一種微流芯片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種微流芯片的制備方法，包括如下操作：掩膜制備操作：設(shè)計(jì)兩種掩膜，掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，其中，第一掩膜的感光區(qū)包括第一封閉圖形及與第一封閉圖形間隔一定距離的帶狀圖形，第二掩膜的感光區(qū)包括在第一封閉圖形的基礎(chǔ)上平行擴(kuò)大至與帶狀圖形相連形成的第二封閉圖形以及帶狀圖形；另外還包括第一刻蝕操作和第二刻蝕操作以及鍵合操作。根據(jù)本發(fā)明方法得到的芯片能夠有效分選腫瘤細(xì)胞，并且在捕獲腫瘤細(xì)胞后對(duì)其進(jìn)行直接分析。
【專利說明】一種微流芯片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微流芯片的制備方法，尤其涉及一種用于捕獲腫瘤細(xì)胞的微流芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]循環(huán)腫瘤細(xì)胞通常是指來自于原發(fā)腫瘤組織，經(jīng)脫落和浸染而進(jìn)入人體外周血的細(xì)胞，在循環(huán)細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中能夠在不同的組織上寄居，并且可以在許多轉(zhuǎn)移后的固相腫瘤上發(fā)現(xiàn)，因而循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以作為早期腫瘤診斷的重要標(biāo)志。另外循環(huán)腫瘤細(xì)胞在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中也起到重要作用。因此，對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞生理機(jī)制的研究具有非常重要的意義。然而循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目及其在人體外周血中的絕對(duì)濃度非常低，使得針對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究變得非常困難，因此對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分選和捕獲是一個(gè)重要的研究課題。
[0003]目前，常用的細(xì)胞分選技術(shù)是流式細(xì)胞術(shù)，但是該技術(shù)使用的設(shè)備昂貴、體積龐大、需要專業(yè)人員進(jìn)行操作，而且細(xì)胞的用量較大，難以在實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院普及推廣。微流芯片技術(shù)具有微型化、集成化、自動(dòng)化和細(xì)胞試劑用量少、污染風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)點(diǎn)。近期，在微流芯片中使用較多的腫瘤細(xì)胞捕獲方法是利用針對(duì)某些腫瘤細(xì)胞中上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)的特異性表達(dá)進(jìn)行特異性分選。該方法先對(duì)基底材料進(jìn)行特定的表面處理使之具有納米結(jié)構(gòu)，然后進(jìn)行表面化學(xué)修飾將Ant1-EpCAM抗體偶聯(lián)到基底上來捕獲腫瘤細(xì)胞。但是EpCAM作為一種上皮細(xì)胞表面標(biāo)記物，在不同類型的腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)程度不同，其使用受到腫瘤細(xì)胞種類的限制。另外，對(duì)于基底的化學(xué)修飾步驟繁瑣耗時(shí)，增加了不確定因素干擾試驗(yàn)的成功率。另外還有通過操控聲表面波的駐波，利用聲輻射力來直接操控腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分選和捕獲；采用介電泳的方法，利用電介質(zhì)粒子在不均勻電場中受力的不同對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和捕獲，但是這些方法都不可避免的對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生不良影響。另外，應(yīng)用目前微流芯片的制備方法得到的芯片，在捕獲腫瘤細(xì)胞后，缺乏在芯片上分析細(xì)胞的能力，需要轉(zhuǎn)移至離心管后才能進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，該轉(zhuǎn)移過程不易做到并且會(huì)造成大量細(xì)胞損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為此，本發(fā)明提出了一種可以解決上述問題的或至少能部分解決上述問題的一種微流芯片的制備方法。
[0005]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了 一種微流芯片的制備方法，該方法包括如下操作:
[0006]掩膜制備操作:設(shè)計(jì)兩種掩膜，在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，其中，
[0007]第一掩膜的感光區(qū)包括第一封閉圖形及與所述第一封閉圖形間隔一定距離的帶狀圖形，第二掩膜的感光區(qū)包括在所述第一封閉圖形的基礎(chǔ)上平行擴(kuò)大至與所述帶狀圖形相連形成的第二封閉圖形以及所述帶狀圖形；
[0008]第一刻蝕操作:將第一掩膜置于玻璃鉻板上進(jìn)行第一次刻蝕，形成高度為15?25um的凹陷部和溝道；
[0009]第二刻蝕操作:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成高度為25?35um的凹陷部和溝道以及高度為15?25um的隔擋部，得到基片；
[0010]鍵合操作:將所述基片與蓋片進(jìn)行鍵合。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的制備方法得到的微流芯片，由于形成的凹陷部作為捕獲腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，其中隔擋部頂端和基片以及隔擋部頂端與凹陷部的底部具有一定距離，形成一個(gè)相對(duì)的微臺(tái)階結(jié)構(gòu)，這樣將尺寸較大的腫瘤細(xì)胞(一般在25?35um)攔截在捕獲區(qū)，而尺寸較小的血細(xì)胞(一般在15?25um)通過隔擋部上部以及溝道流出，因此可以在捕獲區(qū)有效地分選到大部分的腫瘤細(xì)胞。該芯片操作簡便，被捕獲的細(xì)胞可保持良好的活性，透明地玻璃基底便于對(duì)捕獲的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)的原位觀測。對(duì)于被捕獲與固定在芯片中的腫瘤細(xì)胞可進(jìn)行一系列的后續(xù)試驗(yàn)，如免疫熒光染色、熒光原位雜交等，應(yīng)用該方法制備得到的芯片在與細(xì)胞相關(guān)的研究和臨床領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用潛力。其中，在制備掩膜時(shí)主要是利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)掩膜圖形，采用高分辨率的激光照排機(jī)在膠片上制得掩膜。一般在第二刻蝕操作完成后，需要再次放入去鉻液中對(duì)刻蝕完的玻璃鉻板進(jìn)行除鉻，去除裸露的鉻層。在鍵合操作中，是將刻蝕有微結(jié)構(gòu)的玻璃基片與聚二甲基硅氧烷層經(jīng)過氧等離子處理后使聚二甲基硅氧烷層與玻璃基片鍵合在一起。
[0012]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中在第一掩膜和第二掩膜中包括至少一個(gè)帶狀圖形。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的制備方法，在第一掩膜和第二掩膜上的帶狀圖形，在進(jìn)行刻蝕后，形成溝道，當(dāng)具有一條帶狀圖形時(shí)，形成一個(gè)溝道，這樣小分子細(xì)胞可以集中流出，當(dāng)選擇多條帶狀圖形時(shí)，小分子細(xì)胞流出更加順暢。
[0014]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形，所述環(huán)狀封閉圖形與所述帶狀圖形連接。
[0015]當(dāng)掩膜中設(shè)計(jì)有帶狀圖形連接的封閉圖形時(shí)，進(jìn)行刻蝕后，形成不同的溝道，帶狀圖形形成的溝道中的流出的小分子可以流入封閉圖形刻蝕形成的溝道中，這樣更利于小分子細(xì)胞集中輸送至出口，更有利于小分子細(xì)胞集中輸出。
[0016]可選地,根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中在第一掩膜的第一封閉圖形及第二掩膜的第二封閉圖形中均包括用于形成微柱的非感光單元。
[0017]在第一掩膜和第二掩膜的封閉圖形中設(shè)置非感光單元，刻蝕以后在凹陷部和隔擋部形成微柱陣列，形成的微柱陣列可以支撐蓋板，保證隔擋部和蓋板之間的距離，保證了小分子通過的通道距離，有效篩選小分子。
[0018]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，在第一刻蝕操作和第二刻蝕操作包括光刻步驟和腐蝕步驟。
[0019]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，在第一刻蝕操作的光刻步驟中，
[0020]將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光9?IOs ；
[0021]將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.4?0.6%的NaOH水溶液中顯影25?35s ；[0022]將顯影后的玻璃鉻板在100~120°C烘烤8~12分鐘；
[0023]將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40~60s。
[0024]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中在第二刻蝕步驟的光刻操作中，
[0025]在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠；
[0026]將第二掩膜鋪設(shè)在所述玻璃鉻板上后曝光14~16s ；
[0027]將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影I~2分鐘；
[0028]將顯影后的玻璃鉻板在115~125°C烘烤8~12分鐘；
[0029]將烘干的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40~60s。
[0030]在第二次刻蝕時(shí)，選用了 AZ5214正光刻膠，可以保證在腐蝕的過程中，使非感光區(qū)的鉻層不被腐蝕掉。其中所述顯影過程是在AZ5214顯影液中進(jìn)行的，其中AZ5214顯影液的主要成份為2.38%的四甲基氫氧化銨。
[0031]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中所述去鉻液是由25g硝酸鈰銨、6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成。
[0032]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，
[0033]在第一刻蝕步驟的腐蝕步驟中，在腐蝕液中腐蝕15~25分鐘；
[0034]在第二刻蝕步驟的腐蝕步驟中，在腐蝕液中腐蝕8~13分鐘；
[0035]所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5 的 Smoir1HF ^moir1NH4F ^moir1HNO3 溶液配成。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的方法，利用所述腐蝕液，其腐蝕速度可以控制在I U m/min,因此根據(jù)腐蝕速度，可以控制腐蝕時(shí)間以及腐蝕深度。
[0037]可選地，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，其中，所述蓋片是在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75~85°C烘烤2h固化后制備得到。
[0038]含有聚甲基硅氧烷層玻璃板作為基片具有的兩個(gè)缺點(diǎn):一是聚甲基硅氧烷疏水，容易出現(xiàn)氣泡；二是聚甲基硅氧烷屬于彈性材料，制備的溝道容易變形，以含有聚甲基硅氧烷層的玻璃板為蓋片，以玻璃板為基片，可以克服此缺點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]通過閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號(hào)表示相同的部件。其中在附圖中，參考數(shù)字之后的字母標(biāo)記指示多個(gè)相同的部件，當(dāng)泛指這些部件時(shí)，將省略其最后的字母標(biāo)記。在附圖中:
[0040]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的微流芯片制備方法的流程圖；
[0041]圖2示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的第一掩膜示意圖；
[0042]圖3示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的第二掩膜示意圖；
[0043]圖4示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的第一刻蝕流程示意圖；
[0044]圖5示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的第一刻蝕操作后的玻璃鉻板截面示意圖；
[0045]圖6示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的第二刻蝕操作后的玻璃鉻板截面示意圖；
[0046]圖7示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的微流芯片截面圖；.[0047]圖8示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的微流芯片示意圖；
[0048]圖9示出了根據(jù)本發(fā)明一種實(shí)施方式的微流芯片捕獲腫瘤細(xì)胞示意圖；
[0049]圖10示出了根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的微流芯片捕獲腫瘤細(xì)胞的顯微鏡圖；
[0050]圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的微流芯片捕獲MCF-7乳腺癌細(xì)胞效果圖；
[0051]圖12示出了對(duì)根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的微流芯片捕獲到MCF-7乳腺癌細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行FDA/PI染色的效果圖；
[0052]圖13示出了利用根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的微流芯片對(duì)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的分選效果圖
[0053]其中附圖標(biāo)記所示為:
[0054]第一掩膜的感光區(qū)100、第一封閉圖形101、帶狀圖形102、環(huán)狀封閉圖形103、第二掩膜的感光區(qū)200、第二封閉圖形201、非感光單元300、玻璃鉻板400、光刻膠層401、鉻層402和玻璃層403、蓋片600、出口 602、入口 601、基片500、凹陷部501、隔擋部502、溝道503。
【具體實(shí)施方式】
[0055]本發(fā)明提供了許多可應(yīng)用的創(chuàng)造性概念，該創(chuàng)造性概念可大量的體現(xiàn)于具體的上下文中。在下述本發(fā)明實(shí)施方式中描述的實(shí)施例僅作為本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)方式的示例性說明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0056]根據(jù)圖1示出的本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式微流芯片的制備方法，首先進(jìn)入掩膜制備操作SllOO:設(shè)計(jì)兩種掩膜，在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，其中，第一掩膜的感光區(qū)100包括封閉圖形101及與封閉圖形101間隔一定距離的帶狀圖形102，在第一掩膜的基礎(chǔ)上將封閉圖形101平行擴(kuò)大至與帶狀圖102形相連，形成第二掩膜的感光區(qū)200 ;之后進(jìn)入第一刻蝕操作S1200:將第一掩膜置于玻璃鉻板400上進(jìn)行第一次刻蝕，形成高度為15?25um的凹陷部和溝道；將進(jìn)行第一次刻蝕后的玻璃鉻板進(jìn)入第二刻蝕操作S1300:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成高度為25?35um的凹陷部501和溝道503以及高度為15?25um的隔擋部502，得到基片500 ;最后將得到的基片500進(jìn)入鍵合操作S1400:將所述基片500與蓋片600進(jìn)行鍵合，至此S1400操作結(jié)束，微流芯片的制備完成。
[0057]根據(jù)本發(fā)明微流芯片的制備方法，其中第一掩膜和第二掩膜優(yōu)選包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接；在第一掩膜的第一封閉圖形101及第二掩膜的第二封閉圖形201中優(yōu)選包括用于形成微柱的非感光單元300。在第一刻蝕操作S1200和第二刻蝕操作S1300包括光刻步驟和腐蝕步驟；在第一刻蝕操作S1200的光刻過程中，將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板400曝光9?10s，將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.4?
0.6%的NaOH水溶液中顯影25?35s，將顯影后的玻璃鉻板在100?120°C烘干8?12分鐘，將烘干后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40?60s。在第二刻蝕步驟S1200的光刻操作中，在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠后曝光14?16s，將曝光后的玻璃鉻板用AZ顯影液顯影I?2分鐘，將顯影后的玻璃鉻板在115?125°C烘干8?12分鐘，將烘干的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40~60s。其中去鉻液是由25g硝酸鈰銨、6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成。其中，在第一刻蝕操作S1200的腐蝕步驟中在腐蝕液中腐蝕15~25分鐘；在第二刻蝕步驟S1300的腐蝕操作中在腐蝕液中腐蝕8~13分鐘，腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Zmoir1HF moir1NH4F moir1HNO3溶液配成。其中，蓋片優(yōu)選在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75~85°C烘烤2h固化后制備得到。
[0058]本發(fā)明微流芯片的制備方法涉及參數(shù)較多，因此具體的實(shí)施例僅作為對(duì)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)方式的示例性說明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。下面將以本發(fā)明提供微流芯片的制備方法的具體操作過程作為實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述。
[0059]根據(jù)本發(fā)明微流芯片制備方法的工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)出以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性說明。
[0060]實(shí)施例1
[0061]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式微流芯片的制備方法，首先進(jìn)入掩膜制備操作SllOO:利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)兩種掩膜，采用高分辨率的激光照排機(jī)在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，如圖2示出的第一掩膜的示意圖，其中第一掩膜的感光區(qū)100包括第一封閉圖形101及與封閉圖形101間隔一定距離的帶狀圖形102，第一掩膜還包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，其中在封閉圖形103中包括了用于形成微柱的非感光單元300 ;如圖3示出的第二掩膜的示意圖，在第一掩膜的基礎(chǔ)上將封閉圖形101平行擴(kuò)大至與帶狀圖形102相連，形成第二掩膜的第二封閉圖形201，第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，在第二掩膜的第二封閉圖形201中包括用于形成微柱的非感光單元300 ;之后進(jìn)入第一刻蝕操作S1200:將第一掩膜置于玻璃鉻板400上進(jìn)行第一次刻蝕，形成如圖5示出的高度為15um的凹陷部501和溝道503，在第一刻蝕操作步驟包括光刻步驟和腐蝕步驟，其中在第一刻蝕操作S1200的光刻操作中，如圖4的光刻流程圖所示，將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光9s，所述玻璃鉻板400包括光刻膠層401、鉻層402和玻璃層403，將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.4%的NaOH水溶液中顯影25s，之后用水沖洗掉多余的顯影液，將顯影后的玻璃鉻板在100°C烘干8分鐘，在去鉻液中浸泡40s，其中去鉻液是由25g硝酸鈰銨、
6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成，將去鉻后的玻璃鉻板放入腐蝕液中腐蝕15分鐘，其中腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的2moir1HF moir1NH4F moir1HNO3溶液配成。將進(jìn)行第一次刻蝕后的玻璃鉻板進(jìn)入第二刻蝕操作S1300:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成如圖6示出的高度為23um的凹陷部501和溝道503以及高度為15um的隔擋部502，得到基片500，在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠；將第二掩膜鋪設(shè)在玻璃鉻板上曝光14s，將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影I分鐘，將顯影后的玻璃鉻板在115°C烘烤8分鐘，將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40s，然后將去鉻的玻璃鉻板在腐蝕液中腐蝕8分鐘，所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Smoir1HF moir1NH4 Jmoir1HNO3溶液配成；最后將得到的基片進(jìn)入鍵合操作S1400:將所述基片500與蓋片600進(jìn)行鍵合，蓋片600優(yōu)選在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75°C烘烤2h固化后制備得到的蓋片600 ;至此S1400操作結(jié)束，微流芯片的制備完成?
[0062]制備得到的微流芯片如圖7所示，包括蓋片600和基片500，其中所述蓋片600包括入口 602和出口 601，所述基片500包括凹陷部501、隔擋部502和溝道503，其中懸浮液從入口 602注入，直徑較大的腫瘤細(xì)胞截留在凹陷部501中，小分子的血細(xì)胞通過隔擋部與蓋片之間的空隙處進(jìn)入溝道503，并從出口 601處流出。
[0063]實(shí)施例2
[0064]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式微流芯片的制備方法，首先進(jìn)入掩膜制備操作SllOO:利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)兩種掩膜，采用高分辨率的激光照排機(jī)在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，如圖2示出的第一掩膜的示意圖，其中第一掩膜的感光區(qū)100包括第一封閉圖形101及與封閉圖形101間隔一定距離的帶狀圖形102，第一掩膜還包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，其中在封閉圖形103中包括了用于形成微柱的非感光單元300 ;如圖3示出的第二掩膜的示意圖，在第一掩膜的基礎(chǔ)上將封閉圖形101平行擴(kuò)大至與帶狀圖形102相連，形成第二掩膜的第二封閉圖形201，第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，在第二掩膜的第二封閉圖形201中包括用于形成微柱的非感光單元300 ;之后進(jìn)入第一刻蝕操作S1200:將第一掩膜置于玻璃鉻板400上進(jìn)行第一次刻蝕，形成如圖5示出的高度25um的凹陷部501和溝道503，在第一刻蝕操作步驟包括光刻步驟和腐蝕步驟，其中在第一刻蝕操作S1200的光刻操作中，如圖4的光刻流程圖所示，將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光10s，所述玻璃鉻板400包括光刻膠層401、鉻層402和玻璃層403，將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.6%的NaOH水溶液中顯影35s，之后用水沖洗掉多余的顯影液，將顯影后的玻璃鉻板在120°C烘干12分鐘，在去鉻液中浸泡60s，其中去鉻液是由25g硝酸鈰銨、
6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成，將去鉻后的玻璃鉻板放入腐蝕液中腐蝕25分鐘，其中腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的2moir1HF-moir1NH4F moir1HNO3溶液配成。將進(jìn)行第一次刻蝕后的玻璃鉻板進(jìn)入第二刻蝕操作S1300:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成如圖6示出的高度為38um的凹陷部501和溝道503以及高度為25um的隔擋部502，得到基片500，在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠；將第二掩膜鋪設(shè)在玻璃鉻板上曝光16s，將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影2分鐘，將顯影后的玻璃鉻板在125°C烘烤12分鐘，將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡60s，然后將去鉻的玻璃鉻板在腐蝕液中腐蝕13分鐘，所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Zmoir1HF moir1NH4F Jmoir1HNO3溶液配成；最后將得到的基片進(jìn)入鍵合操作S1400:將所述基片500與蓋片600進(jìn)行鍵合，蓋片600優(yōu)選在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75°C烘烤2h固化后制備得到的蓋片600 ;至此S1400操作結(jié)束，微流芯片的制備完成?
[0065]制備得到的微流芯片如圖7所示，包括蓋片600和基片500，其中所述蓋片600包括入口 602和出口 601，所述基片500包括凹陷部501、隔擋部502和溝道503，其中懸浮液從入口 602注入，直徑較大的腫瘤細(xì)胞截留在凹陷部501中，小分子的血細(xì)胞通過隔擋部與蓋片之間的空隙處進(jìn)入溝道503，并從出口 601處流出。`
[0066]實(shí)施例3
[0067]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式微流芯片的制備方法，首先進(jìn)入掩膜制備操作SllOO:利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)兩種掩膜，采用高分辨率的激光照排機(jī)在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，如圖2示出的第一掩膜的示意圖，其中第一掩膜的感光區(qū)100包括第一封閉圖形101及與封閉圖形101間隔一定距離的帶狀圖形102，第一掩膜還包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，其中在封閉圖形103中包括了用于形成微柱的非感光單元300 ;如圖3示出的第二掩膜的示意圖，在第一掩膜的基礎(chǔ)上將封閉圖形101平行擴(kuò)大至與帶狀圖形102相連，形成第二掩膜的第二封閉圖形201，第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，在第二掩膜的第二封閉圖形201中包括用于形成微柱的非感光單元300 ;之后進(jìn)入第一刻蝕操作S1200:將第一掩膜置于玻璃鉻板400上進(jìn)行第一次刻蝕，形成如圖5示出的高度為20um的凹陷部501和溝道503，在第一刻蝕操作步驟包括光刻步驟和腐蝕步驟，其中在第一刻蝕操作S1200的光刻操作中，如圖4的光刻流程圖所示，將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光10s，所述玻璃鉻板400包括光刻膠層401、鉻層402和玻璃層403，將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.5%的NaOH水溶液中顯影30s，之后用水沖洗掉多余的顯影液，將顯影后的玻璃鉻板在110°C烘干10分鐘，在去鉻液中浸泡50s，其中去鉻液是由25g硝酸鈰銨、
6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成，將去鉻后的玻璃鉻板放入腐蝕液中腐蝕20分鐘，其中腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的2moir1HF moir1NH4F moir1HNO3溶液配成。將進(jìn)行第一次刻蝕后的玻璃鉻板進(jìn)入第二刻蝕操作S1300:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成如圖6示出的高度為30um的凹陷部501和溝道503以及高度為20um的隔擋部502，得到基片500，在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠；將第二掩膜鋪設(shè)在玻璃鉻板上曝光15s，將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影1.5分鐘，將顯影后的玻璃鉻板在120°C烘烤10分鐘，將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡50s，然后將去鉻的玻璃鉻板在腐蝕液中腐蝕10分鐘，所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Smoir1HF moir1NH4F Jmoir1HNO3溶液配成；最后將得到的基片進(jìn)入鍵合操作S1400:將所述基片500與蓋片600進(jìn)行鍵合，蓋片600優(yōu)選在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75°C烘烤2h固化后制備得到的蓋片600 ;至此S1400操作結(jié)束，微流芯片的制備完成?
[0068]制備得到的微流芯片如圖7所示，包括蓋片600和基片500，其中所述蓋片600包括入口 602和出口 601，所述基片500包括凹陷部501、隔擋部502和溝道503，其中懸浮液從入口 602注入，直徑較大的腫瘤細(xì)胞截留在凹陷部501中，小分子的血細(xì)胞通過隔擋部與蓋片之間的空隙處進(jìn)入溝道503，并從出口 601處流出。
[0069]實(shí)施例4
[0070]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式微流芯片的制備方法，首先進(jìn)入掩膜制備操作SllOO:利用CorelDraw軟件設(shè)計(jì)兩種掩膜，采用高分辨率的激光照排機(jī)在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，如圖2示出的第一掩膜的示意圖，其中第一掩膜的感光區(qū)100包括第一封閉圖形101及與封閉圖形101間隔一定距離的帶狀圖形102，第一掩膜還包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，其中在封閉圖形103中包括了用于形成微柱的非感光單元300 ;如圖3示出的第二掩膜的示意圖，在第一掩膜的基礎(chǔ)上將封閉圖形101平行擴(kuò)大至與帶狀圖形102相連，形成第二掩膜的第二封閉圖形201，第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形103，環(huán)狀封閉圖形103與帶狀圖形102連接，在第二掩膜的第二封閉圖形201中包括用于形成微柱的非感光單元300 ;之后進(jìn)入第一刻蝕操作S1200:將第一掩膜置于玻璃鉻板400上進(jìn)行第一次刻蝕，形成如圖5示出的高度為22um的凹陷部501和溝道503，在第一刻蝕操作步驟包括光刻步驟和腐蝕步驟，其中在第一刻蝕操作S1200的光刻操作中，如圖4的光刻流程圖所示，將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光9s，所述玻璃鉻板400包括光刻膠層401、鉻層402和玻璃層403，將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.5%的NaOH水溶液中顯影28s，之后用水沖洗掉多余的顯影液，將顯影后的玻璃鉻板在115°C烘干11分鐘，在去鉻液中浸泡45s，其中去鉻液是由25g硝酸鈰銨、
6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中所配成，將去鉻后的玻璃鉻板放入腐蝕液中腐蝕23分鐘，其中腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的2moir1HF 2moir1NH4F 2moir1HNO3溶液配成。將進(jìn)行第一次刻蝕后的玻璃鉻板進(jìn)入第二刻蝕操作S1300:在玻璃鉻板上放置第一掩膜的位置處放置第二掩膜后進(jìn)行第二次刻蝕，形成如圖6示出的高度為33um的凹陷部501和溝道503以及高度為22um的隔擋部502，得到基片500，在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠；將第二掩膜鋪設(shè)在玻璃鉻板上曝光15s，將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影2分鐘，將顯影后的玻璃鉻板在120°C烘烤11分鐘，將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡50s，然后將去鉻的玻璃鉻板在腐蝕液中腐蝕10分鐘，所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Zmoir1HF ;2moir1NH4F Jmoir1HNO3溶液配成；最后將得到的基片進(jìn)入鍵合操作S1400:將所述基片500與蓋片600進(jìn)行鍵合，蓋片600優(yōu)選在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在80°C烘烤2h固化后制備得到的蓋片600 ;至此S1400操作結(jié)束，微流芯片的制備完成?
[0071]制備得到的微流芯片如圖7所示，包括蓋片600和基片500，其中所述蓋片600包括入口 602和出口 601，所述基片500包括凹陷部501、隔擋部502和溝道503，其中懸浮液從入口 602注入，直徑較大的腫瘤細(xì)胞截留在凹陷部501中，小分子的血細(xì)胞通過隔擋部與蓋片之間的空隙處進(jìn)入溝道503，并從出口 601處流出。
[0072]根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1-4中微流芯片制備方法得到的微流芯片，能夠簡便有效地捕獲懸浮于磷酸鹽緩沖鹽溶液中的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)芯片的透明玻璃基底便于對(duì)捕獲的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)原位觀測；被捕獲的細(xì)胞可保持良好的活性，被捕獲與固定在芯片中的細(xì)胞可進(jìn)行一系列后續(xù)實(shí)驗(yàn)；制備得到的微流芯片對(duì)不同尺寸的細(xì)胞能夠進(jìn)行有效地分選。
[0073]通過圖9示出的腫瘤細(xì)胞的捕獲原理圖也可以看出，直徑較大的細(xì)胞被捕獲到凹陷部501，直徑較小的血細(xì)胞則從溝道503流出。
[0074]另外，選用實(shí)施例3制備得到的微流芯片，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲和分選實(shí)驗(yàn)，并對(duì)捕獲得到的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了染色實(shí)驗(yàn)。
[0075]通過圖10示出的根據(jù)本發(fā)明微流芯片的腫瘤細(xì)胞的捕獲效果圖可以看出，大分子的腫瘤細(xì)胞被阻擋在凹陷部501內(nèi)被捕獲，小分子的細(xì)胞流出。
[0076]通過圖11示出的利用本發(fā)明微流芯片對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的捕獲效果非常明顯。
[0077]通過圖12示出的對(duì)微流芯片捕獲得到的MCF-7細(xì)胞懸浮液進(jìn)行FDA/PI染色的圖片中可以看出，捕獲得到的腫瘤細(xì)胞發(fā)射出強(qiáng)烈的黃綠色且只有極少數(shù)的橘紅色，表明其具有良好的活性。
[0078]通過圖13可以直觀地看出腫瘤細(xì)胞被捕獲，而紅細(xì)胞快速地通過捕獲區(qū)并溜走，說明根據(jù)本發(fā)明的微流芯片對(duì)不同尺寸的細(xì)胞具有良好的分選作用。
[0079]應(yīng)該注意的是，上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離所附權(quán)利要求范圍的情況下可設(shè)計(jì)出替換實(shí)施例。在權(quán)利要求中，不應(yīng)將位于括號(hào)之間的任何參考符號(hào)構(gòu)造成對(duì)權(quán)利要求的限制。單詞“包含”不排除存在未列在權(quán)利要求中的元件或步驟。
【權(quán)利要求】
1.一種微流芯片的制備方法，該方法包括如下操作: 掩膜制備操作(SllOO):設(shè)計(jì)兩種掩膜，在膠片上制備相應(yīng)的掩膜，所述掩膜包括感光區(qū)和非感光區(qū)，其中， 第一掩膜的感光區(qū)(100)包括第一封閉圖形(101)及與所述第一封閉圖形(101)間隔一定距離的帶狀圖形(102)，第二掩膜的感光區(qū)(200)包括在所述第一封閉圖形(101)的基礎(chǔ)上平行擴(kuò)大至與所述帶狀圖形(102)相連形成的第二封閉圖形(201)以及所述帶狀圖形(102)；第一刻蝕操作(S1200):將第一掩膜置于玻璃鉻板上，對(duì)玻璃鉻板進(jìn)行第一次刻蝕，形成高度為15~25um的凹陷部和溝道； 第二刻蝕操作(S1300):在玻璃鉻板上與第一掩膜位置重合處放置第二掩膜后對(duì)玻璃鉻板進(jìn)行第二次刻蝕，形成高度為25~35um的凹陷部和溝道以及高度為15~25um的隔擋部，得到基片； 鍵合操作(S1400):將所述基片與蓋片進(jìn)行鍵合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中在第一掩膜的感光區(qū)(100)和第二掩膜的感光區(qū)(200)中包括至少一個(gè)所述帶狀圖形(102)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述第一掩膜和所述第二掩膜進(jìn)一步地包括環(huán)狀封閉圖形(103)，所述環(huán)狀封閉圖形(103)與所述帶狀圖形(102)連接。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中在第一掩膜感光區(qū)(100)的第一封閉圖形(101)及第二掩膜的第二封閉圖形(201)中均包括用于形成微柱的非感光單元(300)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，在第一刻蝕操作(S1200)和第二刻蝕操作(S1300)包括光刻步驟和腐蝕步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中在第一刻蝕操作(S1200)的光刻步驟中， 將鋪設(shè)第一掩膜的玻璃鉻板曝光9~IOs ； 將曝光后的玻璃鉻板在質(zhì)量百分比為0.4~0.6%的NaOH水溶液中顯影25~35s ； 將顯影后的玻璃鉻板在100~120°C烘烤8~12分鐘； 將烘烤后的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40~60s。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中在第二刻蝕操作(S1300)的光刻步驟中， 在第一次刻蝕的玻璃鉻板上鋪設(shè)AZ5214正光刻膠； 將第二掩膜鋪設(shè)在所述玻璃鉻板上后曝光14~16s ； 將曝光后的玻璃鉻板在顯影液中顯影I~2分鐘； 將顯影后的玻璃鉻板在115~125°C烘烤8~12分鐘； 將烘干的玻璃鉻板在去鉻液中浸泡40~60s。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其中所述去鉻液是由25g硝酸鈰銨、6.45mL濃度為70%的高氯酸溶于IlOmL蒸餾水中配成。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中， 在第一刻蝕操作(S1200)的腐蝕步驟中，在腐蝕液中腐蝕15~25分鐘； 在第二刻蝕操作(S1300)的腐蝕步驟中，在腐蝕液中腐蝕8~13分鐘； 所述腐蝕液由體積比為1:0.5:0.5的Zmoir1HF moir1NH4F moir1HNO3溶液配成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中，所述蓋片是在玻璃板上澆注聚甲基硅氧烷，在75~85°C烘烤2h固化后制備得到。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK103447101SQ201310310907
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月23日
【發(fā)明者】劉威, 劉侃, 張南剛, 國世上, 周鵬飛 申請(qǐng)人:武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司