專利名稱：一種測定食品釀造谷物類原料結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定食品釀造谷物類原料香氣物質(zhì)的方法，特別是一種結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
在中國傳統(tǒng)釀造產(chǎn)品中，例如白酒、醋、醬油等，其獨(dú)特的風(fēng)味被認(rèn)為是特有微生物的作用，其風(fēng)味的研究主要集中在原酒、成品酒以及大曲、酒醅上，卻缺少了原料分析這一方面。古人云:水，酒之血；曲，酒之骨；糧，酒之肉。足以看出糧食原料的重要性，糧食原料除了提供微生物生長所需的能量外，其自身香氣物質(zhì)不容忽視。香氣物質(zhì)分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種存在形式，只有游離態(tài)的才具有香氣效果，結(jié)合態(tài)的需要釋放變?yōu)橛坞x態(tài)才是有效的香氣物質(zhì)，而結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)可達(dá)游離態(tài)香氣物質(zhì)的8倍，因此結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的研究是重中之重。目前原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的研究并不清楚，方法的限制是一個(gè)重要的原因，因此需要建立方法去深入研究原料中香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)。關(guān)于谷物類糧食的香氣物質(zhì)有相關(guān)學(xué)者進(jìn)行過研究:楊潔等人通過100°C水浴加熱的方法研究過大米中的香氣物質(zhì)；金邦荃等人將玉米速凍研磨后研究速凍甜玉米的香氣物質(zhì)；練順才等人也研究過高粱蒸煮時(shí)產(chǎn)生的香氣。但是上述的研究并沒有考慮當(dāng)糧食作為釀造原料時(shí)對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的貢獻(xiàn)，僅僅是對(duì)全部香氣物質(zhì)的檢測，更沒有將香氣物質(zhì)分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的物質(zhì)。在果酒尤其是葡萄酒的研究中，果實(shí)自身的香氣物質(zhì)占了很大一部分，結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的主要的提取方法就是將水果榨汁后，通過樹脂柱的吸附作用將糖苷類物質(zhì)吸附，然后再用洗脫劑洗脫得到結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的前體，經(jīng)水解之后香氣物質(zhì)得以釋放。但是，干態(tài)類原料無法榨汁，因此上述方法不適合對(duì)干態(tài)類原料結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體的提取，需要探索新的 方法。本專利的發(fā)明，提供了一種提取釀造谷物類原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的提取方法。該方法不是直接去檢測無風(fēng)味的結(jié)合態(tài)香氣前體物質(zhì)，而是通過水解處理使結(jié)合態(tài)的香氣物質(zhì)以游離態(tài)的形式釋放出來。本方法的建立，使得原料香氣物質(zhì)分析的體系更加完善，能夠抓住關(guān)鍵的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)進(jìn)行分析，對(duì)提高釀造產(chǎn)品的品質(zhì)也有重要意義；另外，提取得到的前體物質(zhì)可以應(yīng)用到生產(chǎn)過程中，提高相應(yīng)香氣物質(zhì)的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提取谷物類原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的結(jié)合態(tài)前體，對(duì)其進(jìn)行處理后檢測香氣物質(zhì)，并將該方法應(yīng)用于釀造食品領(lǐng)域中。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為:A:谷物類原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體的提取:①原料的預(yù)處理:將所研究的原料晾干，于研磨機(jī)中碾碎。②前體物質(zhì)的提取:取10 50g原料于錐形瓶中，加入100 500mL的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨(dú)或按不同比例配比的溶劑浸泡12 36h,超聲0.5 Ih后離心(8000rpm,15min)取上清液，殘?jiān)俅斡?00 500mL的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨(dú)或按不同比例配比的溶劑浸泡12 36h，超聲0.5 Ih后離心(8000rpm，15min)取上清液，合并清液，在30 4011C下減壓蒸懼至干,用100 500mL的磷酸鹽緩沖液(pH4 9)溶解。③除雜:將上述溶液置于分液漏斗中，用20 IOOmL的乙醚、戊烷、二氯甲烷、乙酸乙酯單獨(dú)或按不同比例配比的有機(jī)溶劑反復(fù)萃取2 5次，以去除溶解在水中游離態(tài)香氣物質(zhì)，將最后得到的溶液放在_20°C條件下備用。④純化:將上述溶液20 IOOmL以2 10mL/min的流速通過Sep-Pak C18ECI IOg, 6mL 60mL)固相萃取預(yù)裝柱,然后用2 6倍柱體積的超純水以2 10mL/min沖洗雜質(zhì)，最后用I 3倍柱體積的甲醇(色譜純)以0.5 5mL/min的流速將結(jié)合態(tài)物質(zhì)洗脫并接收，在30 40°C下減壓旋蒸至干后用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解。B:結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的釋放:物化處理:用鹽酸調(diào)節(jié)上述溶液pH為I 3，將IOmL前體物質(zhì)溶液裝入安瓿瓶中密封，沸水浴加熱0.5 5h左右，待其冷卻后打破安瓿瓶，調(diào)節(jié)pH為7。酶處理:在安瓿瓶中加入IOmL前體物質(zhì)溶液，然后加入β _D_葡萄糖苷酶，使得終濃度為5 10U/mL，密封后置于25 35°C條件下震蕩24 48h，反應(yīng)完后加入I 5%的CaCL2抑制酶活。C:香氣物質(zhì)的檢測:采用HS-SPME-GC -MS方法，在15mL頂空瓶中加入8mL澄清溶液，3 5g氯化鈉，加入內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行頂空固相微萃取。頂空固相微萃取的條件為:三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60°C預(yù)熱5 15min,萃取吸附35 55min, GC解吸5 15min。將未知成分的質(zhì)譜與NIST05a.L Datebase中的質(zhì)譜比對(duì),進(jìn)行初步定性,然后通過色譜圖計(jì)算得到保留指數(shù)RI，與相應(yīng)釀造產(chǎn)品(如白酒)中的常規(guī)成分的標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行最后的確定；制作待測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)GC-MS檢測后將待測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出待測物質(zhì)的含量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次或以上，取平均值做最終結(jié)果。本發(fā)明首次將谷物中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)作為研究對(duì)象，豐富了原料香氣物質(zhì)的研究。本發(fā)明所建立的方法簡便有效:既能排除自身游離態(tài)香氣物質(zhì)的影響，又可以有效的提取谷物類原料中的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體并防止其分解；采用的酸解或酶解的方法可以有效的使結(jié)合態(tài)的香氣物質(zhì)釋放出來變成揮發(fā)性物質(zhì)。該發(fā)明的有益效果還有:提取得到的結(jié)合態(tài)物質(zhì)可以用在工業(yè)生產(chǎn)過程，提高相應(yīng)香氣物質(zhì)的含量；本發(fā)明完善了釀造產(chǎn)品風(fēng)味分析體系，用于原料品質(zhì)評(píng)價(jià)以及原料等級(jí)分類，對(duì)提高釀造產(chǎn)品的品質(zhì)有重要意義。


圖1:物化處理玉米中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)氣相色譜2:酶處理小麥中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)氣相色譜圖
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:高粱中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體物質(zhì)的提取以純化
將高粱晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的乙腈/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中，在4°C下8000rpm離心15min，保存上清液，將殘?jiān)俅斡?0mL乙腈/甲醇(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中，在4°C下8000rpm離心15min，將得到上清液與上一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH7)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/ 二氯甲烷(v/v/v:1/1/3)重復(fù)萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質(zhì)。取20mL得到的溶液以5mL/min的流速通過Sep-Pak C18E (lg, 6mL)固相萃取預(yù)裝柱,用20mL的超純水以5mL/min的流速?zèng)_洗雜質(zhì)，然后用IOmL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用20mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH7)溶解。實(shí)施例2:豌豆中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體物質(zhì)的提取及純化將豌豆晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的丙酮/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h,超聲0.5h后,將浸提液裝在50mL離心管中，后在4°C下8000rpm離心15min,保存上清液，將殘?jiān)俅斡?0mL丙酮/乙腈(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中,在4°C下8000rpm離心15min,將得到上清液與前一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/乙酸乙酯(v/v/v:1/1/3)重復(fù)萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質(zhì)。取20mL得到的溶液以5mL/min的流速通過Sep-PakC18E (lg, 6mL)固相萃取預(yù)裝柱,用20mL的超純水以5mL/min的流速?zèng)_洗雜質(zhì)，然后用IOmL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用20mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解。實(shí)施例3:物化處理檢 測玉米中的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)將玉米晾干后粉碎，取IOg于錐形瓶中，加入20mL的乙腈/乙醇(v/v3:7)，常溫下浸泡12h,超聲0.5h后,將浸提液裝在50mL離心管中，后在4°C下8000rpm離心15min,保存上清液，將殘?jiān)俅斡?0mL乙腈/甲醇(v/v3:7)浸泡12h，超聲0.5h后，將浸提液裝在50mL離心管中,在4°C下8000rpm離心15min,將得到上清液與前一步得到的清液合并一起，裝于500mL的旋蒸瓶中，于旋蒸裝置上減壓蒸發(fā)至干，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解，然后將溶液置于250mL分液漏斗中，用20mL的重蒸乙醚/戊烷/ 二氯甲烷(v/v/v:1/1/3)重復(fù)萃取3次，以去除揮發(fā)性的香氣物質(zhì)。將得到的IOOmL溶液以10mL/min的流速通過Sep-Pak C18E (10g,60mL)固相萃取預(yù)裝柱,用200mL的超純水以10mL/min的流速?zèng)_洗雜質(zhì)，然后用60mL的甲醇(色譜純)洗脫，在30°C下減壓旋蒸至干后，用IOOmL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(PH5)溶解。將得到的結(jié)合態(tài)前體物質(zhì)溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH為1，裝入安瓿瓶中密封，沸水浴加熱0.5h，迅速冷卻后打破安瓿瓶，調(diào)節(jié)pH為5，加8mL的澄清液于15mL的頂空瓶中，再加入3g氯化鈉以及內(nèi)標(biāo)，設(shè)定程序通過HS-SPME-GC-MS檢測。頂空固相微萃取的條件為:三相(Car/DVB/PDMS)萃取頭，60°C預(yù)熱5min，萃取吸附30min，GC解吸lOmin。其結(jié)果見表I。表I物化處理玉米中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)

權(quán)利要求
1.一種測定食品釀造谷物類原料結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的方法，其特征在于包括如下步驟:I)首先將谷物磨碎，然后通過有機(jī)溶劑的反復(fù)浸提，旋蒸至干去除有機(jī)相以及揮發(fā)性香氣物質(zhì)；2)用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解，并進(jìn)一步分離揮發(fā)性香氣物質(zhì)后，通過固相微萃取最終得到結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的前體物質(zhì)；3)旋蒸至干后，再次用pH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解，通過物化作用或者酶解作用使結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)釋放；4)然后通過HS-SPME-GC-MS測定香氣物質(zhì)的成分，并進(jìn)行定性定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述原料為高粱、豌豆、大麥、玉米、大米、糯米、香米、小麥、黑麥、蕎麥、黃米、粳米、麩皮。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于有機(jī)溶劑浸提方法為，先用甲醇、乙醇、乙腈、丙酮單獨(dú)或其復(fù)配的溶劑浸泡原料12 36h后，超聲處理0.5 lh，離心后取上清，然后再將殘?jiān)眉状?、乙醇、乙腈、丙酮單?dú)或其復(fù)配的溶劑浸泡浸泡12 36h后，超聲處理0.5 lh，離心后取上清，合并兩次上清液備用。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于旋蒸至干去除有機(jī)相以及揮發(fā)性香氣物具體條件為在常溫和減壓的條件下進(jìn)行的，既可以除去易揮發(fā)的物質(zhì)，又保證了結(jié)合態(tài)物質(zhì)前體不會(huì)分解。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于進(jìn)一步分離揮發(fā)性香氣物質(zhì)采用有機(jī)溶劑乙醚、戊烷、二氯甲烷、乙酸乙酯單獨(dú)或復(fù)配反復(fù)萃取2 5次，以盡可能完全的將揮發(fā)性的香氣物質(zhì)萃取 來，排除揮發(fā)性香氣物質(zhì)的干擾。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于固相微萃取的工藝為將初步得到的結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)前體溶液通過Sep-Pak C18E固相萃取預(yù)裝柱，用2 6倍柱體積的超純水沖洗后，在用I 3倍柱體積的甲醇將結(jié)合態(tài)物質(zhì)洗脫并接收，在30 40°C下減壓旋蒸至干后用PH4 9的磷酸鹽緩沖液溶解。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于固相微萃取參數(shù)為:樣品流速為2 IOmL/min,超純水的流速為2 10mL/min,甲醇的流速為0.5 5mL/min。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于物化方法為:用鹽酸調(diào)節(jié)pH為I 3，密閉處理后在80 100°C下水浴0.5 5h。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶解方法為添加β-D-葡萄糖苷酶，使得終濃度為5 10U/mL，密閉處理后，在25 45°C條件下緩慢振蕩I 5d。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特在于HS-SPME-GC-MS定性定量分析的方法為:通過將未知物質(zhì)的質(zhì)譜與NIST05a.L Datebase中的質(zhì)譜進(jìn)行比較，對(duì)相似度達(dá)70%以上且峰形較好的物質(zhì)進(jìn)行初步的定性，然后通過色譜圖計(jì)算得到初步定性物質(zhì)的保留指數(shù)，與相應(yīng)釀造產(chǎn)品中的常規(guī)成分的標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)行定性。對(duì)已定性的物質(zhì)進(jìn)行定量分析:先配置最大濃度的待測物質(zhì)的混合標(biāo)樣，然后梯度稀釋為12 16個(gè)濃度，取每種濃度的混標(biāo)加到15mL頂空瓶中，加入內(nèi)標(biāo)，再加入氯化鈉飽和處理，進(jìn)行HS-SPME-GC-MS的測定，利用標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比為橫坐標(biāo)、濃度比為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品中物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出待測物質(zhì)的含量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種測定食品釀造谷物類原料中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的方法，將釀造過程中應(yīng)用的高粱、豌豆、大麥、小麥、玉米、大米、糯米等，通過研磨、浸提、旋蒸、溶解、液液萃取除去游離態(tài)香氣物質(zhì)，然后通過固相微萃取最終得到結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的前體物質(zhì)，再次經(jīng)過旋蒸、溶解后通過高溫酸處理或者β-D-葡萄糖苷酶處理使其水解，從而使香氣物質(zhì)得到釋放，最后通過頂空固相微萃取技術(shù)與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)，對(duì)其中香氣物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。本方法中結(jié)合態(tài)前體的提取在常溫下進(jìn)行，既能排除原料自身游離態(tài)香氣物質(zhì)的影響，又能避免結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的損失，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的準(zhǔn)確測定。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103235058SQ20131015596
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者徐巖, 吳群, 朱偉岸 申請人:江南大學(xué)