一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，特征是先以質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1∶1∶1的比例配制成高爾基銀染溶液，將腦組織浸泡于37℃銀染溶液中36-48小時，將浸泡好的腦組織在振動切片機上進行切片，將組織切片置于明膠包被的載玻片上，放置過夜，然后進行常規(guī)的氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，顯微鏡觀察。采用本發(fā)明方法能夠快速準確的對大腦各部分腦區(qū)進行染色，且染色結(jié)果清晰，細節(jié)明顯，便于研究人員觀察腦組織的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，為臨床病例分析神經(jīng)系統(tǒng)的病變提供了便捷的手段，對于神經(jīng)學的基礎(chǔ)研究領(lǐng)域同樣具有重大的意義。
【專利說明】—種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于神經(jīng)病理學組織染色法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)組織染色的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]已有的科學研究表明，大腦神經(jīng)系統(tǒng)有一類專門負責傳遞和處理神經(jīng)信號的興奮性細胞一有棘神經(jīng)元，主要是由于神經(jīng)元樹突上分布的形態(tài)各異的小突起一樹突棘而得名。神經(jīng)元的樹突樹的精細構(gòu)筑調(diào)控了神經(jīng)元之間復(fù)雜的突觸連接，并依此來調(diào)節(jié)神經(jīng)信號的傳遞。樹突棘是神經(jīng)元上突觸輸入的重要靶點，它與突觸可塑性有直接的相關(guān)性。因此觀察有棘神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)的改變對解釋大腦復(fù)雜的功能基礎(chǔ)和神經(jīng)疾病的病變機理提供了直接證據(jù)。
[0003]在組織學染色領(lǐng)域，高爾基銀染法是目前應(yīng)用最為廣泛的一種觀察神經(jīng)元形態(tài)的染色方法，可以用來分析神經(jīng)元的樹突結(jié)構(gòu)和樹突棘形態(tài)。因其操作方便，耗費小，染色效果好，對顯微鏡要求低，并且該方法的組織切片在200微米左右可以清晰的顯示整個神經(jīng)元樹突的形態(tài)。它的傳統(tǒng)操作流程是在染色液配置好后，將一定大小的腦組織放置其中，室溫避光保存，兩天后需要換置新鮮的染色液，14天后取出腦組織進行切片、顯影和觀察。但是該方法目前還存在一系列問題，比如整個過程費時、切片容易成碎片、染色時容易掉片等等。特別是由于浸染時間需要14天，大大影響了實驗進程。目前有很多研究組對該染色方法進行了一些改進來避免上述問題，比如替換顯影液，氧化劑等，但是實驗時間最短也要5天，也有相關(guān)報道將浸染溫度改為37°C，但是因為浸染時間的問題，染色效果不如原始方法的好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，以實現(xiàn)快速觀察在體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，從而能夠為臨床病例分析神經(jīng)系統(tǒng)的病變以及神經(jīng)學的基礎(chǔ)研究提供便捷的手段。
[0005]本發(fā)明基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006]先以質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1:1:1的比例配制成高爾基銀染溶液；
[0007]將待神經(jīng)元染色的腦組織浸沒在上述配制的銀染溶液中，在37±2°C環(huán)境溫度下浸泡36到48小時；
[0008]然后利用振動切片機將浸泡好的腦組織進行切片，并置于明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜；
[0009]將上述放置過夜的切片經(jīng)過氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
[0010]所述將浸泡好的腦組織進行切片的步驟為:取出浸泡好的腦組織，用磷酸緩沖液沖洗，然后將振動切片機的有關(guān)參數(shù)設(shè)定為:振幅0.45毫米，切片前進速度0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，采用振動切片機進行切片。
[0011]由于本發(fā)明采用了在將組織浸泡的溫度從傳統(tǒng)高爾基染法采用的室溫提高至37±2°C的同時將浸泡時間控制在36到48小時之間，從而在保證染色效果與傳統(tǒng)效果類似的基礎(chǔ)之上，有效地克服了傳統(tǒng)高爾基染色耗時14天的長時程操作、大大精簡了傳統(tǒng)實驗步驟，不需要不斷更新浸泡液，同時由于浸泡時間短和振動切片機合理使用，有效克服了傳統(tǒng)切片操作難、易碎片的缺點。本發(fā)明方法為神經(jīng)元形態(tài)觀察提供了一種快速有效的新途徑，為神經(jīng)領(lǐng)域的臨床分析和科學研究提供了一種有效的檢測手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1到圖6為采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在不同浸染時間分別處理24小時、36小時、48小時、3天、6天和9天后的錐體神經(jīng)元的示意圖。
[0013]圖7、圖8和圖9為本實施例中分別對不同腦組織采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在浸染時間為48小時的神經(jīng)元示意圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1:
[0015]下面結(jié)合附圖通過實施例對本發(fā)明作進一步具體詳細的說明。
[0016]本發(fā)明基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，具體實施操作步驟包括:
[0017]I)配制銀染溶液:將質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀(國藥)、5%氯化汞(國藥)和5%鉻酸鉀(國藥)水溶液按1:1:1的體積比例配制混合好，避光放置。
[0018]2)準備樣本:大鼠(SD)經(jīng)過二氧化碳麻醉后，利用蠕動泵進行心臟灌流，灌流液為生理鹽水，然后快速斷頭取腦，將半腦浸沒在已配好的銀染染色液中。
[0019]3)組織樣本浸染:按照1:5的體積比將腦組織侵入銀染溶液中，避光放置。在37±2°C環(huán)境溫度下浸泡36到48小時。
[0020]4)切片:取出浸泡好的腦組織，用PBS緩沖液沖洗，然后用振動切片機(本實施例中采用的是德國制造的萊卡Viooos振動切片機)進行切片，各有關(guān)參數(shù)設(shè)定為:振幅為
0.45毫米，切片前進速度為0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，最后組織切片置于明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜。
[0021]5)顯影，制片及觀察:切片經(jīng)過氨水顯影，梯度酒精脫水，利用100%酒精，二甲苯和丙酮新鮮配置的混合液，透明15分鐘，中性樹膠封片，最后在普通光學顯微鏡下觀察(本實施例中采用的是日本制造的尼康EclipseSOi光學顯微鏡)。
[0022]圖1到圖6為采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在不同浸染時間分別處理24小時、36小時、48小時、3天、6天和9天后的錐體神經(jīng)元的示意圖。圖中的結(jié)果顯示:浸泡36小時和48小時的組織染色效果比較好，神經(jīng)元的樹突棘比較清晰，細胞結(jié)構(gòu)比較完整。而24小時的染色結(jié)果，雖然樹突著色較深，但是樹突棘部分很容易成團，不利于觀察，到了第三天和第六天的結(jié)果樹突棘雖然還在，但是很多部位已經(jīng)開始掉色，也就是背景中出現(xiàn)很多黑色斑點，到了第九天，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)有了明顯的皺縮，神經(jīng)元只剩下主干的結(jié)構(gòu)，并且主干的樹突上的樹突棘也有明顯的皺縮，成團狀分布在樹突的第一級分支上。[0023]圖7、圖8和圖9為本實施例中分別對不同腦組織采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在浸染時間為48小時的神經(jīng)元示意圖。其中圖7為大腦視皮層錐體神經(jīng)元(A)，圖8為海馬區(qū)錐體神經(jīng)元(B)，圖9為海馬區(qū)顆粒細胞(C)。從圖7、圖8和圖9中可以看出:大腦視皮層的錐體神經(jīng)元以及海馬區(qū)的錐體神經(jīng)元和顆粒細胞整體染色清晰，特別是這三類神經(jīng)元上的樹突棘結(jié)構(gòu)完整，細節(jié)清楚，可以充分用于臨床的病理分析，該結(jié)果說明實施例中的各個條件的設(shè)定都是合理可行的，采用本發(fā)明基于高爾基銀染法在環(huán)境溫度37°C下浸染48小時的不同腦區(qū)的神經(jīng)元整體結(jié)構(gòu)完整，樹突著色深，樹突棘的結(jié)構(gòu)清晰，同時縮短了常規(guī)的實驗流程，操作方便，利于研究人員進行腦組織病理形態(tài)的觀察分析。
【權(quán)利要求】
1.一種基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，其特征在于包括以下步驟: 先以質(zhì)量體積比濃度為5%重鉻酸鉀、5%氯化汞和5%鉻酸鉀的水溶液按照體積比1:1:1的比例配制成高爾基銀染溶液； 將待神經(jīng)元染色的腦組織浸沒在上述配制的銀染溶液中，在37±2°C環(huán)境溫度下浸泡36到48小時； 然后利用振動切片機將浸泡好的腦組織進行切片，并置于明膠包被的載玻片上，用保鮮膜包裹整個載玻片，放置過夜； 將上述放置過夜的切片經(jīng)過氨水顯影，梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。
2.如權(quán)利要求1所述基于高爾基銀染法的快速神經(jīng)元染色方法，特征在于所述將浸泡好的腦組織進行切片的步驟為:取出浸泡好的腦組織，用磷酸緩沖液沖洗，然后將振動切片機的有關(guān)參數(shù)設(shè)定為:振幅0.45毫米，切片前進速度0.55毫米/秒，切片厚度為200微米，采用振動切片機進行切片。
【文檔編號】G01N1/30GK103471898SQ201310460112
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】胡繁, 葛夢夢, 汪惠麗, 王艷, 劉志華, 徐麗 申請人:合肥工業(yè)大學