胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單靈敏的檢測(cè)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲直接毒性影響的測(cè)定方法。該方法通過把殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白均勻地混入所建立的以花粉為基礎(chǔ)的飼料直接飼喂給龜紋瓢蟲，并以混入蛋白酶抑制劑E-64的飼料（225μg?E-64/g花粉）為陽性對(duì)照，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料為陰性對(duì)照，通過比較處理組和對(duì)照組瓢蟲生存率、發(fā)育歷期、體重和產(chǎn)卵量等重要生命指標(biāo)評(píng)價(jià)殺蟲化合物的潛在毒性。采用本方法測(cè)定了龜紋瓢蟲對(duì)不同濃度E-64的生物學(xué)反應(yīng)，龜紋瓢蟲的不同生命參數(shù)隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，證明了該方法的有效性和靈敏性。
【專利說明】胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]捕食性瓢蟲(Coleoptera:Coccinellidae)是多種作物如棉花、玉米、水稻、蔬菜等田間生態(tài)系統(tǒng)中常見的重要天敵昆蟲，在作物害蟲防治中發(fā)揮著重要的作用。因此，在殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全影響研究中，該類天敵昆蟲一直備受關(guān)注。特別是近些年，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的廣泛種植，其可能對(duì)天敵昆蟲帶來的負(fù)面影響引起了相關(guān)科學(xué)家的廣泛關(guān)注。轉(zhuǎn)基因抗蟲作物如Bt作物對(duì)瓢蟲類天敵昆蟲的潛在影響也成為了轉(zhuǎn)基因抗蟲作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容(Duan et al., 2002;Lundgren and Wiedenmann, 2002;Baiet al.，2005;Schmidt et al., 2009;Li et al.，2010a，2011a，b;dlvarez-Alfageme etal., 2009, 2011;Porcar et al.，2010)。
[0003]龜紋瓢蟲(Propylea japonica Thunberg)是我國(guó)多種農(nóng)業(yè)生態(tài)體系中十分常見的捕食性天敵昆蟲，其成蟲和幼蟲均可捕食蚜蟲、甲殼蟲、飛虱、螨類、螟蛾類幼蟲等害蟲。除了捕食害蟲，在作物開花期，其還有取食花粉的習(xí)性。這樣，在作物田龜紋瓢蟲可能通過取食獵物間接地暴露于殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因抗蟲作物如Bt棉花表達(dá)的外源殺蟲蛋白；通過取食花粉而直接地暴露于這些殺蟲化合物。因此，該天敵昆蟲作為指示性生物已被廣泛用于殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物環(huán)境安全研究。然而，目前還沒有相對(duì)完善的可用于評(píng)價(jià)殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲直接毒性影響的技術(shù)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種能簡(jiǎn)單靈敏地檢測(cè)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲直接毒性影響的生物測(cè)定方法。
[0005]本發(fā)明提供的胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法，通過把胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白均勻地混入龜紋瓢蟲飼料直接飼喂龜紋瓢蟲，通過直接觀察龜紋瓢蟲的生命指標(biāo)評(píng)價(jià)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響，所述龜紋瓢蟲飼料的主要成分為花粉。
[0006]所述花粉優(yōu)選為油菜花粉，也可采用其它如玉米、水稻等花粉。
[0007]飼喂龜紋瓢蟲的飼喂體系優(yōu)選為:在龜紋瓢蟲幼蟲每個(gè)齡期第一天僅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合飼料飼喂瓢蟲直至下一齡期，當(dāng)瓢蟲孵化后，鑒定瓢蟲雌雄后配對(duì)，單對(duì)飼養(yǎng)，采用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂。
[0008]花粉直接撒于培養(yǎng)皿底部提供給瓢蟲，花粉如果是蜜蜂采集的顆粒狀花粉，需要粉碎。
[0009]大豆蚜提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合飼料中花粉和大豆蚜的都為足量供應(yīng)。[0010]所述飼喂體系可以通過將1%瓊脂水溶液凝固后與飼料一起提供給瓢蟲，給瓢蟲提供水源。
[0011]優(yōu)選地，選擇蛋白酶抑制劑E-64為陽性對(duì)照化合物，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料作為陰性對(duì)照處理。
[0012]陽性對(duì)照處理蛋白酶抑制劑E-64的用量可以為200-400 iig E_64/g花粉。優(yōu)選為 225ii g E-64/g 花粉。
[0013]優(yōu)選地，每個(gè)處理至少測(cè)試幼蟲45頭，成30對(duì)，飼料每天更換，測(cè)試在26土1°C，75±5%RH，光照16:8H的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每天分早晚兩次觀測(cè)生命指標(biāo)。
[0014]所述生命指標(biāo)可以包括生存率、發(fā)育歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產(chǎn)卵量中的兩種或多種。
[0015]采用本方法測(cè)定了龜紋瓢蟲對(duì)不同濃度已知毒性化合物E-64的生物學(xué)反應(yīng)，龜紋瓢蟲的不同生命參數(shù)隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，證明了該方法的有效性和靈敏性。本發(fā)明所提供的方法簡(jiǎn)單可行，能有效地測(cè)定不同胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對(duì)瓢蟲類天敵昆蟲的直接毒性影響。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1.利用本發(fā)明提供的飼喂體系瓢蟲幼蟲在不同齡期取食花粉量的情況；
[0017]圖2.利用本發(fā)明提供的方法測(cè)得的取食含不同濃度蛋白酶抑制劑E-64飼料的龜紋瓢蟲生存曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單靈敏地檢測(cè)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲直接毒性影響的測(cè)定方法。該方法通過把殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白均勻地混入所建立的以花粉為基礎(chǔ)的飼料直接飼喂給龜紋瓢蟲，并以混入蛋白酶抑制劑E-64的飼料(225iigE-64/g花粉)為陽性對(duì)照，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料為陰性對(duì)照，通過比較處理組和對(duì)照組瓢蟲生存率、發(fā)育歷期、體重和產(chǎn)卵量等重要生命指標(biāo)評(píng)價(jià)殺蟲化合物的潛在毒性。采用本方法測(cè)定了龜紋瓢蟲對(duì)不同濃度E-64的生物學(xué)反應(yīng)，龜紋瓢蟲的不同生命參數(shù)隨E-64濃度的變化顯示出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，證明了該方法的有效性和靈敏性。本發(fā)明所提供的方法簡(jiǎn)單可行，能有效地測(cè)定不同胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白如Bt蛋白對(duì)瓢蟲類天敵昆蟲的直接毒性影響。
[0019]I毒性測(cè)定體系的構(gòu)建
[0020]下面說明本發(fā)明提供的胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法的一種【具體實(shí)施方式】。
[0021]建立測(cè)定殺蟲化合物對(duì)受試?yán)ハx的直接毒性，首先需要一個(gè)合適的昆蟲飼料，通過該飼料把殺蟲化合物飼喂給受試?yán)ハx(Romeis et al., 2011 ;Li et al.，2013)?；邶敿y瓢蟲取食花粉的習(xí)性，發(fā)展了一個(gè)以油菜花粉為基礎(chǔ)的龜紋瓢蟲飼料。在該飼喂體系中，在龜紋瓢蟲幼蟲每個(gè)齡期第一天僅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合飼料飼喂瓢蟲直至下一齡期。當(dāng)瓢蟲孵化后，鑒定瓢蟲雌雄后配對(duì)，單對(duì)飼養(yǎng)。采用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂?；ǚ厶峁┓椒槭惺鄣念w粒狀油菜花粉先用研缽磨碎后，直接撒在培養(yǎng)皿底部；大豆蚜蟲提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成2cm的小段，直接置于培養(yǎng)皿中?；ǚ酆痛蠖寡炼紴樽懔刻峁?。為給瓢蟲提供水源，1%的瓊脂熔解后，加入1.5ml的去蓋離心管，凝固后與飼料一起提供給瓢蟲。
[0022]基于所建立的瓢蟲飼喂體系，建立了殺蟲化合物對(duì)瓢蟲毒性影響的測(cè)定體系，測(cè)定體系包括以下處理:1)陰性對(duì)照處理:花粉中不添加受試化合物；2)花粉中按一定濃度(根據(jù)需要)均勻混入受試殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白；3)陽性對(duì)照:花粉中均勻混入E-64(濃度一般為200-400 ii g/g花粉)。初孵幼蟲單頭飼養(yǎng)于塑料培養(yǎng)皿中(6.0cm直徑，1.5cm高)，每個(gè)處理推薦至少測(cè)試45頭瓢蟲幼蟲。如果檢測(cè)殺蟲化合物對(duì)瓢蟲繁殖力的影響，新羽化的瓢蟲成蟲配對(duì)飼養(yǎng)于上述培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置3-5個(gè)折疊紙條(IOcm長(zhǎng)，Icm寬)作為瓢蟲產(chǎn)卵介質(zhì)。每個(gè)處理至少測(cè)試30對(duì)瓢蟲。如上述方式提供瓢蟲幼蟲和成蟲飼料。飼料每天更換，保證測(cè)試化合物生物活性。試驗(yàn)在26 土 1°C，75 土 5%RH，光照16: 8H的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。每天上午9點(diǎn)和下午9點(diǎn)觀察瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育，記錄死亡率、生長(zhǎng)歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產(chǎn)卵量等生命參數(shù)。獲得數(shù)據(jù)后，采用合適的生物統(tǒng)計(jì)方法分析比較處理組和陰性對(duì)照組瓢蟲不同生命參數(shù)的差異。
[0023]2以花粉為基礎(chǔ)的飼喂體系有效性驗(yàn)證
[0024]2.1花粉攝入量測(cè)定
[0025]在本毒性測(cè)定體系中，油菜花粉作為殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白的載體，因此瓢蟲只有足量取食到花粉才能起到把受試化合物有效傳遞給瓢蟲的作用。為了驗(yàn)證所建立的飼喂體系瓢蟲能夠取食到大量花粉以滿足把足量受試殺蟲化合物傳遞給瓢蟲的需要，開展了花粉取適量檢測(cè)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟為:1)采用上述方法飼喂瓢蟲幼蟲；2)在每個(gè)齡期瓢蟲幼蟲取食花粉I天后，收集10頭幼蟲；3)解剖幼蟲，取出瓢蟲幼蟲整個(gè)消化道；4)把瓢蟲消化道中的花粉粒均勻混入一定量品紅溶液中，提取一定量溶液，在解剖鏡下查花粉粒的數(shù)量，然后計(jì)算整個(gè)幼蟲消化道中的花粉粒數(shù)。再根據(jù)油菜花粉粒的平均干質(zhì)量9.Sng/粒，計(jì)算不同齡期幼蟲體內(nèi)含油菜花粉量。
[0026]結(jié)果發(fā)現(xiàn):龜紋瓢蟲幼蟲從I齡到4齡分別取食6.9± 1.1, 15.8±3.1，47.8±6.5andl55.7±15.9iig油菜花粉(圖1)。這說明通過該飼喂體系，龜紋瓢蟲能取食到大量花粉，這樣就可把足量的混入花粉的受試殺蟲化合物傳遞給瓢蟲。
[0027]2.2花粉飼料對(duì)瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響
[0028]在該毒性測(cè)定體系中，所采用的飼料必須能滿足所測(cè)定昆蟲基本的正常生長(zhǎng)發(fā)育(一般要求存活率>80%) (Romeis et al.,2011;Li et al.，2013)。試驗(yàn)檢測(cè)了毒性測(cè)定體系中所采用飼料對(duì)瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響。試驗(yàn)設(shè)立兩個(gè)處理:1)瓢蟲從孵化到成蟲，持續(xù)取食大豆蚜；2)瓢蟲取食花粉和蚜蟲。花粉和蚜蟲供應(yīng)方式如上述。每個(gè)處理測(cè)試75個(gè)蟲子。每天上午9點(diǎn)和下午9點(diǎn)觀察瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育，記錄死亡率、生長(zhǎng)歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產(chǎn)卵量等生命參數(shù)。試驗(yàn)在26±1°C，75±5%RH，光照16:8H的培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
[0029]生物測(cè)定結(jié)果顯示:取食花粉和蚜蟲的瓢蟲幼蟲化蛹率達(dá)92%，羽化率達(dá)90%，與取食蚜蟲的瓢蟲組均無明顯差異(P>0.05)。同樣，羽化成蟲體重方面，兩個(gè)處理間也沒有顯著差異。然而，與持續(xù)取食蚜蟲的瓢蟲相比，取食花粉和蚜蟲的瓢蟲幼蟲發(fā)育歷期有所延長(zhǎng)(P〈0.001)，而雌蟲產(chǎn)卵量顯著提高(P〈0.01)(表I)。結(jié)果說明，取食花粉和蚜蟲飼料，瓢蟲幼蟲歷期雖有所延長(zhǎng)，但生存率(>80%)與持續(xù)取食蚜蟲的瓢蟲沒有差異，且取食該飼料的瓢蟲成蟲的繁殖力明顯增強(qiáng)。因此，所建立的瓢蟲飼喂體系適合用于殺蟲化合物對(duì)瓢蟲毒性影響的測(cè)定體系。
[0030]表1.取食不同飼料的瓢蟲生命表參數(shù)
[0031]
【權(quán)利要求】
1.胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響的測(cè)定方法，其特征在于，通過把胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白均勻地混入龜紋瓢蟲飼料直接飼喂龜紋瓢蟲，通過直接觀察龜紋瓢蟲的生命指標(biāo)評(píng)價(jià)胃毒性殺蟲劑或轉(zhuǎn)基因殺蟲蛋白對(duì)龜紋瓢蟲毒性影響，所述龜紋瓢蟲飼料的主要成分為花粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述花粉為油菜花粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，飼喂龜紋瓢蟲的飼喂體系為:在龜紋瓢蟲幼蟲每個(gè)齡期第一天僅提供花粉，之后采用花粉和大豆蚜混合飼料飼喂瓢蟲直至下一齡期，當(dāng)瓢蟲孵化后，鑒定瓢蟲雌雄后配對(duì)，單對(duì)飼養(yǎng)，采用僅花粉飼料與花粉和大豆蚜混合飼料隔天交替飼喂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定方法，其特征在于，花粉直接撒于培養(yǎng)皿底部提供給瓢蟲，大豆蚜提供方法為把覆滿大豆蚜的大豆苗剪成段提供，所述花粉和大豆蚜混合飼料中花粉和大豆蚜都為足量供應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述飼喂體系通過將1%瓊脂水溶液凝固后與飼料一起提供給瓢蟲，給瓢蟲提供水源。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，在該測(cè)定方法中，選擇蛋白酶抑制劑E-64為陽性對(duì)照化合物，以沒有混入任何殺蟲化合物的飼料作為陰性對(duì)照處理。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，陽性對(duì)照處理蛋白酶抑制劑E-64的用量為 200-400 u g E-64/g 花粉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，陽性對(duì)照化合物蛋白酶抑制劑E-64的用量為225 u g E-64/g花粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測(cè)定方法，其特征在于，每個(gè)處理至少測(cè)試幼蟲45頭瓢蟲，成蟲至少30對(duì)，飼料每天更換，測(cè)試在26± I°C，75土5%RH，光照16: 8H的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每天分早晚兩次觀測(cè)生命指標(biāo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于，所述生命指標(biāo)包括生存率、發(fā)育歷期、新羽化成蟲體重和雌蟲產(chǎn)卵量中的兩種或多種。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK103609877SQ201310541170
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】李云河, 張小潔, 彭于發(fā) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所