白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法
【專利摘要】一種白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于：該方法包括白鶴靈芝藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法和含量測(cè)定方法；其中指紋圖譜檢測(cè)方法是采用HPLC測(cè)定，它具有12個(gè)特征峰；含量測(cè)定方法是選取白鶴靈芝中提取分離得到的含量較高、具有代表性的成分并采用HPLC法測(cè)定，定量指標(biāo)為白鶴靈芝中分離提取的傘形花內(nèi)酯。本方法操作簡(jiǎn)便，所測(cè)得的多種成分分離度好，重現(xiàn)性，精密度，穩(wěn)定性，回收率均較好。
【專利說(shuō)明】白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量控制領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是一種白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]建立對(duì)中藥的質(zhì)量控制體系必須立足于中藥的特色，中醫(yī)藥有自己的獨(dú)特的理論體系，為中華民族的繁衍作出了巨大貢獻(xiàn)。傳統(tǒng)中藥是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下的藥用物質(zhì)，又是具我國(guó)特色，切實(shí)可行的創(chuàng)制新藥的物質(zhì)來(lái)源。中藥質(zhì)量控制與保障是中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化以及國(guó)際化中的核心問(wèn)題。近年來(lái)，隨著我國(guó)中藥科技和檢測(cè)儀器、技術(shù)的發(fā)展，中藥的有效成分研究。中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系已由單一有效成分或指標(biāo)成分檢測(cè)體系，向與藥效和毒性相關(guān)的多指標(biāo)或化學(xué)指紋圖譜體系發(fā)展。指紋圖譜目前被國(guó)際上認(rèn)為是植物藥和中草藥質(zhì)量控制的最有效方法。中藥的質(zhì)量檢測(cè)方法必須能對(duì)起效的全成分(有機(jī)成分、無(wú)機(jī)成分和絡(luò)合物成分)進(jìn)行控制(這其中也需要基礎(chǔ)藥理研究的同步發(fā)展)。只有這樣，所建立的質(zhì)量控制體系才能真心達(dá)到控制中藥質(zhì)量、保證中藥用藥質(zhì)量安全有效的目的。以上這一最終目的就決定了中藥質(zhì)量控制的難度?，F(xiàn)有的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)本身不足以控制成品功效穩(wěn)定，而且生產(chǎn)本身也難以保證成品的一致。指紋圖譜的出現(xiàn)應(yīng)該說(shuō)對(duì)中藥質(zhì)量控制確實(shí)起到了推動(dòng)作用。指紋圖譜技術(shù)與多指標(biāo)成分定量分析方法將是目前國(guó)際共識(shí)的，較為科學(xué)、合理的中藥質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)。
[0003]中藥指紋圖譜是以系統(tǒng)的化學(xué)成分研究和藥理學(xué)研究為基礎(chǔ)，采用一定的分析手段將中藥的特征和有效成分以圖譜的形式描繪出來(lái)，以全面反映中藥所含化學(xué)成分發(fā)種類和數(shù)量進(jìn)而識(shí)別真?zhèn)?、辨認(rèn)優(yōu)劣、確定其質(zhì)量和療效。雖然在實(shí)際應(yīng)用中中藥的指紋圖譜還存在許多問(wèn)題，但中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當(dāng)前符合中藥特色的評(píng)價(jià)中藥真實(shí)性、穩(wěn)定性和一致性的質(zhì)量控制模式之一。目前HPLC(高效液相色譜)是中藥質(zhì)量控制常用的分析手段，我們認(rèn)為該方法能夠更好地保證中藥復(fù)雜體系的較好分離，因此以HPLC分析為基礎(chǔ)建立的中藥指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量分析，能夠更快速、更有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥整體物質(zhì)群的質(zhì)量檢測(cè)，將在中藥質(zhì)量控制中得到應(yīng)用。
[0004]白鶴靈芝別名癖草，為爵床科植物白鶴靈芝nasutus (L.) Lindau的干燥枝、葉，主產(chǎn)廣西、廣東、云南等地深山，是苗疆秘傳的珍貴藥材，因其功效有如靈芝，又花白色、唇型，生在葉腋或枝頂，形成群展飛翔的白鶴，故名“白鶴靈芝”，主入肺、肝、胃、大小腸諸經(jīng)，具有潤(rùn)肺止咳、平喘祛痰、清熱疏肝、利濕止癢、收斂止血等功效，用于治療肺熱燥咳、肺結(jié)核及受到風(fēng)寒時(shí)所產(chǎn)生的咳嗽等癥，還能夠治療鼻病、支氣管炎、喉炎、肝病等，被《中國(guó)壯藥原色圖譜》、《廣西中草藥》收載為特產(chǎn)藥材和民族壯藥。
[0005]目前對(duì)于白鶴靈芝的化學(xué)成分和藥理活性已經(jīng)進(jìn)行了較多的研究。白鶴靈芝中的化學(xué)成分主要含有糖、多糖、苷類、皂苷、有機(jī)酸、黃酮類香豆素、內(nèi)酯、植物留醇、三萜、揮發(fā)油、油脂等成分，可能無(wú)蒽醌、生物堿類成分。
[0006]有關(guān)對(duì)白鶴靈芝研究目前有一些公開(kāi)文獻(xiàn):1、【題名】白鶴靈芝化學(xué)成分基礎(chǔ)研究，【作者】謝麗莎楊廣才黃茂春【機(jī)構(gòu)】廣西中醫(yī)學(xué)院，【刊名】上海中醫(yī)藥雜志.2009，43(8).-75-77【文摘】目的通過(guò)對(duì)白鶴靈芝化學(xué)成分的分析，建立其成分含量測(cè)定的研究基礎(chǔ)。方法采用化學(xué)鑒別、光譜分析及比色法等方法，對(duì)白鶴靈芝的化學(xué)成分進(jìn)行分析及浸出物含量測(cè)定。結(jié)果白鶴靈芝中可能含有內(nèi)酯、香豆素類、植物留醇或三萜類以及酚類、氨基酸、有機(jī)酸、鞣質(zhì)等成分，無(wú)黃酮或黃酮苷類、生物堿等成分。白鶴靈芝藥材浸出物含量測(cè)定結(jié)果，熱水浸平均含量為(22.40±2.47) %；冷水浸平均含量為(17.11 ±2.00) 冷醇浸平均含量為(2.32±0.32) % ;熱醇浸平均含量為(5.53±1.12) %。結(jié)論白鶴靈芝化學(xué)成分的分析與其他成分含量的測(cè)定為深入研究白鶴靈芝提供了一定的科學(xué)依據(jù)。
[0007]2、【題名】白鶴靈芝的研究進(jìn)展，【作者】王乃平謝麗莎廖月葵葉繪晟楊廣才，【機(jī)構(gòu)】廣西中醫(yī)學(xué)院，【刊名】上海中醫(yī)藥雜志.2007，41 (4).-77-79，【文摘】通過(guò)查閱30多年來(lái)有關(guān)白鶴靈芝研究的文獻(xiàn)資料，總結(jié)了白鶴靈芝在本草考證、生藥鑒別、化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究現(xiàn)狀。目前對(duì)白鶴靈芝的研究主要集中在規(guī)范化種植(GAP)與質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)方面，但對(duì)白鶴靈芝的有效成分和指標(biāo)性成分方面的研究比較欠缺。對(duì)白鶴靈芝尚需進(jìn)行深入研究。
[0008]3、【題名】白鶴靈芝的生藥鑒定【作者】廖月葵[I]黃權(quán)芳[2]【機(jī)構(gòu)】[I]廣西中醫(yī)學(xué)院，[2]南寧培力保健食品有限公司【刊名】中草藥.2000，31 (9).-705-706【文摘】目的:為白鶴靈芝鑒別和開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。方法:顯微鑒定及紫外吸收光譜。結(jié)果:發(fā)現(xiàn)比較明顯的鑒別特征。結(jié)論:這些特征可作為鑒別白鶴靈芝的根據(jù)。
[0009]雖然上述文獻(xiàn)公開(kāi)了一些白鶴靈芝的檢測(cè)方法，但是全面檢測(cè)白鶴靈芝的有效成分，進(jìn)而達(dá)到質(zhì)量控制的方法，目前還沒(méi)有報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種白鶴靈芝藥材新的質(zhì)量檢測(cè)方法，包括白鶴靈芝指紋圖譜與指標(biāo)成分定量分析，使白鶴靈芝藥材的質(zhì)量控制技術(shù)更為科學(xué)、全面、保證其穩(wěn)定、均一、可控。
[0011]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)法案實(shí)現(xiàn)的:
白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，包括白鶴靈芝藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法和含量測(cè)定方法；其中指紋圖譜檢測(cè)方法是采用HPLC測(cè)定，它具有12個(gè)特征峰；含量測(cè)定方法是選取白鶴靈芝中提取分離得到的含量較高、具有代表性的成分并采用HPLC法測(cè)定，定量指標(biāo)為白鶴靈芝中分離提取的傘形花內(nèi)酯。
[0012]白鶴靈芝藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法由以下步驟組成:
(I)取白鶴靈芝樣品粉末(過(guò)40目篩)約5g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻。精密吸取續(xù)濾液25.0ml，置蒸發(fā)皿中，水浴鍋上揮干溶劑，用甲醇溶解置IOml容量瓶中，并定容至刻度線，待用。取上述樣品供試液約1ml，過(guò)0.22 μ I微孔濾膜，棄去粗濾液，作為供試品溶液。
[0013](2)色譜條件:色譜柱=XtimateTM C18 ;乙腈(A) -0.1%磷酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.5-1.2ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為280-320nm ;進(jìn)樣量為2-10 μ I。[0014](3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立:通過(guò)對(duì)若干批次，一般取6-8批次以上白鶴靈芝藥材HPLC指紋圖譜的測(cè)定，確定其共有指紋特征，并經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件擬合建立白鶴靈芝藥材的對(duì)照指紋圖譜。
[0015](4)指紋圖譜的質(zhì)量檢測(cè):將樣品的HPLC指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較。經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度不得小于0.8。
[0016]白鶴靈芝的含量測(cè)定方法由以下步驟組成:
(I)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取傘形花內(nèi)酯對(duì)照品5.0mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.200mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。
[0017](2)供試品溶液的制備:取白鶴靈芝樣品粉末約5g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50.0ml，稱定重量，回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻。精密吸取續(xù)濾液25.0ml，置蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦罥Oml容量瓶中，甲醇定容至刻度，待用。取上述樣品供試液約1ml，過(guò)0.22 μ I微孔濾膜，棄去粗濾液，備用。
[0018](3)色譜條件:色譜柱:XtimateTM C18柱(4.6X 250mm);流動(dòng)相:乙腈:0.1%磷酸水溶液(25:75);流速:0.8ml/min ;柱溫:25°C ;檢測(cè)器:二極管陳列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):318nm。
[0019](4)測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2?10μ 1，注入液相色譜，測(cè)定，記錄15min的色譜圖，即得。
[0020]白鶴靈芝藥材指紋圖譜檢測(cè)方法中，優(yōu)選的色譜條件為色譜柱=XtimateTM C18(4.6X 250mm);流動(dòng)相:乙腈(A) -0.1% 磷酸(B),梯度洗脫(Omin, 10%A ；30min, 60%A ；40min，100%A ；50min, 100%A);流速:1.0ml/min ;柱溫:室溫；檢測(cè)波長(zhǎng):318nm ;進(jìn)樣量:5 μ I。記錄15分鐘的色譜圖，即得到所需指紋圖譜。
[0021]白鶴靈芝指紋圖譜確定了 12個(gè)特征峰，按出峰時(shí)間先后順序進(jìn)行編號(hào)，歸屬了其中的I個(gè)特征峰，并以傘形花內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積；同時(shí)，采用國(guó)家藥典委員會(huì)編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004版)”用指紋圖譜軟件對(duì)所得圖譜進(jìn)行處理即得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0022]白鶴靈芝藥材的含量測(cè)定方法中，優(yōu)選的對(duì)照品溶液制備方法為:精密稱取傘形花內(nèi)酯對(duì)照品5.0mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.200mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。
[0023]白鶴靈芝藥材的含量測(cè)定波長(zhǎng)為:318nm檢測(cè)傘形花內(nèi)酯。
[0024]白鶴靈芝藥材的含量測(cè)定方法中，含量測(cè)定指標(biāo)可以在傘形花內(nèi)酯單一指標(biāo)的基礎(chǔ)上繼續(xù)增加。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
(I)研究表明，白鶴靈芝的多種藥理作用是其所含多種化學(xué)成分的“多靶點(diǎn)”綜合作用結(jié)果。本發(fā)明將白鶴靈芝指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合，能更有效地表征白鶴靈芝藥材的內(nèi)在質(zhì)量，提供一種全面評(píng)價(jià)白鶴靈芝藥材的科學(xué)方法，進(jìn)一步完善了白鶴靈芝的質(zhì)量控制體系。
[0026](2)本發(fā)明在國(guó)內(nèi)首次采用HPLC作為分析手段，對(duì)白鶴靈芝藥材的指紋圖譜方法進(jìn)行研究，方法分離效果好，效率高、更快速、更有效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)白鶴靈芝藥材整體的質(zhì)量控制。
[0027](3)本發(fā)明在國(guó)內(nèi)首次對(duì)白鶴靈芝藥材中傘形花內(nèi)酯含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)試驗(yàn)表明，本方法操作簡(jiǎn)便，所測(cè)得的多種成分分離度好，重現(xiàn)性，精密度，穩(wěn)定性，回收率均較好。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1、白鶴靈芝藥材在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的HPLC指紋圖譜(圖lA、198nm;圖1B、210nm ;圖 lC、318nm)；
圖2、318nm波長(zhǎng)下對(duì)照品色譜圖與白鶴靈芝藥材指紋圖譜(圖2A、傘形花內(nèi)酯；圖2B、白鶴靈芝藥材);
圖3、指紋圖譜精密度試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果圖；
圖4、指紋圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果圖；
圖5、指紋圖譜重復(fù)性試驗(yàn)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果圖；
圖6、不同產(chǎn)地白鶴靈芝藥材的HPLC指紋圖譜；
圖7、白鶴靈芝藥材HPLC指紋圖譜的共有模式圖；
圖8、白鶴靈芝藥材含量測(cè)定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖(圖8A、318nm測(cè)定的傘形花內(nèi)酯對(duì)照品圖譜；圖8B、318nm測(cè)定的白鶴靈芝藥材樣品圖譜)。
[0029]
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0031]以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。同時(shí)為了簡(jiǎn)單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的細(xì)節(jié)影響對(duì)本技術(shù)方案的描述。
[0032]實(shí)施例1白鶴靈芝藥材HPLC指紋圖譜的建立。
[0033]I儀器與試藥
1.1儀器
Agilentl200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司):含在線真空脫氣機(jī)(G-1322A)、高壓四元梯度泵(A-1311A)、標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器(G-1312A)、智能化柱溫箱(G-1316A)、全波長(zhǎng)檢測(cè)器(G-1313A)、Agilentl200色譜工作站(美國(guó)安捷倫科技有限公司)、二級(jí)管陣列檢測(cè)器。
[0034]1.2 試劑
甲醇、乙腈(美國(guó)Fisher科學(xué)試劑公司，色譜純);甲醇(廣東光華科技股份有限公司，分析純，批號(hào):21120116);95%乙醇(西隴化工股份有限公司，分析純，批號(hào):120427);乙酸乙酯(西隴化工股份有限公司，分析純，批號(hào):120401);氯仿(成都市科龍化工試劑廠，分析純，批號(hào):20120412);磷酸(廣東光華科技股份有限公司，分析純，批號(hào):20120215)，超純水，其他試劑均為分析純。
[0035]1.3對(duì)照品、藥材傘形花內(nèi)酯對(duì)照品為實(shí)驗(yàn)室自制，通過(guò)解析其MS、IH-NMR及13C-NMR數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)報(bào)道[11-14]的一致確定結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-3，TLC法驗(yàn)證其純度均為單一斑點(diǎn)，通過(guò)HPLC面積歸一化法檢測(cè)，其純度大于98%，4批白鶴靈芝分別采于廣西于廣東地區(qū)(表2-1)，3批同一產(chǎn)地不同種植的年份白鶴靈芝(表2-2)，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)副教授鑒定為爵床科白鶴靈芝屬植物白鶴靈芝的干燥葉,學(xué)名為TPAiflacafliAw1S ftaswiiAs (L.) Lindau。
[0036]2方法與結(jié)果
2.1溶液制備
2.1.1取白鶴靈芝樣品粉末約5g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50.0ml，稱定重量，回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻。精密吸取續(xù)濾液25.0ml，置蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦罥Oml容量瓶中，甲醇定容至刻度，待用。取上述樣品供試液約1ml，過(guò)0.22 μ I微孔濾膜，棄去粗濾液，備用，作為供試品溶液。
[0037]2.1.2精密稱取傘形花內(nèi)酯對(duì)照品5.0mg,置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.200mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。
[0038]2.2色譜條件
色譜柱:Xtimate? C18 (4.6 X 250mm)；
流動(dòng)相:乙腈(A) -0.1% 磷酸(B),梯度洗脫(Omin, 10%A ；30min,60%A ；40min, 100%A ；50min,100%A)；
流速:1.0ml/min ；
柱溫:室溫；
檢測(cè)波長(zhǎng):利用DAD檢測(cè)器對(duì)白鶴靈芝藥材供試品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(掃描圖省略)，從譜圖中選取318nm波長(zhǎng)處，分別得出其HPLC圖，見(jiàn)圖1。根據(jù)有效信息最大化原則選擇318nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，能較好地反應(yīng)圖譜中各個(gè)峰的吸收值。
[0039]2.3測(cè)定法:取對(duì)照品和供試品溶液各I μ 1，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。
[0040]2.4指紋圖譜的方法學(xué)考察
為了考察分析方法的可靠性，對(duì)指紋圖譜檢測(cè)方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性進(jìn)行考察，結(jié)果證明，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，能滿足指紋圖譜的要求。
[0041]2.4.1精密度試驗(yàn):取同一份供試品溶液，按擬定的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以傘形花內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的均低于3%，用相似度計(jì)算，將所得的指紋圖譜與其共有模式的相似度比較，相似度均大于0.99。見(jiàn)圖3。
[0042]2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一樣品溶液分別在0，2，4，8，24h按擬定的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以傘形花內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積均低于3%，用相似度計(jì)算，將所得的指紋圖譜與其共有模式的相似度比較，相似度均大于0.99。結(jié)果表明，白鶴靈芝藥材樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)圖4。
[0043]2.4.3重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)的供試品5份，按供試品溶液制備方法制備供試品，檢測(cè)指紋圖譜，記錄各色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。以傘形花內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積均低于3%，用相似度計(jì)算，將所得的指紋圖譜與其共有模式的相似度比較，相似度均大于0.99。見(jiàn)圖5。
[0044]2.5指紋圖譜的分析與評(píng)價(jià)
2.5.2共有指紋峰的標(biāo)定:取收集的不同產(chǎn)地的14批白鶴靈芝藥材(見(jiàn)表1)，按“供試品溶液”項(xiàng)下方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行分析。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，有10個(gè)峰是各批次共有的，可作為白鶴靈芝藥材的指紋特征峰，其中傘形花內(nèi)酯選作為參照峰，不同產(chǎn)地白鶴靈芝指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表2和表3。
[0045]表I白鶴靈芝藥材樣品來(lái)源
【權(quán)利要求】
1.一種白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:該方法包括白鶴靈芝藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法和含量測(cè)定方法；其中指紋圖譜檢測(cè)方法是采用HPLC測(cè)定，它具有12個(gè)特征峰；含量測(cè)定方法是選取白鶴靈芝中提取分離得到的含量較高、具有代表性的成分并采用HPLC法測(cè)定，定量指標(biāo)為白鶴靈芝中分離提取的傘形花內(nèi)酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述的指紋圖譜檢測(cè)方法包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:取白鶴靈芝樣品粉末，過(guò)40目篩，3-8g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50ml，稱定重量，回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，精密吸取續(xù)濾液25.0ml，置蒸發(fā)皿中，水浴鍋上揮干溶劑，用甲醇溶解置IOml容量瓶中，并定容至刻度線，待用，取上述樣品供試液約1ml，過(guò)0.22 μ I微孔濾膜，棄去粗濾液，作為供試品溶液； (2)色譜條件:色譜柱=XtimateTMC18 ;乙腈(A) -0.1%磷酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.5-1.2ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為280-320nm ;進(jìn)樣量為2-10 μ I ; (3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立:通過(guò)對(duì)5-10批次以上白鶴靈芝藥材HPLC指紋圖譜的測(cè)定，確定其共有指紋特征 ，并經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件擬合建立白鶴靈芝藥材的對(duì)照指紋圖譜； (4)指紋圖譜的質(zhì)量檢測(cè):將樣品的HPLC指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比較，經(jīng)中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度不得小于0.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述的含量測(cè)定方法由以下步驟組成: (1)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取傘形花內(nèi)酯對(duì)照品5.0mg，置于25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.200mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液； (2)供試品溶液的制備:取白鶴靈芝樣品粉末約5g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，精密加入甲醇50.0ml，稱定重量，回流提取30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，精密吸取續(xù)濾液25.0ml，置蒸發(fā)皿中，于水浴鍋上揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芙獠⒁浦罥Oml容量瓶中，甲醇定容至刻度，待用；取上述樣品供試液約1ml，過(guò)0.22 μ I微孔濾膜，棄去粗濾液，備用； (3)色譜條件:色譜柱=XtimateTMC18柱，4.6X250mm ;流動(dòng)相:乙腈:0.1%磷酸水溶液重量比例，25:75 ;流速:0.8ml/min ;柱溫:25°C ;檢測(cè)器:二極管陳列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):318nm ； (4)測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各2-10μ 1，注入液相色譜，測(cè)定，記錄15min的色譜圖，即得。
4.權(quán)利要求2所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述指紋圖譜檢測(cè)步驟(2)的色譜條件為色譜柱=XtimateTM C18 ;乙腈(A)-0.1%磷酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.5-1.2ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為280-320nm ;進(jìn)樣量2-10 μ I ;記錄50min的色譜圖，即得到所需指紋圖譜。
5.權(quán)利要求2所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(3)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立，確定了 11個(gè)特征峰，按出峰時(shí)間先后次序進(jìn)行編號(hào)，歸屬了 I個(gè)特征峰，為6號(hào)峰傘形花內(nèi)酯，以傘形花內(nèi)酯的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積；同時(shí)，采用國(guó)家藥典委員會(huì)編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，2004版”，用指紋圖譜軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行處理即得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(I)對(duì)照品溶液的制備，制成傘形花內(nèi)酯對(duì)照品溶液的濃度范圍為:傘形花內(nèi)酯:0.008-0.04mg.ml-1 ο
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的白鶴靈芝藥材的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(3)色譜條件，其中檢測(cè)波長(zhǎng)為:318nm傘形花內(nèi)酯。 ·
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103454359SQ201310427507
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】謝麗莎, 劉壽養(yǎng), 龔志強(qiáng), 黃茂春 申請(qǐng)人:廣西中醫(yī)藥大學(xué)