)光重建顯微技術(shù)等。上述主要顯微技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中都有其局限性，其存在的問題為:
[0003]1、成本高。如，掃描探針顯微技術(shù)需要造價昂貴的控制反饋系統(tǒng)作為支撐，而受激輻射熒光烊滅顯微技術(shù)需要在共聚焦系統(tǒng)支撐下才能實(shí)現(xiàn)，同時對熒光分子，激發(fā)光源具有較高的要求。
[0004]2、穩(wěn)定性不高。高精度設(shè)備如近場光學(xué)探針等容易損壞，需要定期更換。
[0005]3、局限性。共聚焦顯微技術(shù)對分辨率的提高較為有限；常用的掃描探針顯微技術(shù)如原子力顯微鏡只能提供固體樣品的表面起伏圖像；受激輻射熒光烊滅顯微技術(shù)要想獲得高的分辨率需要用超短脈沖光源，并對脈沖的發(fā)射時間作精確控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)分辨率的不足，提出了一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其借助于聚合物薄膜吸收調(diào)制特性的低成本、實(shí)用性強(qiáng)的超分辨光學(xué)顯微技術(shù)實(shí)現(xiàn)超分辨熒光顯微成像。
[0007]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0008]一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其包括:光學(xué)探測器，濾光片，第一分束鏡，第二分束鏡，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，樣本,532nm激光光源,第一擴(kuò)束透鏡組，第二擴(kuò)束透鏡組，355nm激光光源和螺旋位相片；其中，樣本包括玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，以及熒光分子標(biāo)記的被測樣品；樣本制備過程為在玻璃基底上旋涂一層300nm左右厚度的偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置被熒光分子標(biāo)記的被測樣品；
[0009]所述的355nm激光光源發(fā)出波長為355nm的光束，經(jīng)第二擴(kuò)束透鏡組擴(kuò)束后經(jīng)過螺旋位相片變成空心的渦旋光束，其中心是光強(qiáng)為零的奇點(diǎn)，該空心光束經(jīng)分束鏡，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，玻璃基底后輻照在偶氮苯聚合物薄膜上；同時，由532nm激光光源發(fā)出的波長為532nm的激光光束經(jīng)第一擴(kuò)束透鏡組擴(kuò)束，依次經(jīng)第一分束鏡、第二分束鏡后與355nm光束合束，同時經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上，其中532nm激光和355nm激光聚焦在偶氮苯聚合物薄膜的同一位置，由于偶氮苯聚合物薄膜上被355nm波長光輻照的環(huán)形區(qū)域?qū)?32nm波長光有強(qiáng)吸收，使得只有在355nm波長調(diào)制光的空心部分，532nm波長光才能透過偶氮苯聚合物薄膜，通過選擇合適的調(diào)制光與激發(fā)光光強(qiáng)比值，在偶氮苯聚合物上表面形成超衍射極限的激發(fā)光聚焦光斑，激發(fā)標(biāo)記在樣品上的熒光分子，其中樣品放置在偶氮苯聚合物薄膜上表面，激發(fā)出來的熒光被同一高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡收集并經(jīng)過濾光片傳送到光學(xué)探測器，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)被測樣品上超衍射分辨極限區(qū)域內(nèi)光學(xué)信息的提取，樣品的基底放置在納米位移臺上，通過逐點(diǎn)掃描，實(shí)現(xiàn)整個樣品的超分辨熒光顯微成像。
[0010]進(jìn)一步的，所述的355nm激光光源所發(fā)光擴(kuò)束后經(jīng)過螺旋位相片變成渦旋光束，其為空心光束，該空心光束經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。
[0011]進(jìn)一步的，所述的532nm激光光源所發(fā)光擴(kuò)束后經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上，其在偶氮苯聚合物薄膜上形成的光斑要落在355nm激光光源在偶氮苯聚合物薄膜上形成的光斑內(nèi)，并且兩束光的光斑中心重合。
[0012]進(jìn)一步的，被355nm激光光源輻照的偶氮苯聚合物薄膜對532nm激光光源所發(fā)出光有強(qiáng)吸收，使得只有355nm激光光源所發(fā)光束的空心部分才會有532nm激光光源所發(fā)532nm波長光穿透偶氮苯聚合物薄膜。
[0013]進(jìn)一步的，受激的熒光分子自發(fā)輻射熒光，該熒光被同一高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡收集，經(jīng)過濾光片后，被探測器接收。
[0014]進(jìn)一步的，被熒光分子標(biāo)記的被測樣品可為生物細(xì)胞。
[0015]進(jìn)一步的，實(shí)驗(yàn)中通過選擇合適的熒光分子和濾光片，只讓被532nm激光激發(fā)出來的熒光能夠到達(dá)探測器，其他波長的熒光都被過濾掉。
[0016]進(jìn)一步的，其他波長的熒光為被355nm激光激發(fā)出來的熒光。
[0017]本發(fā)明技術(shù)的原理為:
[0018]一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，包括:光學(xué)探測器，濾光片，分束鏡，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，樣本，532nm激光光源，擴(kuò)束透鏡組，355nm激光光源，螺旋位相片；其中，樣本由玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，熒光分子標(biāo)記的樣品層組成，其制備過程為在玻璃基底上旋涂一層300nm左右厚偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置熒光分子標(biāo)記的樣品。
[0019]355nm波長激光器所發(fā)光經(jīng)擴(kuò)束透鏡組擴(kuò)束后經(jīng)過螺旋位相片變?yōu)榭招墓馐?，光束中心為光?qiáng)為零的奇點(diǎn)。該空心光束經(jīng)分束鏡，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。同時，由532nm激光器所發(fā)出的波長為532nm的激光光束(實(shí)心高斯光束)經(jīng)擴(kuò)束透鏡組擴(kuò)束，經(jīng)分束鏡，與355nm波長光束合束，同時通過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。被355nm波長的空心光束輻照的偶氮苯聚合物薄膜(環(huán)形區(qū)域)對532nm波長光有強(qiáng)吸收，使得只有355nm波長光束中心亞波長大小的范圍內(nèi)532nm波長光才能穿透偶氮苯聚合物薄膜，激發(fā)薄膜上方的熒光分子。通過改變調(diào)制光(355nm)與激發(fā)光(532nm)的光強(qiáng)比值，可實(shí)現(xiàn)超衍射極限空間區(qū)域內(nèi)熒光分子的發(fā)光。所發(fā)熒光被同一高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡收集。通過選擇合適的濾光片，只讓被532nm波長光激發(fā)的熒光被光學(xué)探測器接收。樣品基底放置在納米位移臺上，通過逐點(diǎn)掃描，實(shí)現(xiàn)整個被測樣品的超分辨成像。[0020]利用偶氮苯聚合物的吸收調(diào)制特性，其被355nm激光輻照部分的偶氮苯對532nm激光有強(qiáng)吸收，使得該部分對532nm激光形成一種“關(guān)”的狀態(tài)，即532nm波長光無法完全透過偶氮苯聚合物薄膜中被355nm光照射的區(qū)域；而只有在355nm光束中間的空心區(qū)域，偶氮苯聚合物薄膜沒有被照射，不會發(fā)生吸收調(diào)制，因此532nm光可穿透此區(qū)域的偶氮苯聚合物薄膜，形成一種“開”的狀態(tài)，其效果類似于形成一個光學(xué)小孔，通過選擇合適的調(diào)制光與激發(fā)光的光強(qiáng)比值，可讓此光學(xué)小孔的孔徑遠(yuǎn)小于光波的衍射極限，基于此可獲得超衍射分辨極限的激發(fā)光(532nm)聚焦光斑，進(jìn)而激發(fā)位于偶氮苯聚合物薄膜表面熒光分子的自發(fā)輻射熒光，利用高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡和濾光片將532nm激光激發(fā)出來的熒光傳送到到探測器上，即可獲得此超衍射極限空間區(qū)域內(nèi)被測樣品的光學(xué)信息。利用精密位移臺的逐點(diǎn)掃描，可實(shí)現(xiàn)整個樣品的超分辨成像。
[0021 ] 本發(fā)明與現(xiàn)有成像技術(shù)相比的優(yōu)勢為:
[0022]1、結(jié)構(gòu)簡單:高數(shù)值孔徑顯微物鏡在這里既用于對兩束激光進(jìn)行聚焦，又用于熒光收集探測，其結(jié)構(gòu)簡單緊湊；
[0023]2、高分辨率:突破了傳統(tǒng)光學(xué)成像的衍射極限，利用偶氮苯聚合物薄膜本身的吸收調(diào)制特性，實(shí)現(xiàn)了超分辨的光學(xué)成像；
[0024]3、低成本:該顯微技術(shù)光路簡單，無需類似于掃描顯微成像所需的高精密樣品一探針近場距離控制系統(tǒng)，也無需各種特殊要求的昂貴激光光源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明提出的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0026]圖2為光斑示意圖和其對應(yīng)的直徑上的光強(qiáng)分布圖，a為被高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上的532nm光斑示意圖和其對應(yīng)的光強(qiáng)分布圖，b為被高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上的355nm光斑示意圖和其對應(yīng)的光強(qiáng)分布圖，c為透過偶氮苯聚合物薄膜后532nm光斑不意圖和其對應(yīng)的光強(qiáng)分布；
[0027]其中，1、光學(xué)探測器；2、濾光片；3、第一分束鏡；4、第二分束鏡；5、高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡；6、折射率匹配油；7、玻璃基底；8、偶氮苯聚合物薄膜；9、熒光分子標(biāo)記的被測樣品；10、532nm激光光源；11、13、第一、第二擴(kuò)束透鏡組；12、355nm激光光源；14、螺旋位相片。
[0028]圖3為偶氮苯聚合物的吸收光譜，可看到其有兩個吸收峰，分別為350nm波段和500nm波段(接近本發(fā)明所用調(diào)制光(355nm)與激發(fā)光(532nm)波長)，對應(yīng)偶氮苯聚合物的順式和反式兩種結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，附圖中相同的標(biāo)號始終表示相同的部件。
[0030]參照圖1所示的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微鏡，包括:光學(xué)探測器I，濾光片2,第一分束鏡3,第二分束鏡4,高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡5,折射率匹配油6，樣本，532nm激光光源10，第一擴(kuò)束透鏡組ll，355nm激光光源12，第二擴(kuò)束透鏡組13，螺旋位相片14 ;其中，樣本由玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，熒光分子標(biāo)記的被測樣品層，其制備過程為在玻璃基底上旋涂一層300nm左右厚的偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置熒光分子標(biāo)記的被測樣品，如生物細(xì)胞等，將制備好的樣品通過折射率1.516的匹配油6與高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡5 (如60X，N.A.=1.42)相接；355nm激光光源12所發(fā)的355nm激光經(jīng)第二擴(kuò)束透鏡組13擴(kuò)束后，經(jīng)過螺旋位相片14變?yōu)闇u旋光束(空心光束)，再經(jīng)過第二分束鏡4反射后經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡5會聚輻照在偶氮苯聚合物薄膜8上。532nm激光光源10所發(fā)的532nm激光經(jīng)第一擴(kuò)束透鏡組11擴(kuò)束后被反射到高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡5上，經(jīng)過會聚后輻照在偶氮苯聚合物薄膜8上。選擇合適的第一擴(kuò)束透鏡組11和第二擴(kuò)束透鏡組13，使得被高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡聚焦后的532nm光斑落在355nm光斑內(nèi)，控制兩束光光斑中心重合；同時選擇合適的調(diào)制光與激發(fā)光光強(qiáng)比值，只讓尺度小于355nm光束空心部分覆蓋的區(qū)域內(nèi)熒光分子被532nm激光激發(fā)，發(fā)出的熒光被高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡收集后傳播到濾光片2上，濾光片2只讓被532nm激光激發(fā)的熒光通過并傳到探測器，進(jìn)而獲得超衍射分辨極限區(qū)域內(nèi)樣品的光學(xué)信息。樣品基底放置在納米位移臺上，通過逐點(diǎn)掃描得到整個樣品的超分辨熒光圖像。
[0031]本發(fā)明未詳細(xì)闡述的部分屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于:其包括:光學(xué)探測器(1)，濾光片(2)，第一分束鏡(3)，第二分束鏡(4)，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5)，折射率匹配油(6)，樣本，532nm激光光源(10)，第一擴(kuò)束透鏡組(11)，第二擴(kuò)束透鏡組(13)，355nm激光光源(12)和螺旋位相片(14);其中，樣本包括玻璃基底(7)，偶氮苯聚合物薄膜(8)，以及熒光分子標(biāo)記的被測樣品(9);樣本制備過程為在玻璃基底(7)上旋涂一層300nm左右厚度的偶氮苯聚合物薄膜(8)，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置被熒光分子標(biāo)記的被測樣品； 所述的355nm激光光源(12)發(fā)出波長為355nm的光束，經(jīng)第二擴(kuò)束透鏡組(13)擴(kuò)束后經(jīng)過螺旋位相片(14)變成空心的渦旋光束，其中心是光強(qiáng)為零的奇點(diǎn)，該空心光束經(jīng)第二分束鏡(4)，高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5)，折射率匹配油(6)，玻璃基底(7)后輻照在偶氮苯聚合物薄膜(8)上；同時，由532nm激光光源(10)發(fā)出的波長為532nm的激光光束經(jīng)第一擴(kuò)束透鏡組(11)擴(kuò)束，依次經(jīng)第一分束鏡(3)、第二分束鏡(4)后與355nm光束合束，同時經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5)，折射率匹配油(6)，玻璃基底(7)后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜(8)上，其中532nm激光和355nm激光聚焦在偶氮苯聚合物薄膜的同一位置，由于偶氮苯聚合物薄膜上被355nm波長光輻照的環(huán)形區(qū)域?qū)?32nm波長光有強(qiáng)吸收，使得只有在355nm波長調(diào)制光的空心部分,532nm波長光才能透過偶氮苯聚合物薄膜,通過選擇合適的調(diào)制光與激發(fā)光光強(qiáng)比值，在偶氮苯聚合物上表面形成超衍射極限的激發(fā)光聚焦光斑，激發(fā)標(biāo)記在樣品上的熒光分子，其中樣品放置在偶氮苯聚合物薄膜上表面，激發(fā)出來的熒光被同一高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5 )收集并經(jīng)過濾光片(2 )傳送到光學(xué)探測器(I)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)被測樣品上超衍射分辨極限區(qū)域內(nèi)光學(xué)信息的提取，樣品的基底放置在納米位移臺上，通過逐點(diǎn)掃描，實(shí)現(xiàn)整個樣品的超分辨熒光顯微成像。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，所述的355nm激光光源(12)所發(fā)光擴(kuò)束后經(jīng)過螺旋位相片(14)變成渦旋光束，其為空心光束，該空心光束經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5)聚焦在偶氮苯聚合物薄膜(8)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種`基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，所述的532nm激光光源(10)所發(fā)光擴(kuò)束后經(jīng)過高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5)聚焦在偶氮苯聚合物薄膜(8)上，其在偶氮苯聚合物薄膜(8)上形成的光斑要落在355nm激光光源(12)在偶氮苯聚合物薄膜(8 )上形成的光斑內(nèi)，并且兩束光的光斑中心重合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，被355nm激光光源(12)輻照的偶氮苯聚合物薄膜對532nm激光光源所發(fā)出光有強(qiáng)吸收，使得只有355nm激光光源(12)所發(fā)光束的空心部分才會有532nm激光光源(10)所發(fā)532nm波長光穿透偶氮苯聚合物薄膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，受激的熒光分子自發(fā)輻射熒光，該熒光被同一高數(shù)值孔徑油浸顯微物鏡(5 )收集，經(jīng)過濾光片(2 )后，被探測器接收。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，被熒光分子標(biāo)記的被測樣品可為生物細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，實(shí)驗(yàn)中通過選擇合適的熒光分子和濾光片，只讓被532nm激光激發(fā)出來的熒光能夠到達(dá)探測器，其他波長的熒光都被過濾掉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于偶氮苯聚合物光致吸收調(diào)制特性的超分辨熒光顯微成像裝置，其特征在于，其他波 長的突光為被355nm激光激發(fā)出來的突光。
【文檔編號】G01N21/64GK103616364SQ201310655786
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月8日
【發(fā)明者】朱良富, 張斗國, 陳漪愷, 韓璐, 王向賢, 王沛, 明海 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)