一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒及其用于檢測(cè)的方法，該方案采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法的原理，制備了一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，包括有CA125（糖鏈抗原125）抗體包被微孔反應(yīng)板/條、校準(zhǔn)品6瓶、質(zhì)控品2瓶和酶結(jié)合物1瓶、濃縮洗滌液1瓶、發(fā)光底物A1瓶和發(fā)光底物B1瓶，其應(yīng)用于大批量檢測(cè)和逐個(gè)/組手動(dòng)檢測(cè)中，都表現(xiàn)出靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的有益效果。
【專利說明】一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是糖鏈抗原125的檢測(cè)方法，具體的是應(yīng)用糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人體血清中糖鏈抗原125 (CA125)是上皮性卵巢癌的主要標(biāo)志物，特異性能達(dá)到80%以上，在卵巢腫瘤復(fù)發(fā)的早期比臨床提前幾個(gè)月即出現(xiàn)濃度增高，因此其濃度是用來評(píng)估卵巢癌的重要指標(biāo)，對(duì)于已經(jīng)過組織學(xué)確診的卵巢癌患者，CA125濃度的檢測(cè)有助于對(duì)治療效果和疾病進(jìn)行檢測(cè)并可用于協(xié)助判斷預(yù)后，但需要說明的是，其他因素也會(huì)引起血清CA125的增高，比如1%的健康婦女、3%的良性卵巢腫瘤患者和6%的非卵巢相關(guān)的良性疾病患者。
[0003]酶聯(lián)免疫法是一種免疫檢測(cè)方法，其基礎(chǔ)手段是抗原或抗體的固相化結(jié)合抗原或抗體的酶標(biāo)記，在加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，從而能實(shí)現(xiàn)目的檢測(cè)物的定性或定量分析。
[0004]實(shí)驗(yàn)階段的酶聯(lián)免疫法進(jìn)行CA125濃度檢測(cè)普遍具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和再現(xiàn)性，但是實(shí)際臨床檢查過程中，由于大批量操作的采用(例如應(yīng)用生物芯片檢測(cè)儀的過程中)，使得上述指標(biāo)都有不同程度的減弱，此外，目前普遍采用的PMT檢測(cè)器為點(diǎn)測(cè)量，且其工作前須進(jìn)行波峰校正，不僅工作效率與大批量操作的要求相悖，更易導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，而提供一種靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的技術(shù)方案，該方案采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法的原理，制備了 一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其應(yīng)用于大批量檢測(cè)和逐個(gè)/組手動(dòng)檢測(cè)中，都表現(xiàn)出靈敏度、準(zhǔn)確度高，再現(xiàn)性好的有益效果。
[0006]本發(fā)明的一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，技術(shù)方案為，該試劑盒包括有CA125抗體包被微孔反應(yīng)板/條、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B。
[0007]所述的微孔反應(yīng)板/條上抗體的包被濃度為I?3 μ g/孔。所述的校準(zhǔn)品為CA125的抗原稀釋液，其濃度范圍分別為5、15、50、100、300、600U/ml，所述的質(zhì)控品為CA125的稀釋液。所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的CA125抗體溶液，其含量為0.2?lug/mL。所述的濃縮洗滌液為含有吐溫-20的20%NaCl溶液，吐溫-20含量為0.01%_0.1%。所述的發(fā)光底物A為魯米諾溶液，所述發(fā)光底物B為過氧化氫酶和辣根過氧化氫酶穩(wěn)定劑的混合溶液。
[0008]所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟:
a.完成待測(cè)樣品預(yù)處理后，取出所需的CA125抗體包被的微孔反應(yīng)板/條置于微孔架上，立即將剩余的微孔反應(yīng)板/條放回鋁箔袋中，并重新密封鋁箔袋；
b.加入校準(zhǔn)品每孔25?lOOuL、質(zhì)控品每孔25?100uL和待測(cè)樣本每孔25?100uL，然后再加入酶結(jié)合物每孔50?150uL，充分混勻，取出濃縮洗滌液用新鮮的純化水1:20稀釋后加入相應(yīng)的存放裝置；
c.選擇芯片反應(yīng)儀elisa，選擇洗滌微孔條數(shù)，放置微孔板于反應(yīng)槽內(nèi)，反應(yīng)開始；
d.反應(yīng)儀自動(dòng)洗滌完成，拿出微孔架，拍干；
e.從試劑盒中取出發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，將二液等體積混合并混勻，加發(fā)光底物液每孔50μ 1，全部加完發(fā)光底物液后，立即計(jì)時(shí)，在I分鐘內(nèi)將微孔板條平穩(wěn)放置于生物芯片檢測(cè)儀中，啟動(dòng)CXD拍照程序，設(shè)置曝光時(shí)間90秒，I分鐘整拍照；
f.計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理和分析資料，出報(bào)表。
[0009]CA125檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用具體為:
1、前期準(zhǔn)備
(I)將試劑盒置室溫(18?26°C )平衡20分鐘。
[0010](2)從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1:20稀釋后加入 相應(yīng)的存放位置。
[0011](3)使用前將待測(cè)的合格血清樣本置于室溫18?26°C平衡20分鐘。
[0012]2、試驗(yàn)條件
在室溫(18?26 °C)下進(jìn)行操作。
[0013]3、操作步驟
使用生物芯片反應(yīng)儀操作步驟
①取出所需的CA12-5抗體包被微孔板反應(yīng)條置于微孔架上，立即將剩余的微孔反應(yīng)條放回鋁箔袋中，并重新密封鋁箔袋。
[0014]②校準(zhǔn)品每孔25?lOOuL、質(zhì)控品每孔25?100 uL和待測(cè)樣本每孔25?100uL，然后再加入酶結(jié)合物每孔50?150uL，充分混勻。
[0015]③選擇芯片反應(yīng)儀elisa，點(diǎn)擊Elisa_l，選擇洗滌微孔條數(shù)，點(diǎn)擊自動(dòng)運(yùn)行。蜂鳴器報(bào)警后，開門放置微孔板于反應(yīng)槽內(nèi)，點(diǎn)擊“放入后關(guān)門”，反應(yīng)開始。
[0016]④反應(yīng)儀自動(dòng)洗滌完成，蜂鳴器報(bào)警，拿出微孔架，拍干。
[0017]⑤從試劑盒中取出發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，將二液等體積混合并混勻，加發(fā)光底物液每孔50μ 1，全部加完發(fā)光底物液后，立即計(jì)時(shí)，在I分鐘內(nèi)必須將微孔板條平穩(wěn)放置于生物芯片檢測(cè)儀中。啟動(dòng)CXD拍照程序，設(shè)置曝光時(shí)間90秒，I分鐘整拍照。
[0018]⑥計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理和分析資料，出報(bào)表。
[0019]4、試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算
用生物芯片檢測(cè)儀自帶軟件自動(dòng)根據(jù)以校準(zhǔn)品作出指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)樣品指標(biāo)的定量結(jié)果，同時(shí)輸出檢測(cè)結(jié)果。對(duì)超出檢測(cè)上限的樣本，應(yīng)準(zhǔn)確稀釋后重做，最后將測(cè)得的含量乘稀釋倍數(shù)即為該樣本實(shí)際含量。
[0020]5、質(zhì)量控制方法
選用Lever-Jennings質(zhì)控圖方法,根據(jù)RCV計(jì)算中的平均值(X )和標(biāo)準(zhǔn)差(s)確定質(zhì)控限,以T ±2s為告警限，? ±3s為失控限判斷質(zhì)控結(jié)果。其基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義為:在穩(wěn)
定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多余I個(gè)結(jié)果超過2s (95.5%可信限)限度；在1000
個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過3s (99.7%可信限)的結(jié)果不多于3個(gè)。因此如以T ±3s為失控限，假
失控的概率為0.3%。對(duì)待質(zhì)控品應(yīng)于患者標(biāo)本一樣同等對(duì)待，不能進(jìn)行特殊處理，在每批患者標(biāo)本測(cè)定的同時(shí)測(cè)定質(zhì)控品，將所得結(jié)果標(biāo)在質(zhì)控圖上，質(zhì)控品在控時(shí)，方能報(bào)告該批患者標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果，質(zhì)控品失控時(shí)，說明測(cè)定過程存在問題，不能報(bào)告患者標(biāo)本結(jié)果，應(yīng)解決存在的問題，并重新測(cè)定在控后方能報(bào)告。當(dāng)使用一個(gè)以上濃度的質(zhì)控品想在同一張質(zhì)
控圖描點(diǎn)時(shí)，則質(zhì)控圖上均值和s可不標(biāo)具體數(shù)據(jù)，而僅以了和s表示。
[0021]6、檢測(cè)結(jié)果的意義
對(duì)CA125陽(yáng)性檢出者，應(yīng)結(jié)合病史、臨床癥狀及體征等綜合判斷。以CA125含量< 35U/ml的為陰性，對(duì)CA125含量在35~600 U/ml之間者，建議動(dòng)態(tài)觀察。對(duì)CA125含量大于600 U/ml的樣本，應(yīng)準(zhǔn)確稀釋后重做，最后將測(cè)得的CA125含量乘稀釋倍數(shù)即為該樣本實(shí)際CA125含量。
[0022]7、性能指標(biāo)
(I)準(zhǔn)確性:
將1.0 U/mlUO U/ml和100 U/ml的糖鏈抗原125(CA125)標(biāo)準(zhǔn)品加入到正常血清中，用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按回收率(％)=實(shí)際測(cè)定值/理論值*100%測(cè)定其回收率，結(jié)果在其回收率應(yīng)在(85%~115%)范圍內(nèi)。
[0023](2)檢測(cè)范圍:4 ~600 U/ml
(3)最低檢測(cè)限:不高于4 U/ml。
[0024](4)線性:在O~600 U/ml濃度的線性范圍內(nèi)，試劑盒的相關(guān)系數(shù)r≤0.9900。
[0025](5)重復(fù)性:用(50±10) U/ml和(300±50) U/ml的樣本各重復(fù)檢測(cè) 10次，其變異系數(shù)(CV)不大于15%。
[0026](6)批間差:用三個(gè)批號(hào)試劑盒分別檢測(cè)濃度為(50± 10) U/ml和(300±50) U/ml范圍內(nèi)的樣本，則三個(gè)批號(hào)試劑盒之間的批間變異系數(shù)(CV)不大于15%。
[0027](7)穩(wěn)定性:試劑盒在37°C放置3天，檢測(cè)準(zhǔn)確度、最低檢測(cè)限、線性、重復(fù)性，應(yīng)符合要求。
[0028](8)分析特異性:
①血清中甘油三酯《 30 mg/ml)、膽紅素(< 0.2 mg/ml)、血紅蛋白(< 4 mg/ml)和類風(fēng)濕因子《 800 IU)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。
[0029]②Cisplatin ? 1000 ug/ml)、Bleomycin ? 1000 μ U/m)、Vinblastine ? 500yg/ml)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響。
[0030]另外，本試劑盒在10000 U/ml內(nèi)不產(chǎn)生Hook效應(yīng)。
[0031]本方案的有益效果可根據(jù)對(duì)上述方案的敘述得知:
一:無(wú)放射性
以往在生物分析的定量檢測(cè)中使用最為普遍的當(dāng)屬放射性同位素標(biāo)記及檢測(cè)技術(shù)，它存在諸多的不足，包括:某些放射性同位素由于半衰期短不利于長(zhǎng)期的儲(chǔ)存和運(yùn)輸；同時(shí)由于放射性物質(zhì)的污染對(duì)工作人員的健康及環(huán)境造成一定的危害，需要特殊的設(shè)備防護(hù)以及廢物處理。而化學(xué)發(fā)光這方面的生物技術(shù)消除了對(duì)工作人員以及環(huán)境的危害，同時(shí)由于發(fā)光信號(hào)在短時(shí)間內(nèi)自行消失，因此非常容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、重復(fù)測(cè)定。
[0032]二:高靈敏度
通常酶聯(lián)免疫技術(shù)的分析靈敏度可達(dá)到10-13mol/L，新型的微珠包被酶放大免疫技術(shù)的分析靈敏度可達(dá)到10-14mol/L，熒光免疫可達(dá)到10-15mol/L，固相放免技術(shù)可達(dá)到10-16mol/L。
[0033]而化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)的分析靈敏度已經(jīng)達(dá)到10_18mol/L.這個(gè)靈敏度已經(jīng)接近了免疫檢測(cè)的極限。
[0034]三:寬線性范圍
通常，酶聯(lián)免疫技術(shù)，包括新型的微珠包被酶放大免疫技術(shù)，由于受到比色測(cè)量的線性關(guān)系只在稀溶液中成立的限制，加上反應(yīng)杯的透光率差異以及渾濁樣品的散射吸收作用，其線性范圍不超過2個(gè)數(shù)量級(jí)。而化學(xué)發(fā)光其線性范圍已經(jīng)達(dá)到6個(gè)數(shù)量級(jí)，它的瓶頸只是檢測(cè)儀器的性能。
[0035]采用生物芯片反應(yīng)儀進(jìn)行檢測(cè)
1.有更好的反應(yīng)結(jié)合能力。在溫育期間也不停的震動(dòng)，這使得反應(yīng)更加的充分，能更使抗原抗體分子更有效的結(jié)合，相比于手工實(shí)驗(yàn)的話，孵育箱不具有相關(guān)的功能，反應(yīng)是靜態(tài)的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有動(dòng)態(tài)的反應(yīng)更加充分。這樣導(dǎo)致了反應(yīng)儀能有更低的檢測(cè)限，也間接的提高了試劑盒的靈敏度。
[0036]2.更好的重復(fù)性。
[0037]反應(yīng)儀的洗滌是兩點(diǎn)吸液，能控制精確的加樣量，每次都能保持良好的重復(fù)性，可以從表單上可以看到，反應(yīng)儀器的重復(fù)總是優(yōu)于洗板機(jī)1%以上。
[0038]【具體實(shí)施方式】:
為能清楚說明本方案的技術(shù)特點(diǎn)，下面通過一個(gè)【具體實(shí)施方式】，對(duì)本方案進(jìn)行闡述。
[0039]以下涉及的實(shí)驗(yàn)方法，沒有特別指出的，都可以采用現(xiàn)有技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法得到。
[0040]實(shí)施例1
試劑盒I包括有CA125 (糖鏈抗原125)抗體包被微孔反應(yīng)板一塊，其單抗包被濃度為lug，還包括有校準(zhǔn)品6瓶，其CA125抗原濃度分別為5 U/ml,15 U/ml,50 U/mlUOO U/ml、300 U/ml,600 U/ml，質(zhì)控品2瓶，其CA125抗原濃度分別為50U/ml、300 U/ml和酶結(jié)合物I瓶，其酶標(biāo)抗體濃度為lug/ml，濃縮洗滌液I瓶，其吐溫-20含量為0.01%、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B各I瓶。
[0041]應(yīng)用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)及其結(jié)果:
1、前期準(zhǔn)備
(I)將試劑盒置室溫(18?26°C )平衡20分鐘。
[0042](2)從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1:20稀釋后加入 相應(yīng)的存放位置。
[0043](3)使用前將待測(cè)的合格血清樣本置于室溫18?26°C平衡20分鐘。
[0044]2、試驗(yàn)條件在室溫(18~26 °C)下進(jìn)行操作。
[0045]3、操作步驟
(O使用生物芯片反應(yīng)儀操作步驟
①取出所需的CA12-5抗體包被微孔板反應(yīng)條置于微孔架上，立即將剩余的微孔反應(yīng)條放回鋁箔袋中，并重新密封鋁箔袋。
[0046]②校準(zhǔn)品每孔25ul、質(zhì)控品每孔25ul和待測(cè)樣本每孔25ul，然后再加入酶結(jié)合物每孔50ul，充分混勻。
[0047]③選擇芯片反應(yīng)儀elisa，點(diǎn)擊Elisa_l，選擇洗滌微孔條數(shù)，點(diǎn)擊自動(dòng)運(yùn)行。蜂鳴器報(bào)警后，開門放置微孔板于反應(yīng)槽內(nèi)，點(diǎn)擊“放入后關(guān)門”，反應(yīng)開始。
[0048]④反應(yīng)儀自動(dòng)洗滌完成，蜂鳴器報(bào)警，拿出微孔架，拍干。
[0049]⑤從試劑盒中取出發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，將二液等體積混合并混勻，加發(fā)光底物液每孔50μ 1，全部加完發(fā)光底物液后，立即計(jì)時(shí)，在I分鐘內(nèi)必須將微孔板條平穩(wěn)放置于生物芯片檢測(cè)儀中。啟動(dòng)CXD拍照程序，設(shè)置曝光時(shí)間90秒，I分鐘整拍照。
[0050]⑥計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理和分析資料，出報(bào)表。
[0051](2)使用孵育箱+洗板機(jī)的操作步驟
按
【發(fā)明內(nèi)容】
中操作步驟操作，各種試劑加入量同上述(I)使用生物芯片反應(yīng)儀操作步驟。
[0052](3)使用孵育箱+手工洗板的操作步驟
按
【發(fā)明內(nèi)容】
中操作步驟操作，各種試劑加入量同上述(I)使用生物芯片反應(yīng)儀操作步驟。
[0053]4、檢測(cè)結(jié)果
(I)準(zhǔn)確性:
將1.0 U/mlUO U/ml和100 U/ml的糖鏈抗原125 (CA125)標(biāo)準(zhǔn)品加入到正常血清中，用試劑盒I進(jìn)行檢測(cè)，按回收率(％)=實(shí)際測(cè)定值/理論值*100%測(cè)定其回收率，結(jié)果如下:
表1試劑盒I用于檢測(cè)的回收率
【權(quán)利要求】
1.一種糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，該試劑盒包括有CA125抗體包被微孔反應(yīng)板/條、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、發(fā)光底物A和發(fā)光底物B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述的微孔反應(yīng)板/條上抗體的包被濃度為I?3 μ g/孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述的校準(zhǔn)品為CA125的抗原稀釋液，其濃度范圍分別為5、15、50、100、300、600U/ml，所述的質(zhì)控品為CA125的稀釋液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記的CA125抗體溶液，其含量為0.2?lug/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述的濃縮洗滌液為含有吐溫-20的20%NaCl溶液，吐溫-20含量為0.01%-0.1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述的發(fā)光底物A為魯米諾溶液，所述發(fā)光底物B為過氧化氫酶和辣根過氧化氫酶穩(wěn)定劑的混合溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的糖鏈抗原125定量檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，其特征是，包括以下步驟: a.完成待測(cè)樣品預(yù)處理后，取出所需的CA125抗體包被的微孔反應(yīng)板/條置于微孔架上，立即將剩余的微孔反應(yīng)板/條放回鋁箔袋中，并重新密封鋁箔袋； b.加入校準(zhǔn)品每孔25?IOOuU質(zhì)控品每孔25?100uL和待測(cè)樣本每孔25?100uL，然后再加入酶結(jié)合物每孔50?150uL，充分混勻，取出濃縮洗滌液用新鮮的純化水1:20稀釋后加入相應(yīng)的存放裝置； c.選擇芯片反應(yīng)儀elisa，選擇洗滌微孔條數(shù)，放置微孔板于反應(yīng)槽內(nèi)，反應(yīng)開始； d.反應(yīng)儀自動(dòng)洗滌完成，拿出微孔架，拍干； e.從試劑盒中取出發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，將二液等體積混合并混勻，加發(fā)光底物液每孔50μ 1，全部加完發(fā)光底物液后，立即計(jì)時(shí)，在I分鐘內(nèi)將微孔板條平穩(wěn)放置于生物芯片檢測(cè)儀中，啟動(dòng)CXD拍照程序，設(shè)置曝光時(shí)間90秒，I分鐘整拍照； f.計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理和分析資料，出報(bào)表。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103675278SQ201310582689
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】穆海東, 汪寧梅, 沈玨璟, 劉洵言, 佐一含, 高學(xué)武 申請(qǐng)人:上海裕隆醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所股份有限公司